Введение к работе
Актуальность проблемы. Клеточная оболочка бактерий является важным фактором их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. У аэробных метанотрофов, использующих метан в качестве источника углерода и энергии, клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану (Гальченко, 2001; Троценко, Хмеленина, 2008). Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов несколько отличается по химическому составу от таковой других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием предельно восстановленного газообразного субстрата - метана. Так, в наружной мембране термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath обнаружены специфические белки, в том числе мультигемовые цитохромы с типа, что указывает на окислительно-восстановительные процессы, происходящие на клеточной поверхности (Karlsen et al. 2008, 2011).
Интригующей особенностью ряда метанотрофов является наличие на внешней поверхности клеточной стенки упорядоченных гликопротеиновых S-слоев. У метанотрофов рода Methylomicrobium, включая галоалкалофилов Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. buryatense (штаммы 5B, 5G, 6G и 7G), а также негалофильного нейтрофила Mm. album BG8, S-слои представлены монослоем чашевидных структур, уложенных в гексагональной (р6) симметрии (Jeffries et al., 1987; Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). Напротив, у Mc. capsulatus (штаммы 874 и Texas) S-слои имеют тетрагональную (p4) симметрию расположения белковых субъединиц (Тюрин с соавт., 1985; Сузина, Фихте, 1986). Однако функции этих структур у метанотрофов остаются не понятными. Уровень понимания истинной роли S-слоев у различных микроорганизмов в значительной степени зависит от расшифровки соответствующих генетических детерминант белковых компонентов и выяснении связи S-слоев с другими поверхностными белками микроорганизма.
Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - идентификация и первичная характеристика доминирующих поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Выделить основные поверхностные белки у Mm. alcaliphilum 20Z и определить нуклеотидные последовательности кодирующих их генов.
-
Изучить возможную связь основных поверхностных белков с S-слоями или другими структурами клеточной оболочки.
-
Выделить и охарактеризовать инсерционные мутанты Mm. alcaliphilum 20Z по поверхностным белкам, изучить основные свойства полученных мутантов.
Научная новизна. У Mm. alcaliphilum 20Z в составе ассоциированных с клеточной поверхностью белков найдены белки с м.м. 27 и 80 кДа, проявлявшие высокую гомологию (>50% идентичности) с поверхностными белками 'CorA' и 'CorB' Methylomicrobium album BG8. Обнаружена локализация белка 'CorA' в основании чашевидных структур S-слоев и периплазматическая локализация 80-кДа белка, отнесенного к новому классу дигемовых цитохром с пероксидаз. Сконструированы инсерционные мутанты по генам 'согА' и 'согВ'. Постулирована роль 'CorA' в прикреплении S-слоев к клеточной поверхности метанотрофа. Мутант по гену 'corB' рос на метане с высокой скоростью и имел более высокие активности ферментов окисления С1-соединений по сравнению с родительским штаммом. Показана коэкспрессия белков 'CorA' и 'CorB' при низком содержании меди в ростовой среде. Кроме 'CorA' и 'CorB' при биотинилировании целых клеток метились а-субъединица метанолдегидрогеназы (МДГ) и 59-кДа белок, указывая на экспонирование на наружной поверхности клеточной стенки по крайней мере фрагментов этих белков. Полученные приоритетные данные по идентификации и характеристике поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z создают предпосылки дальнейших исследований их роли у галоалкалофильных метанотрофов.
Научно-практическое значение. Результаты изучения поверхностных белков и кодирующих их генов у галоалкалофила 20Z представляют интерес для продукции целевых белков посредством гетерологичной экспрессии ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых минеральных средах. Кроме того, определение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Разработанный метод получения мутантов Mm. alcaliphilum 20Z перспективен в качестве эффективного инструмента при изучении функциональных генов/ферментов у метанотрофов.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2007-2011гг), на I школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), на XIV международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на V и VII молодёжных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2011).
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ГФУ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398), поддержана грантами РФФИ (08-04-01732-а,10-04- 01224-а) и госконрактами № 4.749.11.0111, № 02.740.11.0296.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 4 тезисов.
Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Дуде В.И., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Серебряковой М.Е., к.б.н. Зиганшину Р.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Бесчастному А.П., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего _ ссылки, из них _ на русском и _ на английском языках, содержит _ таблиц и _ рисунка.
