Введение к работе
Актуальность проблемы. Белковые ростовые факторы играют ключевую роль в процессах развития и функционирования организма. Особое значение среди ростовых факторов имеют белки семейства нейротрофинов, в число которых входит фактор роста нервов (ФРН). Нейро-трофины являются внутриклеточными лигандами, воздействующими на дифференцировку, выживание (ингибируя апоп-тоз) и сохранение функций нейрональных клеток у позвоночных (Gotz R., Schart М., 1994). В сферу функциональной компетентности ФРН входят не только периферическая и центральная нервные системы, этот регулятор может оказывать влияние и на другие типы клеток, включая иммунные и раковые клетки (Levi-Montalcini R. 1987; Otten U. et al., 1989). У человека ФРН обнаружен лишь в следовых физиологических количествах, но именно с нарушениями этого белка связывают ряд заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, различные нейрофиброматозы (Hellweg R. et al.,1998; Eriksdot-ter J. et al.,1998). Значение ФРН в развитии и нормальном функционировании ряда систем организма определяет перспективность его использования в медицинской практике. Однако в реализации этой программы существуют трудности, прежде всего связанные со структурными и иммунологическими особенностями ФРН из разных видов животных и человека.
В настоящей работе факторы роста нервов изучались в сравнительном аспекте. Не вызывает сомнения, что расширение спектра выявленных источников (включая региональные виды фауны) и выделение ФРН из них, позволили получить более объективную картину различий и общих черт в строении ФРН в филогенетическом ряду позвоночных. Разработка эффективных методов выделения ФРН, создание высокочувствительных тестов его определения, а также привлечение математических и компьютерных методов явились важными и направляющими для сопоставительного анализа ФРН и создания модели вневидового специфического диагностикума.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы исследование факторов роста нервов в филогенетическом ряду позвоночных: выделение, характеристика, сравнительный анализ структуры и разработка подходов преодоления видовой специфичности.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-оценка неироростовои активности в тканях у позвоночных разных таксономических групп, разработка эффективных методов выделения ФРН из разных источников, сравнительный анализ свойств выделенных белков из разных классов животных;
-разработка иммунотеста на основе поликлональных антител, способных распознавать видоспецифические и общие для ФРН антигенные детерминанты;
-компьютерное исследование структуры известных ФРН и создание модели вневидового высокоспецифического диагностикума для ФРН.
Новизна и практическое значение работы. При анализе неироростовои активности в различных органах и тканях у эндемичных видов рыб, пресмыкающихся и земноводных установлено, что у исследованных видов рыб наибольший уровень неироростовои активности отмечается в мозге золотой рыбки и карася (Carassius auratus и Cyprinus carpio). У земноводных (Rana ridibunda, Xenopus laevis) высокий уровень неироростовои активности выявлен в мозге и мышечной ткани. Из более доступной мышечной ткани озерной лягушки разработан способ получения гомогенного белка, охарактеризованного по результатам биотестов на ганглиях куриных эмбрионов и клетках феохромоцитомы РС-12 как ФРН. У пресмыкающихся определен высокий уровень в почках и, особенно, в ядовитых железах среднеазиатских змей (Agkistrodon halus п., Naja oxiana Eichw, Vipera ursini, Vipera lebetina turanica, Echis multisquaraatus) . Эффекты ФРН ядов гадюкових и ямкоголовых более выражены, чем яда аспидо-вых. Половой диморфизм и возраст особей существенно не отражается на уровне ФРН у рептилий. В слюнных железах неядовитых рептилий ФРН активность выявляется не у всех видов. Так из 8 проверенных видов она обнаружена лишь у трех (Varanus griseus, Elaphe dione и Eremias velox) .
Разработан способ обогащения (А.С. N 1172114) и схемы очистки ФРН из ядов среднеазиатской эфы и кобры. По аминокислотному составу ФРН яда среднеазиатской кобры и известных функциональных аналогов построена математическая модель филогенетического древа семейства ФРН.
Разработан способ получения белковых фракций из сыворотки крови человека, уровень неироростовои активности в которых соответствует чувствительности биотеста на ганглиях куриных эмбрионов. Установлено, что при
восстановительных процессах и беременности в сыворотке крови увеличивается уровень нейроростовой активности. Хронический алкоголизм и шизофрения сопровождаются некоторым уменьшением уровня ФРН. Предложена схема получения нейроростового белка из абортивной крови.
Разработана высокочувствительная тест-система для определения ФРН на основе антител, полученных оригинальным способом. Данный способ включает двойную аффинную хроматографию антисыворотки барана к мышиному ФРН сначала на колонке с иммобилизованным ФРН мыши, а затем на колонке с ФРН быка. Установлено, что в активном иммунодоменантном центре ФРН содержатся как минимум два зпмтопа, один из которых является общим для ФРН млекопитающих и слабо иммуногенным, а второй ви-доспецифичным и высокоиммуногенным. Структура общего эпитопа может служить основой антигена для разработки универсального диагностикума при определении ФРН у всех млекопитающих.
Предложена методология компьютерного анализа аминокислотной последовательности белков, позволяющая выявлять консервативные, в их числе уникальные участки исследуемого белкового семейства, т.е. аминокислотные фрагменты, встречающиеся только у данной группы белков . При сканировании информации с компакт-диска "Атлас белковых и геномных последовательностей", версия 1993, выявлены 4 уникальных аминокислотных фрагмента для семейства ФРН и 7 для нейротрофинов. По включенным в компьютерный анализ данным гидрофильно-сти/ гидрофобности аминокислот построены графики гид-рофильности цельной молекулы ФРН и ее отдельных фрагментов. На их основе осуществлен прогноз поверхностной доступности отдельных уникальных фрагментов ФРН. Выявлено, что уникальные фрагменты ФРН KTTATDIKG(-Lys-Thr~ Thr-Ala-Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-) и SGCRGID (-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-Ile-Asp-) являются наиболее перспективными в качестве матрицы для синтеза пептидов. Использование последних в качестве низкомомолекулярных антигенов позволит выработать антитела и создать на их основе высокоспецифический вневидовой иммунодиагностикум на ФРН.
Практическая ценность работы заключается в разработке методов выделения и очистки ФРН из различных источников, представляющих коммерческую ценность в качестве биопрепаратов в биохимии, нейробиологии, нейрохи-мии и медицинской практике. Предложенный способ двухэтапной очистки поликлональных антител дает воз-
можность получения общих и видоспецифичных антител как основы для диагностикумов. Разработанные нами компьютерные программы позволяют по процентному содержанию аминокислот судить о структурной близости белков. Кроме того, они позволяют по выявленным уникальным участкам классифицировать исследуемые группы белков, а по рассчитанному профилю гидрофильности/гидрофобности уникальных пептидов оценить возможность их использования в качестве матрицы при создании высокоспецифических диагностикумов.
Апробация работы. Представленные результаты работы были доложены и обсуждены на различных республиканских и международных съездах, симпозиумах и конференциях, в том числе: на 2 рабочем совещании "Морфогенетически активные вещества", (Пущино, 1988); на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии",(Ленинград, 1989); на XIY Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989); на первом Всемирном конгрессе герпетологов (Лондон, 1989); на 20 конференции Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО),(Будапешт, 1990); на 9 Европейском симпозиуме по животным, растительным и микробиологическим токсинам (Лохусалу, 1990); на V Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана
(Ташкент,1991); на Советско-Финском симпозиуме по биологии развития "Сигнальные молекулы и клеточная диффе-ренцировка", (Суздаль, 1991); на Европейском конгрессе по биологии развития (Иерусалим, 1991); на симпозиуме Содружества Независимых Государств "Организм и среда",
(Бухара, 1992); на 2 и 3 Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1993; 1996); на Международной конференции "Механизмы развития: онтогенетические и филогенетические аспекты", (Москва, 1994); на Евроазиатском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии, (Анкара, 1995); на международной научной конференции "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы в организме",(Андижан, 1997); на 17 международна^ конференций, по биохимии и молекулярной биологии(Сан-Франциско, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 работы, в том числе 2 авторских свидетельства и 1 методическая рекомендация.
Автор выражает глубочайшую благодарность и признательность своему учителю и научному консультанту академику Д.Х.Хамидову, а также д.б.н. Л.Я.Юкельсону за неоценимое внимание и помощь при обсуждении планов
и результатов исследований. Искренне признателен моим коллегам к.б.н. М.Б.Хафизовой, к.м.н. И.И.Парилис, Е.Ю.Казанову, к.б.н. Д.Б.Мирходжаеву, к.б.н М.Ш.Акра-мову, к.б.н. Р.Д.Хамидову, к.б.н. Ч.И.Исанбаеву, к.б.н. Г.И .Аллаяровой, А.Мамаджанову и ныне покойному А.В.Лим за содействие в выполнении ряда экспериментов настоящей работы и техническую помощь.
Материалы и методы исследования Объекты исследования: водные экстракты тканей эндемичных видов рыб, земноводных, рептилий, птиц, яды змей, слюна варана, сыворотка крови человека, аминокислотные составы и первичные структуры нейротрофинов. Активность ФРН определяли биотестом при культивировании сенсорных спинальных и симпатических ганглиев 7-10 дневных зародышей кур, инкубированных при 37С в течении 18-24 часов в среде, содержащей различные концентрации исследуемых образцов (Levi-Montalcini R.,1968; Оленев С.Н., 1969), а также в культуре клеток крысиной феохромоцитомы РС-12 (Greene L.,1977). О присутствии ФРН судили по появлению нейритного обрамления "нимба" волокон вокруг ганглия, оценивая его густоту по 5 балльной шкале (Fenton Е., 1970). Активность ФРН выражали в биологических единицах (БЕ): одна БЕ соответствовала минимальному количеству белка в 1 мл среды, приводящего к образованию плотного "нимба" волокон . В экспериментах по подавлению активности ФРН антителами, ФРН выдерживали с различными концентрациями антител в культуральной среде в течение 4-5 ч при комнатной температуре перед добавлением к ганглиям. Антитела к ФРН получены из гипериммунной сыворотки барана. Схема иммунизации: 1 мг мышиного 7S ФРН в 0,15М NaCl, эмульгированным в двукратном объеме полного адъюванта Фрейнда подкожно, подхлестывающие инъекции по 1 мг ФРН в неполном адъюванте с 5-недельными интервалами 5 раз в течении б месяцев. В последнюю инъекцию ввели 0,5 мг (3-ФРН. Проверку титров проводили двойной диффузией (Ouchterloni N., 1952) в 1,5% агаровых пластинках. Кровь собирали через 7 дней после последнего введения, отделяли сыворотку центрифугированием и лиофилизирова-ли. Определение количества белка в растворе осуществляли спектрофогометрически по поглощению при 280 нм и методом Лоури (Lowry О. et al., 1954). Гельфильтрацию и ионообменную хроматографию на сефадексах, TSK- гелях
и на КМ-целлюлозе выполняли согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Ультрафильтрацию проводили под давлением 4 кг\см2 при использовании фильтров РМ-10 Amicon. Аналитический электрофорез в 7,5% ПААГе рН 8,3 (Маурер Т., 1971) проводили в течение 1,5-2 часов, гели окрашивали 0,1% раствором Кумасси Р-250. ДСН-электрофорез - по методу Леммли (Laemmli U., 1970) в 12% ПААГе, используя трис-глициновый буфер с рН 8,6, содержащий 0,1% ДСН. Определение аминокислотного состава белка осуществляли после гидролиза образца в дважды перегнанной соляной кислоте при температуре 105С в течение 24 часов на автоматическом аминокислотном анализаторе Biotronic LC 7200 (Германия). Расчет евклидовых расстояний осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ "KEY". Определение консервативных фрагментов в аминокислотной последовательности нейротрофинов проводили при использовании компьютерной программы "Protein Adviser".
