Введение к работе
Актуальность проблемы. Ишемические заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, ишемический инсульт и хроническая ишемия нижних конечностей продолжают лидировать в списке причин смертности населения развитых стран. Медикаментозное лечение таких заболеваний недостаточно эффективно, а существующие хирургические и эндоваскулярные методы не всегда применимы и не обеспечивают полноценного восстановления кровоснабжения тканей у тяжелых категорий больных. Поэтому на сегодняшний день имеется острая необходимость внедрения в клиническую практику новых методов лечения этих заболеваний. Альтернативным подходом является терапевтический ангиогенез. Суть метода, основанного на современных представлениях о молекулярных и клеточных механизмах формирования и поддержания стабильности сосудистой сети, заключается в экзогенной стимуляции роста и развития сосудов в ишемизированной ткани путем создания в ней повышенной концентрации ангиогенных факторов роста [Gupta, 2009].
Тактика терапевтического ангиогенеза развивается в трех направлениях: использование экзогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков, генетических конструкций с генами этих факторов и стволовых и прогениторных клеток, секретирующих эти факторы. По всем трём направлениям были достигнуты значительные успехи в экспериментальных работах [Yla-Herttuala, 2007; Haider, 2006]. Однако контролируемые клинические испытания показали, что как использование рекомбинантных факторов роста, так и их генов не дало однозначных результатов и ожидаемой эффективности при лечении хронической ишемии нижних конечностей и ишемической болезни сердца [Gupta, 2009]. Что касается клеточной терапии, то в большинстве контролируемых испытаний получены достоверные, но весьма скромные результаты, касающиеся эффективности этого подхода в улучшении кровоснабжения миокарда и нижних конечностей [Losordo, 2010]. Применение рекомбинантных факторов роста ограничено их высокой стоимостью, необходимостью длительного и многократного введения для стимуляции роста сосудов, опасностью их системной диссеминации и нежелательной стимуляции ангиогенеза в латентных опухолях [Yla-Herttuala, 2007]. При обсуждении причин недостаточной эффективности генной и клеточной терапии при заболеваниях ишемического генеза указывают в случае генной терапии на низкую эффективность трансфекции тканей человека и недостаточную длительность экспрессии трансгена при использовании безопасных плазмидных конструкций, а также иммунные реакции и опасность инсерционного мутагенеза, ограничивающие использование эффективных вирусных конструкций [Gupta, 2009; Ishikawa, 2011; Shimamura, Morishita, 2011]. Наиболее существенной проблемой клеточной терапии является гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную, ишемизированную ткань и снижение регенеративных свойств клеток у пожилых больных с длительно существующим патологическим процессом [El-Ftesi, 2009; Huang, 2010; Katsara, 2011; Madonna, 2011; Sun, 2011].
Поэтому в настоящее время интенсивно разрабатываются способы повышения эффективности генной и клеточной терапии. Одним из таких подходов является увеличение терапевтических свойств клеток за счёт генетического модифицирования [Myers, 2010; Hodgkinson, 2010]. Клетки, полученные из организма пациента, модифицируют in vitro генетическими конструкциями, несущими гены биологически
активных факторов, наращивают до необходимого количества и затем ретрансплантируют. Поскольку стимуляция роста сосудов при трансплантации стволовых и прогениторных клеток осуществляется в значительной степени за счет секреции ими широкого спектра ангиогенных факторов [Mirotsou, 2011], модификация клеток с помощью генетических конструкций, кодирующих гены этих факторов, позволит увеличить паракринные эффекты трансплантируемых клеток и повысить их терапевтические свойства. Трансплантация клеток, модифицированных вирусными конструкциями, не вызывает такого сильного иммунного ответа организма, как в случае с использованием некоторых вирусных векторов in vivo [Griffin, 2010]. Кроме того генетическая модификация позволяет повысить выживаемость клеток при трансплантации и значительно уменьшить необходимое для эффективной терапии количество клеток [Iwaguro, 2002].
Перспективы клеточной терапии многих заболеваний связывают с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), получаемых из костного мозга и жировой ткани [Boyle, 2010; Mathiasen, 2010;Volarevic, 2011]. Причем МСК из жировой ткани, обладая теми же свойствами, как и МСК из костного мозга, значительно легче получить из-за доступности жировой ткани в достаточно большом количестве при малоинвазивной и безболезненной процедуре ограниченной липосакции. Для обозначения этой популяции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток широко используется термин стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) (Adipose stromal cells), который мы также использовали в данной работе. Сегодня МСК жировой ткани рассматриваются как наиболее перспективный тип стволовых клеток взрослого организма для аутологической трансплантации [Madonna, 2009; Murohara, 2009; Bailey, 2010; Gimble, 2011].
Цель работы: получить генетически модифицированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, гиперпродуцирующие фактор роста сосудистого эндотелия VEGF165, и оценить эффективность стимуляции роста сосудов при трансплантации этих клеток на моделях ангиогенеза у экспериментальных животных.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:
Оценить эффективность трансфекции СКЖТ человека плазмидной конструкцией и вирусной трансдукции с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса.
Получить СКЖТ человека, гиперсекретирующие фактор роста сосудистого эндотелия VEGF165.
Исследовать влияние генетического модифицирования на пролиферацию, выживаемость, адгезионные свойства, их способность к адипогенной, остеогенной и эндотелиальной дифференцировке;
Исследовать влияние генетической модификации на экспрессию ангиогенных факторов СКЖТ.
Изучить способность СКЖТ человека, гиперсекретирующих VEGF165, стимулировать ангиогенез на модели подкожной имплантации матригеля у иммунодефицитных мышей.
Изучить влияние трансплантации СКЖТ человека, гиперсекретирующих VEGF165, на восстановление кровотока и формирование сосудистой сети в ишемизированных конечностях у иммунодефицитных мышей.
Оценить выживаемость модифицированных СКЖТ человека и длительность экспрессии трансгена после трансплантации в ишемизированные скелетные мышцы мыши.
Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса, одного из наиболее безопасных для человека, можно с высокой эффективностью осуществить генетическое модифицирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Исследовано влияние генетического модифицирования СКЖТ человека на их пролиферативную активность и адгезионные свойства, выживаемость и способность к дифференцировкам. Впервые показано увеличение экспрессии фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1 в модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих VEGF165. Получены данные о более эффективном восстановлении кровотока, развитии сосудистой сети и уменьшении доли некроза мышцы на модели ишемии задней конечности у иммунодефицитных мышей после внутримышечной трансплантации модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих VEGF165, по сравнению с ^модифицированными клетками.
Практическая значимость работы. Разработанный метод генетической
модификации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани
с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса может быть
использован в научно-исследователькой работе для получения модифицированных
мезенхимальных стромальных клеток. Полученные в работе данные об ангиогенном
терапевтическом потенциале модифицированных СКЖТ человека,
гиперсекретирующих VEGF, могут быть положены в основу разработки клинически пригодного метода терапевтического ангиогенеза, основанного на трансплантации в ишемизированные ткани модифицированных СКЖТ для лечения больных с критической ишемией нижних конечностей.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ и Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и ФГУ и используются в педагогической деятельности Факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова при чтении курса лекций по молекулярной медицине.
Часть работы выполнена в рамках Государственного контракта № 02.740.11.0307 от 7 июля 2009 года по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Апробация диссертации состоялась 18 июля 2011 года на заседании межлабораторного семинара НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» Минздравсоцразвития РФ. Результаты диссертационной работы были представлены на отечественных и международных конференциях: 6 IFATS Meeting (Тулуза, Франция, 2008), World conference on regenerative medicine (Лейпциг, Германия, 2011), ISSCR 8th Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2010), Advanced symposium and EMBO practical course «Viral vectors in gene therapy: applications & novel production methods» (Куопио, Финляндия, 2010), Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), 4th International
Meeting on Angiogenesis. «Therapeutic angiogenesis in skeletal muscle: combining gene and cell therapy for gene delivery» (Амстердам, Нидерланды, 2011).
Публикации. Результаты работы представлены в 4 статьях и в 11 тезисах докладов.
Структура работы. Диссертация представлена на страницах; состоит из
введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов
исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка
цитируемой литературы. Работа содержит рисунков и таблицы. Список
литературы включает источников.
