Введение к работе
Актуальность темы.
Галогенирующие ферменты являются в последнее время объектом интенсивного изучения и представляют собой достаточно перспективный класс ферментов. На их основе возможна разработка новых путей модификации ряда полезных галогенсодержащих соединений и, в первую очередь, биоактивных препаратов (т.к. введение в молекулу галогена или нитрогруппы, как правило, сильно увеличивает ее биологическую активность). Галогенирующие ферменты могут использоваться в качестве биодобавки к синтетическим моющим средствам, а также в текстильной промышленности (обработка ферментом волокон позволит увеличить их гидрофильность, что приведет к лучшей смачиваемости и окра-шиваемости волокон). Кроме того, исследование галогенирующих ферментов важно для создания методами генной инженерии высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, продуцентов антибиотиков.
При использовании метода ферментативного катализа открываются перспективы создания экологически чистых, исключающих применение свободных галогенов, технологий.
Этот класс ферментов интересен и с научной точки зрения. Анализ имеющейся информации по проблеме галогенирующих ферментов показывает, что наиболее хорошо изучены гемсодержащие галоперокси-дазы (далее ГП), (так они были названы из-за способности окислять ионы галогенов только в присутствии пероксида водорода), выделенные, в основном, из эукариотических источников. Интенсивное изучение про-кариотических ГП, в частности, бактериальных, началось сравнительно недавно. Наибольший интерес при этом представляют бактериальные гемнесодержащие ГП как наименее изученные. При этом общеизвестно, что бактерии являются более удобными объектами для работы как в лабораторных, так и в промышленных условиях. Необходимость изучения гемнесодержащих бактериальных ГП обуславливается также их чрезвычайно высокой активностью и стабильностью.
Механизм галогенирования для гемнесодержащих ГП еще не изучен. До сих пор не установлено, подобны ли промежуточные механизмы гемсодержащих и гемнесодержащих ГП, являются ли сходными механизмы гапогенирования у различных представителей гемнесодержащих ГП и какие металлы играют роль при катализе.
Существенно, что кроме галогенирования, рассматриваемая группа ферментов при определенных условиях катализирует также и реакции окисления. В частности, ГП окисляют серу и ее соединения. Способность ГП окислять аминогруппы органических соединений в нитрогруппы делает перспективным использование их в тонком органическом синтезе.
Таким образом, исходя из открывающихся перспектив использования бактериальных гемнесодержащих ГП в различных отраслях промышленности, особенно при производстве медицинских препаратов, а также из-за высокой активности и стабильности, и ввиду малой изучен-
ности их свойств, исследование данных ферментов в наши дни особенно актуально.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключается в выделении и очистке до гомогенного состояния хлорпероксидазы (ХП) из штамма бактерий Serra-tia marcescens W250, изучении ее физико-химических свойств и определении молекулярных и кинетических параметров фермента.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
изучить динамику роста культуры S. marcescens и определить время максимального накопления фермента в клетках;
разработать способ получения гомогенного препарата ХП из S. marcescens;
изучить физико-химические свойства фермента;
получить кинетические характеристики ХП;
изучить влияние различных веществ на активность фермента;
провести исследования по выяснению механизма галогенирова-ния ХП;
Научная новизна полученных результатов.
ХП из бактерий S. marcescens - абсолютно неизученный фермент, никаких сведений о нем помимо наших исследований в литературных источниках не имеется.
В данной работе нами впервые предложен метод получения гомогенного препарата ХП из бактерий S. marcescens. Этот метод выделения ХП является простым и позволяет получать значительные количества фермента. Из 150 г клеток (сырая биомасса) получается 5,5 мгХП с удельной активностью 430 цмоль/мин *мг белка, со степенью очистки 1750.
Изучены свойства этого фермента, а также влияние различных неорганических ионов и некоторых органических веществ на активность ХП.
В данной работе впервые был предложен механизм бромирования монохлордимедона (МХД) изучаемым ферментом.
Проведено сравнение иммунологических свойств ХП с уже изученными подобными гемнесодержащими ГП.
Практическая значимость полученных результатов.
В данной работе были предложены оптимальные технологические параметры культивирования бактерий S. marcescens, разработан способ получения гомогенного ферментного препарата ХП. Было установлено, что полученный препарат стабилен и не теряет своей активности в течение нескольких месяцев (при t=-4*C), работа с препаратом не требует пониженных температур ввиду высокой термоустойчивости фермента. Разработанная нами схема выделения и очистки позволила получить препарат с высоким выходом. Проведенные исследования свойств фермента существенно дополнили современные данные о свойствах гем-
несодержащих бактериальных ГП, а также позволили сделать шаг вперед в выяснении механизма галогенирования этими ферментами.
Основные результаты.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены:
на 7-й Гродненской областной конференции молодых ученых и специалистов, Гродно, 1991;
ежегодно с 1991 года по 1995 год на Апрельской научной конференции биологического факультета Гродненского госуниверситета;
на 7-ом Европейском конгрессе Биотехнологии (Италия, 1992)
- на 23-й конференции FEBS'95 (Швейцария, Базель, 1995).
Опубликованность результатов. Результаты исследований опубли
кованы в 6 печатных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитированной литературы.
