Введение к работе
Актуальность проблемы. Ишемические заболевания сердца и нижних конечностей, возникающие вследствие стенозирующего поражения сосудов, входят в ряд наиболее распространенных причин инвалидизации и смертности населения развитых стран. Несмотря на внедрение эффективных методов медикаментозного лечения, хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации, остается значительная часть больных, неподходящих для лечения этими методами или у которых с помощью этих методов удается лишь частично восстановить кровоснабжения тканей.
Раскрытие механизмов, регулирующих рост и ремоделирование сосудов, позволило разработать новую тактику лечения больных, основанную на введении в ишемизированные ткани ангиогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков или генетических конструкций для стимуляции прорастания сосудов и улучшения их кровоснабжения и функции. Позже с этой целью стали использовать стволовые и прогениторные клетки. Эта тактика получила название терапевтический ангиогенез [Hockel М ].
Для стимуляции ангиогенеза с помощью генной терапии используются гены ростовых факторов, которые в подавляющем большинстве являются секретируемыми белками. Большое число экспериментальных данных свидетельствует о том, что даже непродолжительная трансгенная гиперэкспрессия таких факторов роста в ограниченном числе клеток ткани приводит к возрастанию их продукции, достаточному для стимуляции роста сосудов [Takeshita S et.a!.1994;Lewis B.S., 1997; Schwarz Е. ].
В исследованиях на животных и в неконтролируемых клинических испытаниях по введению в ишемизированные ткани факторов роста или их генов были получены очень обнадеживающие результаты позволяющие надеяться, что ишемию миокарда и нижних конечностей таким способом можно лечить [Isner J. Et.al.l995;Losordo D.et.al.1998; Yia-Herttuala S.,2000]. Однако в большинстве недавно завершенных плацебо контролируемых двойных слепых испытаниях не было получено бесспорных доказательств эффективности лечения ишемии с помощью рекомбинантных белков или генов факторов роста [Yla-Herttuala S. ; Grines С ; Kastrup J. ]. Возможными причинами неудачи считаются использование одного фактора для стимуляции такого сложного и многоступенчатого процесса как ангиогенез, кратковременное действие ангиогенного фактора, неадекватные дозы и способы введения.
В связи с этим особую актуальность приобретает поиск оптимальных
сочетаний ангиогенных факторов и новых факторов с полифункциональной;
активностью. I
Запуск образования новых сосудов происходит в тканях при
увеличении экспрессии факторов роста, прежде всего VEGF,
стимулирующего пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, увеличивающего сосудистую проницаемость. Экспрессия этого фактора и рецепторов к нему, а также ряда других ангиогенных факторов регулируется
на уровне транскрипции в условиях гипоксии (Jiang ВН 1996, Cormier-Regard.S.1998, Feldser D 1999, Tazuke SI, 1998, Semenza GL 2000). Однако, одного только увеличения экспрессии факторов роста, недостаточно ни для запуска ангиогенеза, ни для ремоделирования сосудов в ходе адаптивного артериогенеза. Многие факторы роста связываются с белками межклеточного матрикса, что снижает концентрацию свободного белка, способного связаться с рецепторами на клеточной поверхности, а некоторые из факторов секретируются клетками в неактивном состоянии и затем подвергаются протеолитической активации [Saksela О, Rifkin DB, 1990; Plouet J. ]. Помимо этого, для процесса неоваскуляризации необходимо разрушение связей между эндотелиальными клетками, базальной мембраны и внеклеточного матрикса, чтобы освободить клетки и пространство для их миграции и пролиферации, экстравазации моноцитов, обеспечивающих рост сосудов [Carmeliet р. ].
Ключевым регулятором внеклеточного протеолиза, запускающим каскад протеолитических реакций на поверхности клетки, обеспечивающим образование и рост сосудов, является урокиназный активатор плазминогена или урокиназа (иРА). Связываясь со специфическим рецептором на клеточной мембране, урокиназа активирует плазмин в строго определенных участках поверхности клетки, который в свою очередь активирует матриксные металлопротеазы, разрушающие основные белки внеклеточного матрикса, обеспечивая пространство для движения клетки [Blasi F, 1999; Bobik A.,Tkachuk V.,2003]. Помимо этого протеазы активируют и высвобождают из матрикса большинство ангиогенных факторов, необходимых для пролиферации, миграции и инвазии клеток [Naldini L. ; Plouet J. ]. И, наконец, урокиназа, взаимодействуя со своим рецептором и другими белками на поверхности клетки, модулирует внутриклеточную сигнализацию, обеспечивающую направленное движение клетки [Dumler I. ; Степанова В.В., Ткачук В.А.,2002]. Урокиназа стимулирует развитие стенозов артерий после экспериментальной ангиопластики за счет стимуляции пролиферации и миграции гладкомышечных клеток медии и клеток неоинтимы, привлечения моноцитов/макрофагов в сосудистую стенку[Р1ек1іапоуа О. ; Parfyonova . 2004]. Большинство из этих процессов ответственны и за развитие адаптивного артериогенеза при ишемии тканей. Прямые доказательства важной роли урокиназы в ангиогенезе получены в работах на трансгенных мышах, нокаутированных по гену урокиназы. У них подавлен артериогенез при ишемии задних конечностей [Deindl, ], а VEGF не способен стимулировать ангиогенез в периинфарктной зоне сердца, в то время как у диких мышей он оказывает выраженный ангиогенный эффект [Heymans S. et al., 1999]. Эти данные свидетельствуют о том, что урокиназа - необходимый посредник ангиогенных эффектов факторов роста. Мы полагаем, что увеличение синтеза урокиназы в зоне ишемии могло бы стимулировать ангиогенез и усиливать эффекты факторов роста. Для проверки этой гипотезы мы исследовали влияние транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы на ангио-артериогенез в периинфрктной зоне сердца крысы и в ишемизированной задней конечности юэысы и мыши. .
Целью работы было изучение возможности стимуляции неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью прямого введения в них плазмид с кДНК урокиназы на моделях ишемии скелетных мышц и миокарда у животных.
В рамках реализации этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:
-
Изучить влияние гипоксии на экспрессию и продукцию урокиназы эндотелиальными клетками человека и накопление урокиназы в среде культивирования этих клеток.
-
Исследовать динамику экспрессии урокиназы в ишемизированном миокарде периинфарктной зоны сердца крысы
-
Сконструировать плазмидные векторы, несущие кДНК человеческой, мышиной и крысиной урокиназы, человеческого VEGF и маркерного гена бета-галактозидазы. Исследовать функциональную активность полученных плазмид на культурах клеток.
-
Исследовать эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при прямом введении плазмиды с маркерным геном бета-галактозидазы; оценить длительность экспрессии трансгенов в ишемизированном миокарде крысы с помощью вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР.
-
Изучить влияние прямого внутримиокардиального введения плазмид с кДНК урокиназы на ангио- артериогенез в периинфарктной зоне и размер инфаркта миокарда у крысы.
-
Изучить влияние прямого внутримышечного введения плазмид с кДНК урокиназы на ангиогенез и восстановление кровотока в ишемизированной задней конечности крысы и мыши, сравнить с эффектом VEGF и оценить эффект совместного введения двух генов (урокиназы и VEGF); оценить влияние генной терапии на развитие отека конечности.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе было впервые показано, что трансгенная экспрессия урокиназы в ишемизированных скелетных мышцах и миокарде путем прямого введения плазмид несущих кДНК урокиназы стимулирует ангио-артериогенез и ускоряет восстановление кровотока в ишемизированных тканях. Она не вызывает развития ангиом и отека тканей в месте введения. Совместное использование генов урокиназы и VEGF позволяет снизить дозу VEGF без потери эффективности.
Полученные данные указывают на урокиназу как на новый перспективный терапевтический ген для стимуляции ангио- артериогенеза в ишемизированных тканях.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на: the 74* Congress of the European Atherosclerosis Society, 17-20 April, 2004, Seville, Spain; American Heart Association Meeting , New Orleans, November 9-15, 2004; Workshop on Biology of Plasminogen activation, Washington, 2004; Национальном конгрессе кардиологов в Томске в 2004; 3-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», 20-24 января, 2004 года; Конференции молодых ученых России, 1-3 июня 2005 года (3-я премия) и на межлабораторном семинаре в Институте экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава 28 декабря 2005 года.
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Две статьи приняты в печать.
Структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками. Список литературы включает 280 источников.
