Получение и иммунохимический анализ рекомбинантных фактора роста эндотелия сосудов и его первого растворимого рецептора Леопольд, Анна Владимировна

Введение к работе

. Актуальность исследования.

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является основным регулятором образования новых кровеносных сосудов как в норме, так и при патологии (Chung et Ferrara 2011). Клетки злокачественных опухолей легких, желудка, молочной железы, мозга активно синтезируют VEGF, стимулирующий образование сети кровеносных сосудов, необходимой для удовлетворения метаболических потребностей опухоли (Jain et al. 2006). Таким образом, VEGF является привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии (Pourgholami et Morris 2008). Кроме того, повышение содержания VEGF в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, внутриглазной жидкости зачастую служит маркером заболеваний, связанных с патологическим ангиогенезом (Smerdel et al. 2010, Zhou et Wang 2012, Niizeki et al.2012). Следовательно, получение рекомбинантного высокоочищенного VEGF, иммунохимически идентичного нативному является необходимым начальным этапом как для получения моноклональных антител к нему, так и для разработки способов его количественного определения в биологических жидкостях. VEGF связывается с двумя тирозинкиназными рецепторами VEGFR-2 и VEGFR-1, причем последний связывает VEGF во много раз сильнее, чем VEGFR-2 (Kd_VEGFR-1=15pM, в то время как Kd_VEGFR-2=750pM) (Koch et al. 2011, Robinson et Stringer 2001). За счет альтернативного сплайсинга образуется растворимая изоформа VEGFR-1 (sVEGFR-1 или sFlt-1), аминокислотная последовательность которой соответствует части внеклеточного домена VEGFR-1 (Jebbink et al. 2011, Koch et al. 2011). Основную роль в связывании VEGF как с его первым, так и с его вторым рецептором играют 2-я и 3-я иммуноглобулин-подобные петли внеклеточного домена VEGFR-1 (Koch et al. 2011). Таким образом, функционально активный рекомбинантный белок, содержащий лиганд-связывающий участок внеклеточного VEGF- связывающего домена VEGFR-1 сам по себе может являться альтернативой моноклональным антителам к VEGF и использоваться как для детекции содержания VEGF в биологических жидкостях, так и для подавления VEGF- зависимой васкуляризации злокачественных опухолей (Gonsalves et al. 2007, Holash et al. 2002). Несмотря на возможность получения рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в различных эукариотических системах экспрессии (начиная от дрожжей и заканчивая клетками млекопитающих) разработка генетических конструкций, способных к эффективной экспрессии рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в E.coli продолжает оставаться весьма актуальной задачей, в силу таких преимуществ использования данной системы экспрессии как простота культивирования и короткий период генерации, упрощающий подбор оптимальных условий для экспрессии соответствующего рекомбинантного белка (Waegeman et Soetaert, 2011).

Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный VEGF иммунохимически идентичный нативному и также рекомбинантный лиганд- связывающий биологически активный фрагмент экстраклеточного домена его первого рецептора VEGFR-1 (Flt-1).

Задачи исследования:

1. Получить штамм E.coli эффективно продуцирующий рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов крысы VEGF.

2. Получить штаммы E.coli эффективно продуцирующие рекомбинантные, VEGF-связывающие фрагменты растворимого первого рецептора фактора роста эндотелия сосудов человека sVEGFR-1 (sFlt-1).

3. Разработать метод очистки рекомбинантного VEGF и рекомбинантных лиганд-связывающих фрагментов sFlt-1 из клеток E.coli .

4. Разработать метод ренатурации рекомбинантного, лиганд-связывающего фрагмента sFlt-1.

5. Разработать метод количественного лиганд-рецепторного анализа VEGF и sFlt-1 на основе рекомбинантных растворимых VEGF и и sFlt-1.

6. Исследовать влияние рекомбинантного растворимого лиганд-

связывающего фрагмента sFlt-1 на восстановление поврежденного

монослоя глиомных клеток глиомы крысы С6.

Научная новизна исследования.

В ходе исследования впервые произведено сравнение эффективности использования различных экспрессирующих конструкций (произведено сравнение эффективности четырех плазмидных конструкций в обоих случаях) для наработки рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в E.coli. Впервые показана возможность разработки высокочувствительного лиганд- рецепторного анализа для количественного определения VEGF и sVEGFR-1 на основе биотинилированных рекомбинантных VEGF и trx| sFlt-1(2-3). Впервые показано, что trx|sFlt-1 ингибирует миграцию глиомных клеток глиомы С6 в монослойной культуре in vitro.

Практическое значение работы.

5. 1. Полученные рекомбинантные белки могут использоваться для иммунизации животных с целью получения моноклональных и поликлональных анти-VEGF и анти-sVEGFR-! антител.

   2. Разработанный лиганд-рецепторный анализ на основе рекомбинантных биотинилированных VEGF и sVEGFR-1 может использоваться для определения концентрации VEGF и sVEGFR-1 в биологических жидкостях.

   3. Растворимый VEGF-связывающий рекомбинантный фрагмент экстраклеточного домена VEGFR-1 c N-терминальным белком слияния тиоредоксином (trx| sFlt-1 (2-3)) полученный в E.coli может использоваться для анти-VEGF терапии.

   Положения выносимые на защиту.

   1. Использование сконструированных в ходе работы экспрессирующих конструкций pQE80L/VEGF, pQE60/sFlt-1(1-3) и pET32a/sFlt-1(2-3)

   позволяет получать значительные количества рекомбинантных иммунохимически идентичных нативным белков фактора роста эндотелия сосудов VEGF и фрагментов внеклеточного домена его первого растворимого рецептора sVEGFR-1(sFlt-1(1-3) и sFlt-1(2-3)) в E.coli.

   5. 3. 1. Лиганд-рецепторный анализ с использованием рекомбинантных VEGF и trx|sFlt-1(2-3), позволяет определять VEGF в диапазоне концентраций 1-125 нг/мл, а его рецептор (VEGFR-1) в диапазоне концентраций 2-250 нг/мл.

         2. Рекомбинантный trx|sFlt-1(2-3) ингибирует восстановление монослоя глиомных клеток глиомы С6.

         Внедрение результатов исследования.

         Полученные в ходе работы рекомбинантные белки активно использовались для иммунизации мышей с целью получения моноклональных анти-VEGF и анти-sFlt-1 антител в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского».

         Апробация работы.

         Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011) и на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им. Пирогова и сотрудников отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского» от 29 марта 2012 г.

         Публикации.

         По теме работы было опубликовано 3 статьи в рецензируемых ВАК журналах.

         Объем и структура работы.

         Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 9 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы включающего 153 источника, из которых 152 на английском и 1 на русском языке.

         Похожие диссертации на Получение и иммунохимический анализ рекомбинантных фактора роста эндотелия сосудов и его первого растворимого рецептора

         Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа : получение рекомбинантного препарата, моноклональных антител и системы направленного транспортаКорчагина, Анна Александровна

         

         Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудовШевченко, Евгений Константинович

         Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6Шеин, Сергей Александрович

         

         Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в крови больных первичными новообразованиями костей Кузнецова Ольга Матвеевна

         Факторы роста нервов в филогенезе (выделение, характеристика, компьютерный анализ)Салихов, Рустамхан Сабирович

         

         Новый эффективный подход для получения рекомбинантных белков основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF- (TRII-ED) в E. coliЕлистратов, Павел Алексеевич

         

         Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам (НСБ). Получение, иммунохимический анализ, исследование гематоэнцефалического барьераГурина Ольга Ивановна

         Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источниковЗаинкова, Наталья Вячеславовна

         

         Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеинаПавлов Константин Александрович

         Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispaТкачева, Екатерина Сергеевна