Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
I. Системы рестрикции-модификации 7
1.1. Классификация систем рестрикции-модификации прокариот 8
1.1.1. Системы рестрикции-модификации типа 1 9
1.1.2. Система рестрикции-модификации типа III 11
1.1.3. Система рестрикции-модификации типа II 13
1.1.3.1. Ортодоксальный, НЕ и IIF подтипы 15
1.1.3.2. РМ системы подтипа IIS 16
1.1.3.3. РМ системы подтипа IIG 17
1.1.3.4. РМ системы подтипа ПТ 18
1.1.3.5. РМ системы подтипа НВ 19
1.1.3.6. РМ системы подтипа ИМ 20
1.2. Структура эндонуклеаз рестрикции 20
1.3. Механизм гидролиза эндонуклеазами рестрикции фосфодиэфирных связей 23
1.4. Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу контроля расщепления ДНК по двум цепям 24
II. ДНК-метилтрансферазы систем рестрикции-модификации типа II 27
II.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз 27
II.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз 30
II.3. Биологическая роль систем рестрикции-модификации 33
III. Экспериментальная часть 37
III.1. Материалы 37
III.2. Оборудование 42
III.3. Методы 43
III.3.1. Электрофорезы 43
III.3.2. Реакции, использованные в работе 45
III.3.3. Секвенирование ДНК 48
III.3.4. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК
эндонуклеазой рестрикции 49
III.3.5. Приготовление электрокомпетентных клеток 50
III.3.6. Электротрансформация клеток E.coli 51
III.3.7. Щелочное выделение плазмид (мини-преп) 51
III.3.8. Очистка ДНК 52
III.3.9. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп) 53
III.3.10. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (макси-преп).. 53
III.3.11. Выделение одноцепочечной формы ДНК фага на основе М13 54
III.3.12. Метод кислотной депуринизации 54
III.3.13. Метод тонкослойной хроматографии нуклеиновых оснований 55
III.3.14. Локализация метилцитозина бисульфитным методом (реакция конверсии)... 56
III.3.15. Скрининг штаммов на наличие в них эндонуклеаз рестрикции 56
III.3.16. Получение и очистка лизата клеток для колоночной хроматографии 57
III.3.17. Выделение эндонуклеазы NspLK 58
III.3.18. Выделение эндонуклеазы BspZEl 59
III.3.19. Выделение эндонуклеазы BspLU4 60
III.3.20. Выделение метилаз ВсоША и ВсоКІВ 60
III.3.21. Определение активности эндонуклеаз рестрикции во фракциях 61
III.3.22. Определение функциональной чистоты эндонуклеазы 62
III.3.23. Метод гель-хроматографии 62
III.3.24. Анализ фракций на наличие метилазной активности 62
IV. Результаты и их обсуждение 64
IV. 1. Принцип детектирования эндонуклеаз рестрикции 64
IV.2. Эндонуклеаза рестрикции BspZEl 65
IV.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspZEl 65
IV.2.2. Оптимальные условия работы фермента 68
IV.2.3. Определение активности эндонуклеазы рестрикции BspZEl 68
IV.2.4. Функциональная чистота препарата фермента BspZEl 69
IV.2.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspZEl 71
IV.2.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspZEl 72
IV.2.7. Влияние метилирования dam на расщепление узнаваемого сайта 74
IV.2.8. Сравнение B.species ZE с другими штаммами, содержащими эндонуклеазы- изошизомеры С1а\ 76
IV.3. Эндонуклеаза рестрикции NspLKl 77
IV.3.1. Выделение эндонуклеазы NspLKl 77
IV.3.2. Оптимальные условия работы выделенной эндонуклеазы 78
IV.3.3. Функциональная чистота препарата фермента NspLKl 79
IV.3.4. Определение сайтов узнавания NspLKl 80
IV.3.5. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой NspLKl 81
IV.4. Эндонуклеаза рестрикции ifcpLU41 82
IV.4.1. Определение зависимости содержания эндонуклеазы от фазы роста клеток... 82
IV.4.2. Выделение эндонуклеазы BspL\J4l 83
IV.4.3. Оптимальные условия работы эндонуклеазы BspLU4l 85
IV.4.4. Функциональная чистота препарата BspLU4l 85
IV.4.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspL\J4l 86
IV.4.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspLU4l 87
IV.4.7. Очистка ДНК от эндонуклеазы BspLU4l 88
IV.4.8. Определение молекулярной массы BspL\J4l 88
IV.4.9. Получение «лестниц» молекулярных длин фрагментов ДНК 89
IV.5. Метилазы системы рестрикции-модификации из штамма Bacillus coagulans К 92
IV.5.1. Выделение ДНК-метилтрансфераз 93
IV.5.2. Определение специфичности ДНК-метилтрансфераз 96
IV.5.3. Определение природы основания, метилируемого M.BcoKIA, методом тонкослойной хроматографии 97
IV.5.4. Определение положения метилируемого цитозина 99
IV.5.5. Получение ДНК рекомбинантного фага Ml3tglЗО(ВсоК) 99
IV.5.6. Определение положения в сайте BcoKl метилируемого аденина 102
V. Заключение 109
Выводы 111
Список публикаций по материалам диссертационной работы 112
Цитированная литература 113
- Система рестрикции-модификации типа III
- Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу контроля расщепления ДНК по двум цепям
- Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspZEl
- Получение «лестниц» молекулярных длин фрагментов ДНК
Введение к работе
В бактериальных клетках защиту от чужеродной ДНК обеспечивают так называемые системы рестрикции-модификации (РМ), которые состоят из комплекса двух ферментов - ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции. Метилтрансферазы и эндонуклеазы узнают в ДНК короткую (4-8 п.о.) специфическую последовательность (сайт). Эндонуклеазы расщепляют ДНК в фиксированных точках внутри или вблизи сайта, если сайт не метилирован парной ей метилазой. Метилтрансферазы метилируют (модифицируют) по одному основанию - А или С - в каждой цепи сайта и тем самым защищают ДНК клетки от гидролиза соответствующей эндонуклеазой. При введении в клетку немодифицированной ДНК, например, ДНК фага, сайт-специфические эндонуклеазы при наличии в этой ДНК своих сайтов узнавания гидролизует ее. Следовательно, систему РМ можно рассматривать как примитивную «иммунную» систему прокариот. Эндонуклеазы рестрикции в свое время легли в основу техники рекомбинантных ДНК, и в настоящее время они остаются незаменимыми и самыми востребованными ферментами в современной биохимии и молекулярной биологии. Несмотря на уже имеющиеся более чем 3600 продуцентов эндонуклеаз рестрикции и 600 ДНК-метилтрансфераз, продолжается интенсивный поиск новых продуцентов. Это обусловлено тем обстоятельством, что обнаружение эндонуклеаз с новыми специфичностями расширяет возможности манипулирования ДНК (конструирования рекомбинантных ДНК, картирование геномов, секвенирование, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, амплификация ДНК с вытеснением цепи и др.); обнаружение ферментов с новой специфичностью иногда приводит к появлению новых технологий. Кроме того, новые штаммы-продуценты нередко производят эндонуклеазу либо в большом количестве, либо достаточно стабильную, в результате чего она имеет преимущество для практического использования. ДНК-метилтрансферазы используются для получения больших фрагментов геномных ДНК, определения уровня метилированных
цитозинов в ДНК эукариот, изучения структуры хроматина. Именно на метилтрансферазе системы РМ (M.Hhal) был впервые обнаружен феномен «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК в процессе катализа. Учитывая роль метилирования ДНК как эпигенетического уровня наследственности, интерес к метилтрансферазам РМ систем возрастает.
Еще один аспект, привлекающий внимание к ферментам системы РМ это то, что сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы представляют собой идеальные объекты для изучения специфического ДНК-белкового взаимодействия, благодаря необыкновенно высокой точности как узнавания строго определенной последовательности, так и разрезания ДНК или ее метилирования.
Таким образом, задача поиска новых продуцентов метилаз и рестриктаз остается актуальной. Особенно перспективен поиск штаммов-продуцентов этих ферментов среди термофильных микроорганизмов, так как белки из термофильных микроорганизмов более стабильны при хранении и более устойчивы к различным воздействиям, денатурирующих белок, чем их аналоги из мезофильных микроорганизмов. Кроме того, поиск термофильных штаммов продиктован еще и тем, что в последние годы возрастает интерес к ферментам, работающими в сочетании с термофильными ДНК-полимеразами.
Целью исследования было выделение и изучение эндонуклеаз рестрикции из термофильных бактерий Bacillus species LU4, Bacillus species ZE и Nocardia species LK, a также выделение и изучение ДНК-метилтрансфераз из термофильного штамма Bacillus coagulans К.
Для достижения поставленной цели были поставлены и выполнены следующие задачи:
1. Поиск и скринирование термофильных штаммов на наличие эндонуклеаз рестрикции.
2. Выделение и характеристика эндонуклеаз из штаммов-продуцентов эндонуклеаз
рестрикции.
»
3. Вьщеление ДНК-метилтрансфераз из Bacillus coagulans К и определение
специфичности этих метилаз.
4. Определение оснований, модифицируемых метилазами в узнаваемом сайте.
Система рестрикции-модификации типа III
В данном разделе обзора литературы мы перейдем сразу к рассмотрению систем РМ типа III, так как они, наряду с различиями, имеют много сходных свойств с системами типа I. Первоначально системы типа I и III входили в общую группу АТФ-зависимых эндонуклеаз. В системах типа III, как и в системах типа I, эндонуклеазная и метилтрансферазная активности входят в сложный белковый комплекс с молекулярной массой 150-200 кДа. Этот комплекс образован двумя типами субъединиц - Mod и Res. Субъединица М ответственна и за узнавание сайта и его метилирование. Изолированная субъединица М действует как метилаза и метилируемым основанием является аденин. Рестрикционной активностью обладает только комплекс M2R2. Донор метильной группы AdoMet требуется не только для метилирования, но и для эффективного расщепления ДНК. Комплекс узнает несимметричную последовательность (например, Есо?15\ -CAGCAG) и для расщепления ДНК, как и в случае систем типа I, требуется Mg2+ и АТФ, а также взаимодействие комплексов, связанных с двумя сайтами. Однако в отличие от систем типа I, расщепление ДНК происходит вблизи от одного из сайтов на фиксированном расстоянии от сайта. Так, соР151 расщепляет ДНК на расстоянии 25 нуклеотидов от сайта по верхней цепи, и 27 - по нижней цепи (Hadi et al, 1979).
Представители систем соР151 и ЕсоРП - самые изученные из всех систем типа III, которые являются близкородственными (Humbelin et al, 1988). Мы остановимся на некоторых свойствах этих систем, хотя не очевидно, что все они присущи и другим системам типа III. Две удивительные особенности соР151 привлекли к ней в свое время внимание. Во-первых, она метилирует только одну цепь ДНК, и, следовательно, в процессе репликации ДНК появляются полностью неметилированные сайты, которые должны подвергнуться расщеплению. Во-вторых, было непонятно, почему Есо?\5\ расщепляет ДНК фага ТЗ, тогда как ДНК фага Т7, содержащую сайты соР151, не расщепляет. Причиной разного действия соР151 оказалось то, что в Т7 все сайты имеют одинаковую ориентацию, тогда как в ТЗ встречаются сайты с разной ориентацией. Отсюда следовало, что расщепление ДНК происходит только при наличии сайтов с разной ориентацией (Meisel et al, 1992, Kruger et al, 1995).
Детальное изучение системы coP15I подтвердило необходимость двух инвертированных сайтов для эффективного расщепления ДНК. Необходимость в двух сайтах подразумевает, что комплексы, связанные с разными сайтами, должны придти в контакт друг с другом, хотя экспериментально это пока не продемонстрировано. Экспериментально установлено, что расстояние между сайтами может быть от 0 до 3,5 т.п.о. Возможность расщепления ДНК при расстоянии между сайтами 3,5 т.п.о. подразумевает транслокацию ДНК, сопровождаемую гидролизом АТФ. Однако расщепление ДНК происходит только в присутствии АТФ и сопровождается ее гидролизом даже тогда, когда сайты находятся рядом, и, следовательно, транслокация ДНК отсутствует. Участие АТФ непосредственно в расщеплении ДНК подтверждается данными об изменении конформации комплекса в присутствии негидролизуемого аналога АТФ (Meisel et al, 1995, Saha et al, 1995). He исключено, что и в системах типа I АТФ играет ту же роль.
Системы типа III — самое малочисленное семейство. Биохимически выявлено всего 8 систем типа III (Pingoud et al, 2001). Однако анализ расшифрованного генома одного из штаммов Helicobacter pylori выявил в нем четыре РМ системы типа III (Tomb et al, 1997), по две системы содержат геномы двух других штаммов этого микроорганизма (Pallen, 1999). Системы типа III выявлены также в геномах штаммов Neisseria miningitidis (Pallen, 1999). Следует особо отметить, что экспрессия одного из генов H.pylori, кодирующего эндонуклеазу, индуцируется, когда микроорганизм атакует слизистую оболочку кишечника (цитируется по Saha et.al., 1998).
Подавляющее большинство известных в настоящее время РМ систем относится к типу II. Преобладание известных систем типа II над другими системами могло быть обусловлено тем, что, во-первых, их присутствие в клетках легко регистрируется in vitro, и, во-вторых, тем, что именно они являются предметом поиска исследователей, так эндонуклеазы рестрикции этого типа до сих пор остаются самыми распространенными ферментами, используемыми в молекулярной биологии. Однако анализ секвенированных геномов микроорганизмов свидетельствует в пользу того, что и в природе этот тип систем преобладает над другими: так в геноме Н. pylori J99 из 23 предполагаемых РМ систем 16 относятся к типу II (Tomb et al, 1997).
Первоначально характерными признаками систем типа II считалось то, что их эндонуклеазная и метилазная активности локализованы на различных белках, каждый из которых представлен одной полипептидной цепью. Эндонуклеаза и метилаза действуют независимо друг от друга, узнают палиндромный сайт и в качестве кофактора эндонуклеазе требуются только ионов Mg +, а для метилазной активности - только AdoMet. Эндонуклеаза расщепляет ДНК внутри сайта или вблизи него, благодаря чему образуются дискретные фрагменты, легко регистрируемые электрофорезом. Этот тип эндонуклеаз отнесен в настоящее время к подтипу «ортодоксальных» эндонуклеаз (см. ниже).
Однако впоследствии были обнаружены системы, обладающие всеми вышеперечисленными свойствами, но узнающие несимметричный сайт. По мере обнаружения новых систем и накопления информации об организации и взаимодействии ферментов этого типа с ДНК выяснилось, что они различаются между собой. Это привело к разделению систем типа II на подтипы, число которых постоянно растет, и их номенклатура не успевает стать общепринятой. В таблице 1 приведена классификация эндонуклеаз систем рестрикции-модификации типа II на 8 подтипов, предложенная Робертсом: ортодоксальный (IIP), НЕ, IIF, IIS, IIG, НТ, ИВ, ИМ (Roberts et al, 2000). Однако уже в 2003 г. список подтипов был расширен, и в конце этого раздела мы рассмотрим эти новые подтипы. Таблица 1. Классификация систем рестрикции-модификации типа II
Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу контроля расщепления ДНК по двум цепям
Расщепление по двум цепям при узнавании в хозяйской ДНК неканонического сайта, а, следовательно, неметилированного парной метилазой, гибельно для клетки. Контроль над точностью узнавания именно канонического сайта и, следовательно, только в чужеродной неметилированной ДНК обеспечивается димеризацией, которая предшествует расщеплению ДНК по двум цепям. В результате димеризации возникают дополнительные контакты, только после образования которых, по-видимому, активизируется каталитический центр. В системах РМ типа I и III димеризуются белковые комплексы, связанные с разными сайтами. Известные эндонуклеазы типа II по способу димеризации можно разделить на несколько групп. В первую группу входят ЭР ортодоксального типа, которые узнают симметричную последовательность и функционируют в форме гомодимера. Согласно биохимическим и рентгеноструктурным данным каждый из мономеров содержит один каталитический центр, и каждый из мономеров расщепляет «свою» цепь. Анализ пространственных структур комплексов ДНК с ЭР ортодоксального типа показывает, что в гомодимере мономеры образуют между собой многочисленные контакты (Pingoud et al, 2001). На EcoRW и Pvull показано, что в результате замены в одном из мономеров аминокислотного остатка, участвующего в контакте с основанием сайта, не происходит расщепления ДНК ни по одной из цепей (Stahl et al, 2000, Simoncsits et al, 2001).
Ко второй группе следует отнести эндонуклеазы, которые узнают несимметричную последовательность, содержат, согласно биохимический данным, один каталитический центр и которым для расщепления ДНК по двум цепям необходимо взаимодействие двух молекул, связанных с двумя копиями сайта. Наиболее изученной такой эндонуклеазой является Fokl, единственная из эндонуклеаз этого типа, для которой определена пространственная структура. Для Fokl показано, что расщеплению ДНК предшествует димеризация двух молекул, связанных с разными копиями сайта (Bitinaite et al, 1998, Vanamee et al, 2001), при этом расщепление ДНК по двум цепям происходит сначала около одного сайта, а затем около другого. Показано также, что при димеризации взаимодействуют между собой каталитические домены, и при этом должны происходить огромные конформационные изменения, так как в пространственной структуре Fokl+ДНК каталитический домен находится далеко от места расщепления ДНК (рис. 3).
К третьей группе следует отнести эндонуклеазы, которые также узнают несимметричный сайт, но используют другую стратегию для точного узнавания сайта. Это — гетеродимерные эндонуклеазы, состоящие из двух субъединиц с близкими молекулярными массами. Каждая из субъединиц узнает последовательность «своей» цепи сайта, и каждая содержит по одному активному центру. Для расщепления ДНК обязательно взаимодействие обеих субъединиц; инактивация каталитического центра одной из субъединиц приводит к расщеплению только одной цепи (той, которая узнается субъединицей с ненарушенным активным центром) (Bellamy et al, 2005).
К четвертой группе следует отнести эндонуклеазы, содержащие два активных центра в мономерной молекуле. Этот тип эндонуклеаз выявлен совсем недавно, однако количество их быстро возрастает (Zhu et al, 2004, Armalyte et al, 2005). Эти эндонуклеазы взаимодействуют с ДНК в виде мономера, а димеризацию имитирует взаимодействие разных каталитических, по-видимому, доменов одной и той же молекулы. Подобно гетеродимерным эндонуклеазам, инактивация одного из каталитических центров приводит к расщеплению ДНК только по одной цепи.
И, наконец, следует отметить еще один тип эндонуклеаз. Он представлен пока одной эндонуклеазой BspD6l (Юнусова и др., 2006). Эта эндонуклеаза подобно гетеродимерным эндонуклеазам также состоит из двух субъединиц, однако в отличие от них одна из субъединиц (большая) в отсутствие другой субъединицы способна расщеплять одну из цепей ДНК. Вторая, малая, субъединица только в присутствие большой субъединицы расщепляет вторую цепь ДНК. Предполагается, что малая субъединица представляет собой каталитический домен большой субъединицы. Димеризацию в этом типе эндонуклеаз имитирует взаимодействие опять-таки двух каталитических доменов. Несмотря на то, что пока описана только одна эндонуклеаза этого типа, ожидается, что число их, несомненно, будет увеличиваться. Дело в том, что малая субъединица «теряется» в процессе выделения, оставшуюся большую субъединицу практически невозможно зарегистрировать, так как при расщеплении ДНК по одной цепи не образуется гомогенных фрагментов ДНК. Ожидается, что более внимательное отношение к эндонуклеазам, которые «теряются» в процессе выделения, расширит список и этого, нового типа гетеродимерных эндонуклеаз.
Также единственным пока примером является эндонуклеаза рестрикции В/Л. Она уникальна в двух отношениях. Во-первых, она активна в присутствии ЭДТА, т.е. ей не требуется в качестве кофактора Me . Во-вторых, взаимодействует с одним сайтом в форме димера, но на димер приходится только один каталитический центр, поэтому предполагается, что димер расщепляет сначала одну цепь, а затем происходит его переориентация и расщепление второй цепи (Sasnauskas et al, 2003). Пока нет никаких данных о том, каким образом в этом случае обеспечивается точное узнавание сайта. II. ДНК-метилтрансфсразы систем рестрикции-модификации типа II II.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз
Вторым компонентом систем РМ являются сайт-специфические ДНК-метилтрансферазы. Метилазы узнают на ДНК тот же сайт, что и парные эндонуклеазы, и метилируют по одному основанию (аденин или цитозин) в каждой цепи сайта. Универсальным донором метильной группы является 8-аденозил-Ь-метионин (AdoMet), синтезируемый в клетке. Метилазы катализируют перенос метильной группы с AdoMet на экзоциклическую аминогруппу аденина (N6) или цитозина (N4), либо на атом углерода (C5) цитозипового кольца (рис. 6). В зависимости от этого различают 1Ч6-аденин специфичные (N6mA), N4 (N4mC) и С5 (5тС)-цитозин специфичные метилазы. Большинство метилаз обладает только одной специфичностью, хотя известны метилазы, обладающие разными специфичностями (Bitinaite, 1992). Процесс метилирования происходит в несколько этапов: образование комплекса метилазы с ДНК, связывание с AdoMet, перенос метильной группы на одно из оснований и распад комплекса, в результате чего AdoMet превращается в AdoHcy (Verdine, 1994).
Системы РМ типа 11, которые узнают палиндромный сайт, содержат, как правило, одну метилазу, которая метилирует обе цепи сайта. Метилазы представляют собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 30-60 кДа. Редким пока исключением являются метилазы ЕсоНК.311 и Aqul, которые состоят из большой и малой субъединиц. В обоих случаях метилазная активность проявляется только комплексом субъединиц (Karreman et al, 1990, Lee et al, 1995).
Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspZEl
Сайт, узнаваемый эндонуклеазой BspZEI, содержит три нуклеотида - GAT, которые входят в сайт GATC. Известно, что этот сайт является мишенью для метилазы dam, которая метилирует в нем аденины. Метилаза dam, которая присутствует в ряде штаммов E.coli, относится к непарным метилазам, т.к. в клетке отсутствует парная ей эндонуклеаза рестрикции. Для эндонуклеазы Clal было показано, что расщепление ею сайтов ATCGAT, перекрывающихся с сайтом GATC, ингибируется при метилировании dam (McClelland et al). Для выявления влияния метилирования dam на расщепление сайта эндонуклеазой BspZEI использовали ДНК фагов X dam+ и X dam, выращенных на штаммах E.coli dam+ и E.coli dam соответственно. ДНК фага X. имеет 15 сайтов ATCGAT (табл. 2). Из них три перекрываются с последовательностью GATC (отмечены звездочкой). Данные по расщеплению ДНК фага X dam+ и X dam эндонуклеазами С7сЛ и BspZEI приведены на рисунке 14 (см. выше). На электрофореграмме видны фрагменты от А до L. Верхняя полоса образована фрагментами А и В с близкими длинами. Кроме того присутствует полоса (вторая сверху), возникшая за счет слипания фрагментов D и G по концам cos с образованием фрагмента длиной 6262 п.о. Если BspZEl не расщепляет сайты, отмеченные звездочкой, то должны исчезнуть фрагменты J, L и N и появиться фрагмент с длиной, равной сумме длин этих фрагментов, 3295 п.о. Действительно, такой фрагмент неполного гидролиза появляется ниже фрагмента Е (отмечен стрелкой слева) как в случае BspZEl, так и в случае Clal (дорожки 1, 4, 7, 9) независимо от времени инкубации: 1 ч (дорожки 1, 4) или 16 ч (дорожки 7, 9). Однако, интенсивность соответствующей полосы не находится в стехиометрическом соотношении с интенсивностями других полос. Она заметно слабее полосы Е, кроме того, фрагмент J при расщеплении ДНК X dam не исчезает полностью. Поскольку при увеличении времени инкубации с 1 до 16 ч картина не меняется, следует заключить, что расщепление не всех сайтов ATCGAT, перекрывающихся с сайтами GATC, обусловлено не тем, что эндонуклеазы BspZEl и Clal могут с пониженной вероятностью расщеплять метилированные сайты, а тем, что метилаза dam не успевает полностью, как это уже отмечалось (Pukkila et al, 1983), метилировать ДНК фага X. Таким образом, BspZEl, как и ее прототип Clal, чувствительна к Jam-метилированию узнаваемого сайта.
В таблице 3 приведены данные по суммарной активности BspZEl после каждой стадии очистки. Из таблицы видно, что конечный выход фермента после всех стадий очистки составил примерно 20% от имеющегося в экстракте и составил 45000 ед. из 1 г сырой биомассы. Таблица В настоящее время известны порядка 100 прототипов Clal, однако данные о выходе нам удалось найти только для трех из них. Выход прототипа Clal из штамма Caryophanon latum L составил 400 ед. на 1 г сырой биомассы (Mayer et al, 1981), т.е. в 100 раз меньше, чем BspZEl; эндонуклеазы Bcml из Bacillus species - 12000 (Цветкова и др., 1987) и BspXl из Bacillus sphaericus X - 42000 (Zieger et al, 1987).
Отличительной особенностью эндонуклеазы BspZEl является то, что она проявляет активность и при температуре 65С. С одной стороны, это является ее недостатком, т.к. ее нельзя ингибировать прогреванием. Однако, как отмечалось в обзоре литературы, в настоящее время возрастает количество задач, в которых востребованы термостабильные ферменты. В частности, BspZEl может быть с успехом использована в сочетании с ДНК-полимеразой Bst, работающей при 60С.
Полученный препарат исключительно стабилен: хранение при комнатной температуре в течение месяца приводило к снижению активности фермента менее чем в 1,5 раза. Для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Я, при 16-часовой инкубации достаточно 0,2 ед. BspZEl.
Общая схема выделения эндонуклеазы NspLKl представлена на рис. 16. В качестве первой колонки использовали колонку с фосфоцеллюлозой Р11. Фермент хорошо связывается с фосфоцеллюлозой, о чем свидетельствует отсутствие эндонуклеазной активности в объеме посадки и промывки, и элюируется при 0,35-0,5 М NaCl. Фракции 17-23, проявляющие эндонуклеазную активность (рис. 17), объединяли и наносили на колонку с оксиапатитом НТР. На рис. 17 представлен анализ активности фермента во фракциях градиента. Эндонуклеазная активность проявляется во фракциях 14-19, что соответствует 0,32-0,46 М калий-фосфатного буфера. Фракции 14-19 объединяли и наносили на колонку с гепарин-сефарозой. Активность проявляется во фракциях 13-16, что соответствует 0,46-0,61 М NaCl. Эти фракции объединяли, добавляли альбумин и переводили в буфер для хранения.
Получение «лестниц» молекулярных длин фрагментов ДНК
Дуплекс содержит сайт узнавания ВсоКІ и сайты для эндонуклеаз рестрикции типа IIS Bbvll, BspKTSl, SspD5l и В1П361 (кассета эндонуклеаз рестрикции типа IIS). Bbvll узнает последовательность GAAGAC и расщепляет ее после второго основания по верхней цепи и после шестого - по нижней (2/6). BspKTSl, изошизомер EcoSll, узнает CTGAAG (16/14), SspDSl, неошизомер Hphl, узнает последовательность GGTGA (8/8), и В1П361, изошизомер Bsal, узнает GGTCTC (1/5). Из рисунка видно, что в результате независимого расщепления дуплекса этими эндонуклеазами можно определить как метилируемый аденин, так и цитозин. Для определения положения метилированных оснований (и аденин и цитозин) достаточно использовать три эндонуклеазы типа IIS. Рекомбинантная M13tgl31(BcoK) была использована для наработки фрагмента длиной 410 п.о. с помощью ПЦР с применением олигонуклеотидов NM1 и NM2. При расщеплении этого фрагмента внутри сайта BcoKl он распадается на два фрагмента -примерно 280 и 130 п.о.
Хотя точки расщепления эндонуклеаз рестрикции типа IIS, сайты которых содержатся в дуплексе, известны (на этом и было основано конструирование дуплекса), однако известно также, что некоторые эндопуклеазы типа IIS могут разрезать ДНК на разном расстоянии от сайта в зависимости от нуклеотидной последовательности, прилегающей к сайту. Поэтому нами предварительно было определено положение точек расщепления эндонуклеазами Bbvll и BspKT5l непосредственно на ДНК M13tgl31(BcoK). Результаты показали, что положение точек расщепления эндонуклеазами Bbvll и BspKT5l на этой матрице совпадают с каноническими. Положение точек расщепления эндонуклеазы SspD5l, как было показано в работе Железной и др. (Железная и др., 2000), не зависит от прилегающей к сайту последовательности.
Хотя основной задачей этого этапа работы было определение метилируемого аденина, тем не менее фрагмент 410 п.о. был метилирован в присутствии [ HJAdoMet независимо метилазами - BcoKIA и ВсоКШ. Каждый из метилированных фрагментов 410 п.о. был инкубирован независимо с эндонуклеазами Bbvll, BspKTSl и SspD5l. Образовавшиеся при расщеплении этими эндонуклеазами фрагменты -280 и 130 п.о. были разделены электрофорезом в 3% агарозном геле семейства NuSieve 3:1 (рис. 39). Выбор этой агарозы был обусловлен тем, что у нее высокая разделяющая способность небольших по размеру фрагментов ДНК (вплоть до 20 п.о.), благодаря чему, во-первых, возможно максимальное удаление друг от друга данных фрагментов, а во-вторых, уменьшение диффузии во время электрофореза, что не приводит к потере части радиоактивной метки. метилирует первый цитозин в последовательности 5 -СТСТТС-3\ В случае М.ВсоКШ в результате обработки ПЦР-продукта 410 п.о. рестриктазами Bbvll и SspDSl [3Н]-меченым тоже оказался фрагмент в 130 п.о., тогда как расщепление при помощи BspK.T5l привело к появлению метки во фрагменте длиной 280 п.о. Эти результаты доказывают, что метилируемым является последний аденин в последовательности 5 -GAAGAG-3\
Таким образом, было установлено, что штамм Bacillus coagulans К содержит две ДНК-метилтрансферазы. М.ВсоКЇА является Кб-аденин-специфичной ДНК-метилтрасферазой и метилирует последний аденин в нижней цепи узнаваемого сайта. М.ВсоКШ является Ы4-цитозин-специфичной ДНК-метилтрансферазой и метилирует первый цитозин в узнаваемой последовательности, как показано ниже:
Полученная рекомбинантная ДНК может быть использована для вставки любого олигонуклеотидного дуплекса с необходимым для изучения сайтом. Для этих целей рекомбинантную ДНК следует расщепить эндонуклеазами #//7361 и Xbal, и у дуплекса будут выступать ACGA на одном конце и четыре основания, которые подходят к другому концу после рестрикции Xbal.
Метод можно проводить непосредственно на олигонуклеотидном дуплексе, но тогда предполагается использование акриламидного геля. При этом для детекции требуется либо большое количество олигонуклеотидов, либо дополнительное введение радиоактивной метки [ Р-у]-АТФ в [ Н] метилированный дуплекс (детекция по двойной метке).
К настоящему времени известны около 20 систем рестрикции-модификации, которые узнают сайт СТСТТС (Roberts et al, 2005 (Rebase). Метилазы выделены только из двух систем (M.Tdell, Ml.Earl и M2.EarI) и еще в одной системе предсказано наличие метилаз (M.EsaSS1257P и M.EsaSS2057P). Специфичность определена только для Ml.Earl, которая является Ы4-цитозин специфичной. Однако положение метилированных оснований ни для одной из этих метилаз не определено. Таким образом, система рестрикции-модификации BcoKl является первой системой, узнающей сайт 5 -СТСТТС-375 -GAAGAG-3 , для которой охарактеризованы метилазы, модифицирующие каждую из цепей и определены основания, метилируемые в обеих цепях сайта.
В ходе работы было найдено 25 почвенных термофильных бактерий, содержащих системы рестрикции-модификации типа II. Наибольшее количество бактерий содержало систему рестрикции-модификации NspLKl - изошизомер системы НаеШ. Такую распространенность именно этого типа систем можно объяснить тем, что среди двух других систем РМ, найденных нами, только эта система узнает тетрапуклеотидную последовательность (две остальных узнают шестинуклеотидную последовательность). Этот факт согласуется с представлением о системах РМ как о самостоятельных единицах жизни, подобных вирусам и транспозонам, и борьбе между ними за «существование» преимущество в которой принадлежит системам, узнающим короткие последовательности. Найденные штаммы отличаются от штаммов-прототипов более высоким выходом эндонуклеаз рестрикции, а штамму Bacillus species LU4 принадлежит по этому параметру пока абсолютный рекорд. Пока слабо изучены механизмы регуляции систем рестрикции-модификации, поэтому трудно даже предположить причины такой высокой продуктивности этого штамма.
Выделенные и охарактеризованные в работе эндонуклеазы рестрикции, благодаря высокой степени функциональной чистоты и стабильности, и в настоящее время используются в нашей текущей работе и в работах других Лабораторий (Института белка РАН, Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН). Полученный в ходе работы на основе эндонуклеазы рестрикции BspUJAl маркер длин высокомолекулярной ДНК также постоянно используется.
