Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1. Продуценты ь -амилазы 10
2. Выделение и очистка бактериальной ь-амилазы 11
3. Методы, основанные на специфической сорбции амилаз крахмалом 17
4. .Физико-химические свойства бактериальных л-амилаз 24
5. Возможности практического применения -амилазы 24
ГЛАВА II. Экспериментальная часть - 31
1. Культивирование Bacillus polymyxa 3 31
2. Очистка -амилазы 32
2.1. Получение технического препарата -амилазы 32
2.2. Получение высокоочищенного препарата -амилазы 32
2.2.1. Разработка состава сорбента 32
2.2.2. Разработка условий сорбции-десорбции 33
а) сорбционная емкость кукурузного крахмала 33
б) геометрия колонки 33
в) температура сорбции и десорбции 33
г) условия десорбции: рН и концентрация ИаС1 в растворе 33
2.2.3. Очистка -амилазы методом специфической сорбции на крахмале 34
2.2.4. Очистка А-амилазы методом осаждения комплекса фермент-субстрат 34
2.2.5. Обессоливание растворов уь-амилазы методом гель-фильтрации 35
2.2.6. Концентрирование растворов а-амилазы 35
2.2.7. Изоэлектрическое фокусирование 35
3. Анализ продуктов гидролиза крахмала 36
3.1. Бумажная хроматография 36
3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 36
4. Методы определения ферментативной активности 37
4.1. Определение амилолитической активности 37
4.2. Определение протеолитическбй активности 38
5. Определение концентрации белка 38
6. Изучение свойств fe-амилазы 39
6.1. Определение молекулярной массы 39
6.1.1. Диск-электрофорез в присутствии додецил- сульфата натрия 39
а) окрашивание гликопротеидов 40
6.1.2. Седиментационный анализ 40
6.2. Определение аминокислотного состава 41
6.3. Определение карбогидратов 42
6.4. Изучение зависимости активности /6-амилазы от рН и температуры 42
6.5. Изучение стабильности ь-амилазы 42
6.6. Определение Км эфф 43
6.7. Изучение субстратной специфичности 43
7. Реагенты 43
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 44
1. Получение технического препарата fc-амилазы . 44
2. Получение высокоочищенного препарата 46
2.1. Разработка состава сорбента 46
2.2. Условия сорбции-десорбции--амилазы 50
2.3. Очистка бактериальной ь-амилазы 57
2.4. Изоэлектрическое фокусирование 65
3. Свойства изоформ -амилазы 70
3.1. Гомогенность и молекулярная масса 71
3.2. Аминокислотный состав 73
3.3. Углеводный состав 75
3.4. Влияние рН на активность и стабильность 75
3.5. Влияние температуры на активность и стабильность 78
3.6. Субстратная специфичность и продукты гидролиза 81
Выводы 88
Список литературы 90
- Методы, основанные на специфической сорбции амилаз крахмалом
- Возможности практического применения -амилазы
- Получение технического препарата fc-амилазы
- Влияние температуры на активность и стабильность
Введение к работе
Амилолитические ферменты широко применяются в пивоварении, виноделии, хлебонечении и производстве малтозы, успешно конкурирующей с глюкозой и сахарозой в кондитерском производстве, выделке ликеров, консервировании. Традиционные источники этих ферментов - ячмень, пшеница, рожь и некоторые другие зерновые культуры..Причем, для повышения осахаривающей и декстринолити-ческой активности приходится проводить осолаживание зерна -сложный процесс, требующий специальных хорошо проветриваемых помещений с регулируемой температурой. Кроме того, для производства солода предпочтительно применение высококачественного зерна. В Японии и Китае для приготовления соевых соусов и спиртных напитков из риса издавна используются амилазы плесневых грибов из родов Aspergillus и Mucor . Еще в 1884 году японский ученый Такамине предложил при производстве спирта заменить солод сухой культурой Aspergillus oryzae /9/.
Современный уровень развития микробиологической промышленности позволяет повсеместно заменить солод бактериальными амилазами. В странах Западной Европы, США и Японии ежегодно производится и применяется значительное количество бактериальных и грибных о- и 5-амилаз /119/. В нашей стране промышленным способом производится только бактериальная оС-амилаза. Препараты амилосубтилин Г Зх и Г Юх применяются в сельском хозяйстве, при производстве моющих средств и в разных отраслях пищевой промышленности. Хотя под действием о(-амилазы крахмал гидроли-зуется с образованием глюкозы, мальтозы и других олигосахари-дов, этот фермент применяется и там, где требуется образование одного продукта, в том числе и мальтозы. Ценные качества мальтозы хорошо изучены. Этот дисахарид может стать заменителем
7 сахарозы в питании, так как меньше способствует увеличению
веса и порче зубов человека. Добавление мальтозы в коровье молоко делает его равноценным заменителем материнского молока. Применение мальтозы в кондитерской промышленности также дает ощутимый эффект: она легко взбивается, удерживает влагу, предохраняет от потемнения /3/.
О существовании бактерий-продуцентов б-амилазы впервые сообщалось в 1942 году /134/. Однако, целевые поиски продуцентов для промышленного производства бактериальной В-амилазы начались лишь в 60-ых годах /36-40, 42-48, 58', 108/. Значительных результатов в этой области добились японские ученые /53, 70, 72, 78, 80, III-II8, 125-128/. В настоящее время для производства мальтозы из крахмала в Японии, США, Англии, Франции, ФРГ, Швеции применяется бактериальная в-амилаза /80-99/. Выход основного продукта по большинству методик достигает 95%. В то же время, в нашей стране мальтозу получают методом осахарива-ния крахмала солодовым экстрактом. Технологический процесс осложняется образованием глюкозы, декстринов и других побочных продуктов.
В 1978 году во ВНИИ Прикладной энзимологии был отобран продуцент /Ь-амилазы - Bacillus polymyxa N З . Это создало реальное основание для создания производства отечественной бактериальной й-амилазы. В связи с этим целью настоящей работы было:
Разработка достаточно эффективного метода выделения и очистки бактериальной д-амилазы.
Изучение основных физико-химических свойств полученной й-амилазы, необходимых для ее квалифицированного применения.
Для решения поставленных задач разработаны методики получения технического и высокоочищенного препаратов уВ-амилазы.
Технический препарат fe-амилазы получали фракционированием органическими растворителями. Схема получения высокоочищенного препарата состоит из двух специфических стадий очистки: сорбции-десорбции на кукурузном крахмале и осаждение комплекса ь-амилаза-гликоген 40% этанолом. Детально разработана методика сорбции-десорбции на кукурузном крахмале в динамическом режиме ( первая стадия ). Показано, что десорбция й-амилазы с крахмала происходит вследствие ингибирования фермента продуктом реакции - мальтозой. Для очистки й-амилазы впервые применен метод осаждения фермент-субстратного комплекса ( вторая стадия ). В полученном после двух стадий очистки препарате методом изоэлектрического фокусирования обнаружено наличие двух изоформ. Определены их молекулярные массы, аминокислотный состав, углеводный состав, рН-оптимум. Изучена зависимость активности изоформ от температуры, а также зависимость их стабильности от рй и температуры. Определены основные продукты гидролиза субстрата.
На основании всей совокупности экспериментальных данных сформулирован вывод, что изоформы й-амилазы из Bacillus роїужу-ха ІЗ представляют собой индивидуальные белки, отличающиеся по таким физико-химическим характеристикам как аминокислотный и углеводный состав, молекулярная масса, изоэлектрические точки.
Методы, основанные на специфической сорбции амилаз крахмалом
Еще в начале 20 века Э.Штаркенштейн /122/ наблюдал адсорбцию диастазы из Amylum oryzae на рисовом крахмале. Смесь диастазы с крахмалом в буферном растворе инкубировали 24 часа при 40. Оказалось, что диастатический фермент сорбировался на рисовом крахмале и, особенно в присутствии 1% хлористого натрия, гидролизовал его. Об этом свидетельствовало появление восстанавливающих Сахаров в растворе. В контрольной пробе Сахаров не появилось. Сорбция считалась необратимой.
Способностью амилазы сорбироваться на крахмале воспользовался О.Хольмберг /55/ при выделениио(-амилазы из солода. Для селективной сорбции о -амилазы оказалось необходимым присутствие в среде мальтозы, иначе сорбировались и «С- и амилазы. Концентрация мальтозы в среде должна быть не выше 0,6%, так как в противном случае эффективность сорбции уменьшалась. Селективность сорбции можно регулировать, меняя концентрацию этанола в среде сорбции. В 40 - 50% растворах этанола достигалась адсорбция 97% о .-амилазы на крахмале. Автор изучил зависимость сорбции от концентрации фермента, температуры и рН среды. Оказалось, что решающее значение для эффективности сорбции имеет температура среды - при наличии оптимальной концентрации мальтозы процесс проходит лучше при более низких температурах ( 0 и ниже ). Аналогичные данные приводятся в работе С.Пронина /12/.
Блом, Бак и Брааэ /25/ определили, что сорбция (.-амилазы на крахмале при рН 4,6 проходит в 5 раз эффективнее, чем при рН 6,6. Они показали, что сорбированная амилаза гидролизовала крахмал без мутаротации продукта. В то время, как оставшаяся в растворе амилаза гидролизовала крахмал с образованием А-про-дукта. Авторы сделали вывод, что из смеси о г- и А-амилаз, находящейся в экстракте солода на необработанном крахмале сорбировалась только о амилаза.
Хокенхул и Херберт /54/ применили метод сорбции-десорб 19 ЦИИ на крахмале ДЛЯ ОЧИСТКИ амилазы ИЗ Clostridium acetobuylicum . Сорбцию проводили в присутствии 50% этанола и 1% сульфата натрия два часа при 0. Фермент элюировали 0,04 М фосфатным буферным раствором рН 5,8 при 37. В результате фермент был очищен в 300 раз с выходом 57%. Хотя эта работа нигде, даже самими авторами, не упоминается в связи с -амила-зой, но единственный стабильный продукт гидролиза крахмала этой амилазой - мальтоза.
Швиммер и Боле /НО/ усовершенствовали технику проведения эксперимента, нанося раствор о(-амилазы из ячменя на колонку диаметром 40 мм и высотой 100мм, заполненную смеевю равных частей крахмала и целита. Они установили, что оС-амилаза способна сорбироваться на необработанном крахмале из водных растворов, но в водно-этанольной среде процесс более полный. В соответствии с этими данными Штрауб /123/ применил для очистки панкреатической -амилазы сорбцию на крахмале, модифицированном по Линтнеру. Элюцию фермента он осуществлял повьшая температуру среды до 37, но высвобождение фермента начиналось уже при 21. Полученный после этого фермент мог быть повторно сорбирован на том же крахмале, охладив смесь до 0. Исходя из своих результатов, Штрауб сделал предположение, что амилаза при повышении температуры начинает катализировать гидролиз крахмала и разрушает площадку адсорбции.
Сэйер /132/ проводил сорбцию амилаз из Pseudomelias sac-charophila на смеси картофельного крахмала с целитом (весовое соотношение 4:1) в колонке диаметром 8-12 мм и высотой 40-60 мм. Адсорбция велась, пропуская через колонку бесклеточную ку-льтуральную жидкость при 4. Оказалось, что сорбированный фермент может быть элюирован, суспендируя нерастворимый крахмал с сорбированным ферментом в 0,5-1,0% растворе растворимого крахмала. Элюирующими агентами также могут быть растворимые продукты гидролиза растворимого крахмала. Но, по мнению автора, мальтоза не способна вызвать десорбцию оС-амилазы. Для этого нужны растворимые олигосахариды, которые предпочтительнее, чем растворимый крахмал при осуществлении сорбции-десорбции в колоночном режиме. Этим способом автор отделил внеклеточную о -амилазу, сорбировавшуюся на крахмале, от внутриклеточной 6-амилазы, не сорбировавшейся в любых исследованных условиях. Марковитц и Кляйн /64/, изучая свойства оС-амилазы из Pseudomonas saccharophila , применили методику Сэйера в качестве первой стадии при очистке этого фермента. За одну стадию была достигнута очистка в 47 раз с выходом 62%.
Дюбе и Нордин /32/, применив сорбцию на картофельном крахмале, очищали амилазы из сорго. -Амилаза проходила колонку не задерживаясь, в то время как С-амилаза сорбировалась и ее пришлось элюировать раствором ацетата кальция.
Шульман и Вайнер /2,19-21/ исследовали условия извлечения oCr-амилазы из культуральных жидкостей Bac.subtilis, Bac.me-sentericus и Asp.oryzae и растворов препарата крахмалом, модифицированным путем нагревания в автоклаве при 120 в течение часа. Для улучшения сорбции добавляли 20% сульфата аммония и 0,25% растворимого крахмала. Авторы считают, что "сорбция амилазы крахмалом происходит вследствие молекулярного поверхностного взаимодействия амилазы с крахмалом с последующим высаливанием сернокислым аммонием". Полная и устойчивая десорбция достигалась при элюции раствором 0,1% NapCO и 0,05% (СНдСОО)оСа при 50 15 - 20 минут. Процесс сорбции-десорбции проводился как в статическом, так и в динамическом режимах.
Возможности практического применения -амилазы
В хлебопечении мальтозная патока используется для повышения газообразующей способности муки и в качестве источника образования меланоидов, улучшающих вкус и качество хлеба. Наличие мальтозы в хлебе замедляет его черотвение.
Основной потребитель мальтозной патоки - кондитерская промышленность, где ее используют при выработке изделий как антикристаллизатор. Она легко взбивается до консистенции, необходимой при выработке кондитерских изделий и мороженого, устойчива при нагревании от потемнения, удерживает влагу в изделиях.
Установлено, что для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у детей грудного возраста и для повышения биологической ценности детских питательных смесей и молока их необходимо обогащать мальтозой. За рубежом для питания детей применяют смесь декстрино-мальтозной патоки и коровьего молока./3/.
Мальтоза может применяться в таких областях, как ферментная промышленность ( компонент питательных сред ), или как сырье для изготовления производных, например, мальтитола /105/.
В СССР мальтозу изготовляет Шосткинский завод химреакти-вов, применяющий для гидролиза крахмала экстракт ячменного солода ( ТУ 6-09-2108-77 ). Технологический процесс затрудняется образованием глюкозы, декстринов и других побочных продуктов гидролиза. В 1979 году годовая потребность страны в мальтозе составляла 4000 кг. Завод смог взять на производство 2500 кг. По свидетельству главного инженера завода наличие производства бактериальной ft-амилазы упростило бы технологический процесс.
В нашей стране проведено немало исследований по применению ферментных препаратов в производстве мальтозной патоки и других крахмалопродуктов /4-6, II, 18/. Есть иностранные работы, касающиеся применения амилаз в спиртовой промышленности /120/, хлебопечении /68/, пивоварении /146/, производстве крахмалопродуктов /74/. В Англии, Франции, ФРГ, США и Японии запатентовано значительное количество методов получения мальтозы путем гидролиза крахмала по действием бактериальной А-амилазы /82-85/, или совместным действием бактериальных В-амилазы и \-амилазы /86/, В-амилазы и пуллуланазы /65, 66, 76, 87 - 89, 129 - 131, 136 - 139/, й-амилазы и о(-глюкозидазы /90 - 106/. Во всех упомянутых работах выход основного продукта - мальтозы составляет не менее 70%. А в тех случаях, где применяются двухферментные системы, выход достигает 95%. От побочных продуктов мальтозу очищают посредством ионообменной хроматографии.
Рекомендуется использовать иммобилизованный фермент /119/, так как это создает возможность более экономичного его использования. В качестве носителя применяют пористое стекло /56, 131/, п-аминобензилцеллюлозу /75/, сополимеры акриловой кисло 29 ты /65,66/. Широкие исследования по иммобилизации -амилазы методом гидрофобной сорбции на агарозном геле проведены К.Кол-дуэл и др. /26,27/. Она рекомендует такой метод иммобилизации, как наиболее предпочтительный, в случае применения полученного препарата в медицине и пищевой промышленности. Самым простым и, может быть, самым перспективным представляется применение л-амилазы, сорбированной на необработанном крахмале, как рекомендует Хошино /57,81/.
Суммируя рассмотренные литературные данные можно сказать, что наиболее часто применяемый продуцент уй-амилазы - Вас. ро-lymyxa . При очистке бактериальных А-амилаз применяются как традиционные, так и методы, основанные на специфическом взаимодействии фермент-субстрат. Традиционные методы дают возможность получить ферментные препараты высокой степени очистки, но с незначительным выходом. Методы, основанные на сорбции десорбции ферментов на их естественных субстратах, более эффективны, но в приложении к бактериальной &-амилазе они до сих пор не были применены в полной мере. Желая применить этот метод, очевидно, следует детально разработать условия проведения и сорбции, и десорбции. Судя по приведенным в литературе методикам, особое внимание надо обратить на температурный режим проведения обеих стадий. Можно ожидать, что решеающее значение при этом будет иметь накопление в среде продукта гидролиза крахмала - мальтозы.
Процесс сорбции-десорбции проводится и в статическом, и в динамическом режимах. Работа в статических условиях требует больших затрат сил и времени. К тому же здесь фигурируют большие объемы и возможны потери в выходе и активности при фильтровании или центрифугировании. Поэтому, все условия надо разрабатывать в динамическом режиме. Заслуживает также внимания еще не применявшийся для очистки &-амилаз метод осаждения комплекса А-амилаза-гликоген.
Необходимость производства бактериальной д-амилазы не вызывает сомнений, как не может возникнуть особых проблем по ее применению.
Получение технического препарата fc-амилазы
Результаты изо-электрического фокусирования мы обсудим отдельно более подробно. На данной же стадии из этих результатов можно сделать вывод, что наблюдаемая микрогетерогенность, пропадающая при предварительной обработке ингибитором протеаз -фенилметилсуль-фонилфторидом, связана с ограниченным протеолизом /15/. Величину протеолитической активности в растворах в-амилазы определяли по методу, разработанному во ВНИИ Прикладной энзимоло-гии, с применением окрашенного субстрата ОКА-АС /I/. Оказалось, что при осаждении 5-амилазы этанолом, в применяемых нами условиях, протеазы из культуральнои жидкости также переходят в осадок. При сорбции-десорбции на крахмале раствора этого осадка удается избавиться лишь от 87% протеолитической активности (240 единиц ПА в растворе осадка и 31,2 единицы ПА в элюате с крахмала). По-видимому, протеазы не отмываются с другими балластными белками во время сорбции на крахмале вследствие того, что сами сорбируются на молекулах 6-амилазы.
Для того, чтобы избавиться от протеаз, мы несколько изменили схему очистки, включив в нее дополнительную стадию специфической сорбции. Охлажденный до 4 бесклеточный фильтрат культуральнои жидкости наносили на колонку, заполненную смесью кукурузного крахмала с фильтроперлитом (весовое соотношение 5:1), при 4. Балластные белки отмывали универсальньм буферным раствором рН 7,0 при 4. Для элюции -амилазы меняли условия промывания: температура 30, рН 6,5 универсальный буферный раствор, содержащий 0,6 М NaCl. Полученный элюат охлаждали до 0 и повергали следующей процедуре. Раствор Ь-амилазы(100 мл) смешивали с 2% раствором гликогена из печени кролика на льду. Из этой смеси, добавляя этанол до концентрации 40% в растворе1"(55 мл), осаждали комплекс Ь-амилаза-гликоген. Смесь центрифугировали 10 минут при 13000 об/мин и 0. Осадок, представляющий собой фермент-субстратный комплекс, дважды промывали 40% этанолом в универсальном буферном растворе рН 7,0. Промытый осадок суспендировали в универсальном буферном растворе рН 7,0 (25 мл) и инкубировали 3 часа при 30 для гидролиза гликогена и перехода й-амилазы в раствор. Оставшийся осадок отделяли центрифугированием 10 мин при 8000 об/мин. д-Амилаза оставалась в надосадочной жидкости. Наличие в ней продуктов гидролиза гликогена не позволяет определить величину активности ь-амилазы без предварительной обработки раствора. Для этого раствор диализировали против универсального буферного раствора рН 7,0 или пропускали через колонку с Био-Гель Р-2.
Как видно из таблицы 4, после такой процедуры очистки получали препарат А-амилазы с удельной активностью 128 ед/мг и выходом 77%. Определение протеолитической активности на всех стадиях очистки показывает, что после второй стадии специфической сорбции удается избавиться от протеаз. Кроме того, эта стадия позволяет одновременно решить еще одну задачу - сконцентрировать раствор после сорбции-десорбции на кукурузном крахмале. Непосредственно из элюата с кукурузного крахмала а-амилаза осаждается в виде фермент-субстратного комплекса и переводится в раствор меньшего объема.
Метод осаждения фермент-субстратного комплекса, примененный в данной схеме, был разработан для очистки о с-амилаз из различных источников /51, 62, 63, 109/, основываясь на аналогии взаимодействия фермент-субстрат с реакцией преципитации антиген-антитело. В этих работах фермент-гликогенный комплекс осаждался 40% этанола. При такой концентрации этанола в среде гликоген уже сам по себе выпадает в осадок и соотношение количеств фермента и гликогена в растворе не столь важно для достижения осаждения. Комплекс же фермент-субстрат образуется. Поэтому и мы в своих опытах применяли осаждение комплекса -амилаза-гликоген 40% этанола. Результаты показывают, что достигается почти полное связывание фермента: выход по активности 77%. Авторы вышеупомянутых работ применяли гликоген из моллюсков. Нам доступнее гликоген из печени кролика, который оказался также пригодным.
Растворы fe-амилазы, полученные по обеим схемам при хранении в холодильнике в течение 12 месяцев не теряли активности. Более длительное наблюдение не проводилось. Так как в препарате, полученном по первой схеме, присутствует протеаза, следует ожидать, что этот препарат окажется менее стабильным.
Надо отметить, что сорбция-десорбция на крахмале уже применялась для очистки бактериальных -амилаз/71, 126/. В обоих случаях она была первой стадией в схемах очистки и проводилась прямо из фильтрата культуральной жидкости в статическом режиме. С. Мурао с сотрудниками /71/ проводили сорбцию в присут 65 ствии 25% сульфата аммония при 5 2 часа, а элюцию - 20 мМ бо-ратным буферньм раствором рН 7,2 при 37. И.Таказаки /126/ проводил сорбцию в холодильнике 18 - 20 часов, добавив в фильтрат культуральной жидкости кукурузный крахмал. Сорбировавшуюся fi-амилазу он элюировал 10% раствором мальтозы. Выходы на этой стадии у С.Мурао 46,8% при степени очистки 13,5 раз, а у И.Таказаки 68,2% при степени очистки 28,6 раза. Интересно, что добившийся лучшего результата И.Таказаки вызывал десорбцию, добавляя мальтозу в среду. При проведении сорбции прямо из элю-ата по разработанной нами методике сорбции-десорбции в динамическом режиме выход достигает 83% при степени очистки 99 раз. Вторая примененная нами стадия специфической сорбции - осаждение фермент-субстратного комплекса до сих пор применялась лишь для очистки Ч-амилаз /51, 62, 63, 109, 124/. Как показали результаты наших опытов, этот метод дает хорошие результаты и при очистке бактериальной й-амилазы: после этой стадии выход 77% при степени очистки 123,4 раза.
Влияние температуры на активность и стабильность
Причина разной термостабильности изоформ, возможно, в структуре их молекул. Хотя обе изоформы - гликопротеиды, но изоформа I содержит вдвое больше Сахаров. В то же время, известно, что присоединение полисахарида к белковой молекуле приводит к значительному повышению ее стабильности /31/.
Температуры, при которых наблюдается наиболее высокая активность бактериальных А-амилаз, разнообразны: от 30 для А-амилазы из Bac.polymyxa/40/, 45 - из Bac.polymyxa N 72 /71/ до 50 для Я-амилазы из Bac.cereus var. mycoides/126/ и 55 - из Bac.cereus BQ 10-S1 Spo II /73/. Термостабильность этих ферментов тоже разнообразна. Наименее стабилен фермент і из Bac.polymyxa - ниже 40/40/. Наиболее - в-амилаза из Вас. megaterium N 32 /53/ - ниже 55, и одинаково, ниже 50, стабильны А-амилазы из Вас. polymyxa N 72/71/ и из Bac.cereus BQ 10-S1 Spol/126/.
Амилазой считается фермент, действующий с невосстанав-ливающего конца молекулы субстрата и гидролизующий оЬ-1,4-гли-козидные связи с инверсией конфигурации связи в С j положении молекулы глюкозы. Она не способна гидролизовать оСг1,б-глико-зидные связи и, поэтому, глубина гидролиза амилопектина меньше, чем амилозы. При четном количестве остатков глюкозы в молекуле субстрата единственный низкомолекулярный продукт -мальтоза. Если в гидролизуемой молекуле нечетное число остатков глюкозы, возможно образование некоторого количества глюкозы и мальтотриозы /60/.
Бактериальная а-амилаза, впервые выделенная Робитом и Френчем /107/ из культуральной жидкости Bac.polymyxa способ-на гидролизовать не только о(.-1,4-, но и оС-1,6-гликозидные связи в молекуле субстрата. Основным критерием для классификации этого фермента авторы избрали конфигурацию связи при аномер-ном атоме углерода в продукте реакции - мальтозе и отнесли его к Jb-амилазам. Д.Маршалл /67/ показал, что природа действия этой амилазы и ь-амилазы из картофеля в основном одинаковы.
Изоформы -амилазы из Bac.polymyxa I 3 гидролизуют растворимый крахмал с образованием мальтозы. Но, как показывает анализ продуктов гидролиза методом бумажной хроматографии (рис. 19), среди продуктов гидролиза изоформой I присутствует и маль-тотриоза. Анализ продуктов ферментативной реакции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показал, что мальто-триоза составляет около 25% продуктов гидролиза растворимого крахмала изоформой I (рис. 20). Оказалось, также, что изофор-ма I обладает меньшим сродством к растворимому крахмалу, чем изоформа II: Kj Э( по отношению к этому субстрату равна 1,67 г/л, а К дфф - 1,14 г/л (рис. 21).
Для более полного описания изучали действие изоформ на различные субстраты. Как видно из рис. 22, изоформа I гидроли-зует амилопектин на 34%, растворимый крахмал - на 32%, амилозу - на 34%, гликоген - на 14%. Изоформа II - на 29, 25, 31 и 17% соответственно.
Судя по этим данным, нет сомнений в том, что изоформа II является -амилазой такого же типа, как и охарактеризованная Д.Маршаллом /67/. С другой стороны, у нас нет веских оснований считать изоформу I не -амилазой. Наличие малтотриозы в продуктах гидролиза растворимого крахмала делает ее менее удобной для применения в производстве мальтозы. Но по всем параметрам: высокая рН- и термостабильность, более высокая температура, при которой наблюдается наивысшая активность, изо-форма I предпочтительнее, чем изоформа II. В практике производства мальтозы методом ферментативного гидролиза известно применение амилаз, не относящихся к й-амилазам и гидролизую-щих крахмал с образованием мальтозы и мальтотриозы. Это амилаза из Streptomyces /82, 83/, выделенная И.Коазе с сотрудниками .
