Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1. ФРН и его роль в развитии и функционировании нервной системы 10
2. Антигенные особенности мозга и механизмы запуска аутоиммунных реакций 21
3. Психический дизонтогенез и его проявления у детей раннего возраста 31
Глава II. Материалы и методы исследования 42
1. Материалы 42
1.1. Экспериментальные животные 42
1.2. Группы пациентов 42
1.3. Приготовление образцов сыворотки крови 49
2. Методы 49
2.1. Выделение и очистка ФРН из спермы быка 49
2.2. Определение концентрации белка 50
2.3. SDS-электрофорез в полиакриаламидном геле 50
2.4. Денситометрирование полиакриламидных гелей 51
2.5. Иммунизация животных 51
2.6. Определение уровня ААТ к ФРН и С А в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа 52
2.7. Поведенческие эксперименты 53
2.7.1. Тест "Открытое поле" 54
2.7.2. Тест "Приподнятый крестообразный лабиринт" 55
2.7.3. Тест на способность к сохранению и удержанию информации 56
2.7.4. Тест "Горячая пластина" 56
2.8. Статистическая обработка результатов 56
Глава III. Результаты исследовании 57
1. Выделение ФРН 57
1.1. Выделение и очистка ФРН из спермы быка 57
1.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 57
2. Экспериментально-биологическое исследование 58
2.1. AT к ФРН и СА в крови иммунизированных самок мышей и их потомства 58
2.2. Влияние AT к ФРН и С А на общее физическое развитие молодых животных 61
2.3. Влияние AT к ФРН и СА на двигательную активность и уровень эмоциональности молодых животных 63
2.4. Влияние AT к ФРН и СА на процесс обучения молодых животных 65
2.5. Влияние AT к ФРН и СА на порог болевой чувствительности молодых животных 69
3. Клинико-биологическое исследование 70
3.1. ААТ к ФРН в сыворотке крови здоровых детей в первые месяцы и годы жизни 70
3.2. ААТ к ФРН в сыворотке крови детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы 72
3.2.1. ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы (первое обследование) 73
3.2.2. ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы (повторное обследование) 76
3.2.3. ААТ к ФРН в сыворотки крови матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы 78
3.3. ААТ к ФРН в сыворотке крови детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы 80
3.3.1. ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы (первое обследование) 81
3.3.2. ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы (повторное обследование) 83
3.3.3. ААТ к ФРН в сыворотки крови матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы 86
3.4. ААТ к ФРН в сыворотке крови детей с психическим дизонтогенезом депривационной природы 88
Обсуждение результатов 92
Выводы 105
Список литературы 106
- Определение концентрации белка
- Экспериментально-биологическое исследование
- ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы (повторное обследование)
- ААТ к ФРН в сыворотки крови матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы
Введение к работе
По современным представлениям в основе ряда нервно-психических заболеваний человека (шизофрения, умственная отсталость, синдром Ретта, детский церебральный паралич, некоторые формы эпилепсии) лежат структурно-функциональные нарушения, возникающие на ранних этапах развития мозга (Graham М., et al., 1987, Reiss A.L., et al., 1993, Weinberger D.D., 1995, Alva-Moncayo E., et al., 2004). Первым клиническим проявлением таких нарушений является изменение последовательности, ритма и темпа процессов созревания основных нервно-психических функций, которое носит название психического дизонтогенеза. В зависимости от преобладающего влияния того или иного этиологического фактора различают психический дизонтогенез экзогенной, эндогенной и социальной, или депривационной природы (Вроно М.Ш., 1979, Ковалев В.В., 1981, ПроселковаМ.О., 1996).
Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о вовлеченности иммунной системы в формирование нарушений развития мозга. На это вовлечение указывает, в частности, выявление высокого уровня аутоантител к различным антигенам нервной ткани у детей с перинатальными нарушениями ЦНС (Poletaev А.В., 1996, Грудень М.А. с соавт., 1998, Сергиенко Н.С. с соавт., 2000).
С нашей точки зрения, одним из наиболее "перспективных" нейроантигенов при изучении аутоиммунных реакций является фактор роста нервов (ФРН) - белок, который играет ключевую роль в процессе созревания и дифференцировки ряда клеточных элементов нервной ткани (Levi-Montalcini R., 1987, Longi F.M. et al., 1993, Crowley C. et al., 1994, Bibel M., Barde Y.A.,
2000). В экспериментальных исследованиях неоднократно показано, что связывания ФРН антителами на ранних этапах развития приводит к возникновению различных структурных аномалий в развивающейся нервной системе (Levi-Montalcini R., Booker В., 1960, Rohrer Н., et al., 1988, Ruit K.G., et al., 1992). Высокий уровень аутоантител (AAT) к ФРН выявлен при различных патологических состояниях и заболеваниях, обусловленных нарушением развития нервной системы, таких как ранняя детская шизофрения, болезнь Ретта, нарушения ритма сердца при синдроме Романо-Уорда и синдроме слабости синусового узла, ранний детский аутизм (Туркова И.Л., 1998, Козловская Г.В. с соавт., 2000, Ларионова А.Л. с соавт., 2000, Klushmk Т.Р., et al., 2001). Однако, детальных исследований, касающихся изучения роли этих ААТ при различных формах нарушения развития нервной системы, выявляемых в раннем возрасте, а также динамического наблюдения за этим показателем в ходе развития до настоящего времени не проводилось. Не изучалась также взаимосвязь между уровнем ААТ к ФРН у детей с нарушениями развития нервной системы и их матерей. Для решения этих вопросов нами было использовано два взаимодополняющих друг друга подхода.
Суть первого - экспериментально-биологического подхода - состояла в том, чтобы выяснить, способны ли антитела к ФРН повлиять на пренатальное развитие нервной системы мыши и на поведение молодых животных. Следует отметить, что эксперименты такого рода были проведены впервые.
Выполнение данного раздела работы позволило сформулировать гипотезу о возможной патогенетической роли ААТ к ФРН в формировании нарушений развития нервной системы, проявляющихся на клиническом уровне в форме психического дизонтогенеза, а также наметить пути ее проверки.
Эта проверка была осуществлена на основе реализации второго -клинико-билогического подхода. Его суть состояла в выявлении и анализе корреляций между уровнем ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом и особенностями их клинического состояния (формой и/или этапом психического дизонтогенеза, его тяжестью), а также между уровнем ААТ к ФРН в крови этих детей и их матерей.
Полученные при выполнении данного раздела работы результаты подтвердили справедливость сформулированной выше гипотезы о возможной патогенетической роли ААТ к ФРН в формировании нарушений развития нервной системы. Вместе с тем, данный вывод не исключает возможности участия в формировании этих нарушений ААТ к иным антигенам нервной ткани.
На основании вышесказанного цель настоящей работы состояла в изучении роли аутоиммунных реакций к ФРН в формировании различных форм нарушений развития нервной системы.
Задачи исследования:
Изучить в эксперименте на мышах линии BALB/c влияние материнских антител к ФРН на поведенческие реакции и общее физическое развитие молодых животных.
Определить уровень ААТ к ФРН в сыворотке крови здоровых детей первых месяцев и лет жизни.
Определить уровень сывороточных ААТ к ФРН у детей первого года жизни с психическим дизонтогенезом различной природы (экзогенной, эндогенной и депривационной).
Исследовать уровень ААТ к ФРН в сыворотке крови детей с психическим дизонтогенезом в возрастной динамике во взаимосвязи с особенностями их нервно-психического развития.
Определить уровень ААТ к ФРН в сыворотке крови матерей детей с психическим дизонтогенезом и проанализировать взаимосвязь между уровнем этих ААТ у матерей и различными клиническими вариантами психического дизонтогенеза у детей.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые проведено сравнительное изучение уровня ААТ к нейротрофину ФРН у детей с различными формами психического дизонтогенеза в возрастной динамике, в зависимости от характера их дальнейшего развития и тяжести исходного нарушения, а также исследована взаимосвязь этого показателя у детей и их матерей. Выявленные клинико-биологические корреляции, а также результаты экспериментальных исследований на животных свидетельствуют о вовлеченности ААТ к ФРН в процесс формирования нарушений развития нервной системы.
Практическая значимость.
Выявленные в работе взаимосвязи позволяют использовать показатель уровня ААТ к ФРН в сыворотке крови детей первых месяцев жизни в качестве иммунохимического маркера, свидетельствующего о нарушении развития их нервной системы.
Наблюдение за уровнем ААТ к ФРН в крови детей первых месяцев и лет жизни дает возможность использовать этот показатель в качестве дополнительного дифференциально-диагностического, а также прогностического показателя развития детей.
Выявление высокого уровня ААТ к ФРН в крови женщин является фактором риска рождения у них детей с теми или иными нарушениями развития нервной системы.
Полученные результаты послужили основой для разработки лабораторного варианта иммунохимической тест-системы, которая апробирована в качестве дополнительного способа диагностики перинатальных поражений нервной системы в Научном центре здоровья детей РАМН.
Определение концентрации белка
Концентрацию выделенного ФРН определяли методом Лоури (Lowry O.N., et al., 1951). Для проведения количественной оценки была построена калибровочная кривая с использованием в качестве стандарта коммерческого препарата лиофилизированного бычьего сывороточного альбумина ("Sigma", США).
2.3. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.
Для анализа степени чистоты препарата ФРН использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Леммли (Laemmli U.K., et al., 1970). Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле толщиной 0.75 мм, содержащем 0.2М додецилсульфата натрия, с использованием камеры для электрофореза "MIGHTY SMALL ("Hoefer", США). Продолжительность электрофореза составляла 35-40 мин при 40 мА.
Определение молекулярной массы белков проводили с использованием стандартов молекулярной массы (LMW) ("Pharmacia").
После электрофореза гели окрашивали 0.1М Кумасси R-250 или методом серебрения (Morrissey J.H., 1981).
2.4. Денситометрирование полиакриламидных гелей.
Полиакриламидных гели денситометрировали на лазерном денситометре фирмы "BioMed Instruments" (США) по программе фирмы-изготовителя.
2.5. Иммунизация животных.
После периода адаптации животные (п=23) были разделены на 3 группы. Животные 1 группы (п=8) были иммунизированы фактором роста нервов (ФРН), 2 группы (п=8) - бычьим сывороточным альбумином (СА) (фракция V) ("Sigma", США). Животные 3 группы (п=7) служили контролем и получали инъекции физиологического раствора. Иммунизацию мышей проводили по следующей схеме: каждый антиген вводили четырехкратно в дозе 10 мкг в 300 мкл физраствора в полном адъюванте ФреЙнда (ПАФ) (в соотношении 1:1) подкожно в 5-6 точек в зоны лимфатических узлов с интервалом 14 дней. Контрольные животные получали инъекции физраствора также в ПАФ.
Самок тестировали на уровень AT к соответствующим антигенам каждые 7 дней в течение иммунизации. По достижении высокого уровня AT самок спаривали с самцами. Повторный забор крови у самок проводили через месяц после окончания иммунизации. Через 4-6 недель в каждой группе было получено потомств (п=42): 15 мышат - от самок, иммунизированных ФРН, 12 мышат - от самок, иммунизированных СА и 15 мышат - от контрольных животных. Через месяц после рождения мышат взвешивали, а затем исследовали их поведенческие реакции. Забор крови у молодых животных осуществляли до и после тестирования.
Экспериментально-биологическое исследование
В работе были использованы 23 половозрелые самки мышей линии Balb/c, которые были разделены на три группы;
Животные 1 группы были иммунизированы ФРН (п=8), животные 2 группы - С А (п=8), животные 3 группы (контрольной) получали инъекции физиологического раствора (п=7).
Схема иммунизации подробно описана в п. 2.5. раздела "Материалы и методы". Каждые 7 дней в течение иммунизации самок тестировали на уровень AT к соответствующим антигенам; а по достижении высокого уровня AT самок спаривали с самцами.
Результаты определения уровня сывороточных AT к белкам ФРН и СА у самок исследуемых групп представлены на рис.5.
В 1 группе средний уровень AT к ФРН составил 0.84 ± 0.24 D, во 2 группе уровень AT к С А был равен 1.86 ± 0.18 D. Эти значения резко превышали соответствующие контрольные показатели (0.02 ± 0.004 D и 0.018 ± 0.008 D, р 0.001 (U-критерий Манна-Уитни)). Выраженность иммунного ответа на ФРН в 1 группе животных была в 2-4 раза ниже таковой на СА во 2 группе.
Дополнительно было проведено определение уровня AT к СА у животных 1 группы и уровня AT к ФРН у животных 2 группы. Полученные результаты составили соответственно 0.013 + 0.004 D и 0.023 ± 0.005 D и не отличались от значений контрольной группы.
Повторное определение уровня сывороточных AT у иммунизированных самок, проведенное через месяц, показало, что с течением времени титр антител существенно не изменился (достоверное отличие от контрольной группы р 0.001).
- достоверные отличия от контроля (р 0.001).
Через 4-6 недель от самок в каждой группе было получено потомство (п=42): 15 мышат - от самок, иммунизированных ФРН (7 группа), 12 мышат - от самок, иммунизированных С А (2 группа) и 15 мышат от контрольных животных (3 группа). Взятие крови у молодых животных для определения уровня AT к ФРН и СА проводили в возрасте 1 месяца.
Результаты определения уровня сывороточных AT у потомства самок мышей, иммунизированных ФРН и С А, представлены на рис.6.
Уровень AT к ФРН и СА в 1 и 2 группе составил соответственно 0.4 ± 0.17 D и 1.66 ± 0.59 D, что существенно превышало соответствующие значения в контроле (0.019 ± 0.007 D и 0.038 ± 0.014 D, р 0.001 (U-критерий Манна-Уитни)). Между собой группы также достоверно отличались по исследуемому показателю (р 0.001). При этом у потомства сохранялась наибольшая выраженность иммунного ответа к СА по сравнению с ФРН, выявленная у их матерей (2-4-кратные различия, р 0.001).
Уровень AT к СА у молодых животных 1 группы и уровень AT к ФРН у животных 2 группы (0.041 ± 0.016 D и 0.029 ± 0.003 D) не отличался от контрольного.
Не выявлено корреляций между уровнем AT к ФРН и СА в крови иммунизированных самок и их потомства.
Проведенное к концу второго месяца жизни детенышей повторное определение AT в их крови показало, что уровень сывороточных AT к ФРН и СА соответственно для детенышей I и 2 группы существенно снизился и практически не отличался от контрольных значений (р=0.2, р=0.1 соответственно).
Таким образом, можно заключить, что высокий уровень антител к белкам ФРН и СА в крови иммунизированных беременных самок сопровождается аналогичным повышением этих AT в крови потомства. При этом выраженность иммунного ответа на сывороточный альбумин в несколько раз выше, чем на фактор роста нервов, как у взрослых животных, так и у детенышей, что, вероятно, связано с различной иммуногенностью этих антигенов для мышей. Выявленное повышение уровня антител у матерей остается стойким на протяжении длительного периода времени, а у их детенышей носит транзиторный характер и уже ко второму месяцу жизни наблюдается снижение исследуемых показателей до нормальных (фоновых) значений.
ААТ к ФРН в крови детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы (повторное обследование)
У части детей с признаками ЗПМР (49 человек) в последующие годы была прослежена динамика их нервно-психического развития и уровня ААТ к ФРН. В целом по группе средний уровень ААТ к ФРН при повторном обследовании детей в возрасте от I года до 3 лет составил 0.87 + 0.22 D и был по-прежнему выше соответствующего показателя контрольной группы (0.76 D ± 0.1 D, р 0.01 (U-тест Манна-Уитни)).
Вместе с тем, психомоторное развитие детей при повторном клиническом обследовании оказалось различным. У большинства детей (69%) наблюдалась относительная компенсация имеющихся нарушений, а в ряде случаев развитие приблизилось к возрастной норме. У этих детей отмечалось появление новых поведенческих навыков, экспрессивной и импрессивной речи, улучшались статомоторные функции. КПР у детей с положительной динамикой развития увеличился и составил 95 ± 0 баллов.
И лишь в 31% случаев какая-либо динамика развития либо отсутствовала, либо наблюдалось дальнейшее усугубление имеющихся нарушений. КПР у этих детей при повторном обследовании составил 88 + 5.7 баллов.
В соответствии с динамикой развития все повторно обследуемые дети были разделены на 2 подгруппы: 1-я подгруппа - с позитивной динамикой развития и 2-я подгруппа - с отсутствием таковой. Для каждой из обследованных подгрупп был определен средний уровень ААТ к ФРН.
В 1 подгруппе детей средний уровень ААТ к ФРН достоверно снизился по сравнению с первоначальным показателем (0.75 ± 0.16 D, р 0.01) и не отличался от показателя контрольной группы (0.76 ±0.1 D). Во 2 подгруппе детей уровень ААТ к ФРН, по-прежнему, оставался высоким (0.96 ± 0.18 D), достоверно превышая как контрольное значение (р 0.001), так и соответствующий показатель 1 подгруппы (р 0.001) (U-тест Манна-Уитни).
В группе детей с положительной динамикой развития выявлена значимая отрицательная корреляционная связь между уровнем ААТ к ФРН и возрастом ребенка (R = - 0.33, р 0.05), что согласуется с приведенными выше результатами динамики этих антител.
Данные, отражающие динамику уровня ААТ к ФРН в выделенных подгруппах детей, приведены на рис.13.
Таким образом, приведенные в данной главе данные позволяют заключить, что задержки психомоторного развития разной степени тяжести вследствие воздействия неблагоприятных экзогенных факторов во внутриутробном и раннем постнатальном периоде сопровождаются повышением уровня ААТ к ФРН в сыворотке крови детей, коррелирующим с тяжестью повреждения мозга.
Для большинства случаев это повышение уровня ААТ, также как и задержки психомоторного развития, являются транзиторными и через 1-2 года наблюдается относительная компенсация выявленных ранее нарушений и нормализация уровня ААТ к ФРН. Вместе с тем, в ряде случаев (31%) позитивной динамики развития не наблюдается, такое отсутствие компенсации нарушений сопровождается дальнейшим повышением уровня ААТ к ФРН в сыворотке крови ребенка.
ААТ к ФРН в сыворотке крови матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы.
Средний уровень ААТ к ФРН у матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом экзогенной природы составил 0.93 ± 0.17 D, что превышает соответствующий показатель контрольной группы (женщины аналогичного возраста, родившие здоровых детей) - 0.78 ± 0.13 D (р 0.001, U-критерий Манна-Уитни). На рис.14 приведены результаты определения уровня ААТ к ФРН у матерей обследованных детей с дизонтогенезом экзогенной природы и матерей здоровых детей.
Уровень сывороточных ААТ к ФРН у обследованных матерей варьировал в пределах от 0.54 до 1.33 D. В связи с этим все женщины были разделены на 2 подгруппы: в I подгруппу вошли 27 женщин с нормальным уровнем ААТ (0.78 ± 0.09 D) ("нормальный" диапазон), во 2 подгруппу - 30 женщин, уровень ААТ к ФРН в сыворотке крови которых превышал нормальные значения (1.08 ±0.11 D) ("высокий" диапазон). Достоверность отличий между подгруппами составила р 0.001 (U-критерий Манна-Уитни).
ААТ к ФРН в сыворотки крови матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы
Уровень ААТ к ФРН в сыворотке крови матерей обследованных детей с ИПР составил 1.02 ± 0.23 D, что достоверно выше аналогичного показателя у матерей здоровых детей - 0.78 ± 0.13 D (р 0.001) и матерей обследованных детей с ЗПМР (0.93 ± 0.17 D (рис.14)) (р 0.05, U-критерий Манна-Уитни).
На рис.17 приведены результаты определения уровня ААТ к ФРН у матерей обследованных детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы и матерей здоровых детей.
Уровень сывороточных ААТ к ФРН у обследованных матерей варьировал в пределах от 0.57 до 1.68 D. В зависимости от уровня ААТ матери обследованных детей с симптомами ИПР были разделены на 2 подгруппы. В 1 подгруппу вошла 21 женщина со средним нормальным уровнем ААТ к ФРН (0.83 ± 0.096 D) ("нормальный" диапазон), 2 подгруппу составили 46 женщин со значениями показателя, превышающими нормальные (1.2 ± 0.19 D) ("высокий" диапазон). Достоверность отличий между выделенными подгруппами составила р 0.001.
В связи с малочисленностью подгрупп к "нормальному" диапазону значений (М контр ± а контр) были также отнесены "низкий" и "пониженный" поддиапазоны (М контр - 2а контр, М контр ± 2а контр), а к "высокому" -"повышенный" и "высокий"поддипазоны (М контр + 2 о контр, М контр ± 2 а контр). Частота встречаемости нормальных и высоких значений уровня ААТ к ФРН у обследованных матерей составила 31% и 69% соответственно.
Далее для каждой подгруппы матерей была определена частота встречаемости нормальных и высоких значений уровня ААТ к ФРН у их детей с психическим дизонтогенезом эндогенной природы. Полученные результаты представлены в таблице 10.
Как видно из таблицы 10, высокий уровень ААТ у матерей обследованных детей с эндогенным дизонтогенезом встречается гораздо чаще по сравнению с группой матерей детей с проявлениями экзогенного дизонтогенеза (69% и 52% соответственно) (таблица 8).
В подгруппе матерей, имеющих высокий уровень ААТ к ФРН, выявлена наибольшая частота встречаемости высоких значений уровня антител у их детей по сравнению с подгруппой матерей с нормальным уровнем антител (80% и 15% детей соответственно).
Коэффициент корреляции между уровнем ААТ у обследованных женщин и их детей составил R = 0.48 (р 0.05).
Для исследования нарушений развития нервной системы депривационного генеза была отобрана группа детей из детского дома (п=38) в возрасте от 1 до 4 лет, у которых наблюдалась характерная триада клинических признаков: задержки развития, эмоциональная дефицитарность и псевдоаутистические расстройства (Башина В.М., 1980). Нервно-психическое развитие обследованных детей-сирот с депривационным дизонтогенезом носило дефицитарный, но одновременно с этим поступательный характер. Кроме этого, для детей этой группы были типичны разнообразные соматопсихические нарушения в виде расстройств сна, булимии, нейродермитов, бронхитов, а также однообразные стереотипные действия, квалифицируемые как заместительное поведение.
Было отмечено, что не у всех детей, воспитывающихся в условиях детского дома, наблюдались клинические признаки задержки психического развития депривационного генеза. При детальном клиническом осмотре у 30% детей из детского дома были выявлены задержки психического развития на фоне органических повреждений мозга, а у 35% детей - искажение развития (рис.18). В контрольную группу вошли 65 здоровых детей соответствующего возраста и п
