Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной клинической диагностике наряду с традиционными микробиологическими и иммунологическими методами широко применяются подходы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несмотря на неоспоримые преимущества ПЦР-диагностики (высокая чувствительность, возможность определения некультивируемых видов бактерий, например, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и ряда вирусов, таких как ВИЧ и возбудители вирусных гепатитов) серьезной проблемой является выбор конкретных методов подготовки анализируемых образцов, содержащих нуклеиновые кислоты (НК), к ПЦР-анализу. Поэтому особенно важной для дальнейшего развития биомедицинского направления биотехнологии является разработка новых материалов и эффективных методов выделения и очистки НК из различных источников. Разрабатываемые методы должны не только обеспечивать сохранение функциональной активности НК, в т. ч. при хранении, но, по возможности, должны быть быстрыми и легко автоматизируемыми.
Реализация сочетания твердофазной экстракции НК в присутствии хаотропных солей и картриджного варианта хроматографии в едином конструкционном элементе [Boom R, et al. (1990) J. Clin. Microbiol. 28(3):495] легла в основу большинства общедоступных наборов для выделения НК. Общий принцип работы предлагаемых систем выделения заключается в сорбции НК сорбентом, за которой следуют отмывка от примесей и элюция очищенной НК, при этом сами наборы различаются лишь природой используемого сорбента. Соответствующие протоколы выделения позволяют получать высокоочищенные препараты ДНК из различных источников, однако эти протоколы, в виду многостадийности, трудоемки и длительны, что отрицательно сказывается на производительности при обработке большого количества биоматериала (например, в практике клинических лабораторий или в рамках проведения масштабных исследовательских работ).
Альтернативный подход, разработанный под руководством проф. В.П.Зубова в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН, основан на одностадийном выделении и очистке НК: НК-содержащую смесь пропускают через слой специального сорбента, при этом выделяемая (и одновременно очищаемая) НК проходит через слой сорбента, не удерживаясь на его поверхности, в то время как примеси, присутствующие в смеси, эффективно сорбируются. Основные преимущества такого варианта выделения заключаются в скорости процесса (1.5 - 3 мин) и использовании небольшого количества сорбента (100 - 300 мг), достаточного для получения высокоочищенного препарата НК. Реализация одностадийной процедуры
выделения НК достигается при использовании специальных композиционных
полимерсодержащих сорбентов, сочетающих в одном материале уникальные
сорбционные свойства привитой полимерной фазы с механической прочностью
и контролируемой пористостью исходного носителя, например, кремнезема. В
качестве полимерных модификаторов, используемых при получении
композиционных сорбентов для одностадийного выделения НК, применяют
фторполимеры и полианилины (ПАНИ) [Zubov V.P. et al. (2007) Polymer
Science, Ser. A. 49 (12): 1247]. Однако описаные методы модификации твердых
носителей нанослоями фтор- и ПАНИ-содержащих полимеров либо требуют
сложного аппаратурного оформления (как в случае синтеза
политетрафторэтиленсодержащих сорбентов методом радиационной пост
полимеризации), либо сопровождаются многостадийной процедурой отмывки
полученного материала (при синтезе ПАНИ-содержащих сорбентов методом
окислительной осадительной полимеризации в присутствии
немодифицированного кремнезема), что ограничивает широкое применение таких материалов.
При разработке более технологичных методов синтеза фторполимер- и
ПАНИ-модифицированных сорбентов большое значение имеет способ
предварительной активации поверхности носителя, обеспечивающий
локализацию процесса формирования равномерно распределенного
полимерного покрытия на поверхности сорбента. В конечном счете,
правильный выбор способа активации поверхности носителя с учетом физико-
химических свойств полимерного модификатора определяет
воспроизводимость сорбционных свойств получаемых сорбентов и высокую
селективность при одностадийном выделении НК.
Использование как фторполимеров, так и ПАНИ в качестве модификаторов поверхности сорбентов обеспечивает возможность выделения НК из сложных биологических смесей в одну стадию, однако особый интерес представляет материал, последовательно модифицированный нанослоями фторполимера и полианилина (ФП-ПАНИ-сорбент), т.к. каждый из этих полимерных модификаторов привносит дополнительные особенности в процесс выделения НК. Фторполимерсодержащие сорбенты отличаются исключительной химической стойкостью, низким уровнем необратимой сорбции ДНК и, как правило, обеспечивают наиболее высокий выход ДНК. В свою очередь, ПАНИ-содержащие сорбенты демонстрируют превосходную смачиваемость, высокую поверхностную емкость, и с успехом применяются для выделения ДНК из «сложных» биологических смесей (кровь, лизаты растительной ткани и т.д). Таким образом, можно ожидать, что новый сорбент, одновременно модифицированный нанослоями ФП и ПАНИ, будет проявлять
комплекс свойств, присущих обоим полимерным модификаторам, что позволит расширить область его применения.
Цель настоящей работы заключалась в разработке новых технологичных полимеризационных методов получения фторполимер- и ПАНИ-модифицированных кремнеземов, основанных на принципе активации поверхности носителя; исследовании физико-химических и сорбционных свойств полученных материалов; в разработке эффективных протоколов одностадийного выделения ДНК с помощью полученных сорбентов из различных биологических смесей, в том числе из лизатов растительной ткани и клинических образцов биоматериала.
Для достижения сформулированной цели предстояло решить следующие задачи:
1 - разработать новый технологичный способ получения
фторполимерсодержащих сорбентов, различающихся полярностью поверхности, основанный на полимеризации тетрафторэтилена на поверхности кремнезема;
2 - разработать новый способ получения ПАНИ-содержащего сорбента,
обеспечивающий локализацию процесса полимеризации анилина и образующегося ПАНИ на поверхности носителя;
3 - исследовать морфологию и сорбционные свойства полученных
материалов;
4 - продемонстрировать эффективность применения новых разработанных
фторполимерсодержащих сорбентов при разделении НК в зависимости от их вторичной структуры и молекулярной массы;
5 - разработать протоколы одностадийного выделения ДНК из различных
биологических смесей с применением разработанного ФП-ПАНИ-сорбента;
6 - продемонстрировать возможность применения разработанного ФП-
ПАНИ-сорбента в протоколах пробоподготовки при проведении ПЦР-
диагностики различных заболеваний и сравнить эффективность
использования предложенных одностадийных протоколов выделения ДНК
из клинических образцов биоматериала с коммерческими методиками
пробоподготовки.
Научная новизна. Впервые методом полимеризации тетрафторэтилена на поверхности пористого кремнезема, предварительно обработанного озоном, синтезированы фторполимерсодержащие композиционные сорбенты. Показано, что с помощью разработанного метода в состав политетрафторэтилена (ПТФЭ) можно вводить мономерные звенья с различными функциональными группами и получать ПТФЭ-содержащие сорбенты с различной полярностью поверхности, которые позволяют разделять НК в зависимости от их вторичной
структуры и молекулярной массы. Продемонстрирована эффективность применения полученных ПТФЭ-содержащих сорбентов при выделении ДНК из сложных биологических смесей в одну стадию.
Впервые синтезирован ПАНИ-содержащий сорбент (ФП-ПАНИ-сорбент) методом «матричной полимеризации» анилина на поверхности кремнезема, модифицированного фторопластом. Показано, что в разработанном методе фторполимерная фаза выступает в качестве матрицы для формирования ПАНИ-покрытия.
Исследование сорбционных свойств нового синтезированного ФП-ПАНИ-сорбента показало высокую эффективность применения этого материала для очистки ПЦР-продуктов от компонентов мастер-смеси, а также на этапе пробоподготовки в ПЦР-диагностике патогенов человека. На примере выявления ДНК микобактерий туберкулеза впервые показано, что при реализации разработанного одностадийного протокола выделения и очистки ДНК достигается более высокая чувствительность ПЦР-детекции возбудителя заболевания по сравнению с многостадийной методикой выделения, основанной на сорбции и десорбции НК.
Практическая значимость. Разработанные сорбенты могут с успехом применяться как в научных исследованиях, так и в лабораторном анализе для быстрого и качественного выделения ДНК из бактерий, грибов, вирусов, растительной ткани; при разделении одно- и двунитевых НК, а также при очистке ПЦР-продуктов.
Разработанные методики одностадийного выделения и очистки ДНК с помощью синтезированного ФП-ПАНИ сорбента обеспечивают выделение очищенной ДНК из различных образцов биоматериала, в частности, для ПЦР-детекции фитопатогенов, а также для клинической ПЦР-диагностики возбудителей ряда инфекций человека. Предложенные методики значительно упрощают пробоподготовку за счет уменьшения количества операций и позволяют снизить себестоимость и время проведения анализа.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях: XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г), XX Зимняя международная научная школа, (Москва, 2008 г.), III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008 г.), 2nd NACBO International Nanobiotechnology Conference (Rome, Italy, 2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2009 г.), V Всероссийская Каргинская Конференция «Полимеры - 2010» (Москва, 2010 г.), Международный конкурс
научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, Международный форум по нанотехнологиям (Москва 2010 г.), Second International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials (Strasbourg, France, 2011 г ).
Связь работы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (Государственный контракт № 9411.1003702.13.031 "Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба"), а также грантов 6-ой рамочной Программы Европейского Союза (FP6): проект NACBO («Новые и усовершенствованные наноматериалы, химические методы и оборудование для нанобиотехнологии», NMP4-CT-2004-500804), проект DIAGNOSIS («Разработка новых и рентабельных методов неинвазивной диагностики патогенных микроорганизмов человека», LSHB-CT-2006-037212).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, и 1 глава в монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 121 наименования. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 19 таблиц.
Похожие диссертации на Синтез полимерсодержащих сорбентов и их использование для одностадийного выделения ДНК
