Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизм РНК-интерференции и перспективы применения
интерферирующих РНК в биомедицине {обзор литературы) 9
1.1 Механизм РНК-интерференции 9
1.1.1 Фаза инициации 11
1.1.1.1 Белок Дайсер 11
1.1.1.2 Процессинг дцРНК 11
1.1.1.3 Влияние структуры дцРНК на эффективность ее расщепления белком Дайсер 1.1.2 Эффекторная фаза 13
1.1.2.1 Сборка комплекса RLC 14
1.1.2.2 Белок Адо2 15
1.1.2.3 Сборка комплекса RISC 16
1'Л.2.4 Расщепление мРИК-мишени 19
1.1.3 Особенности протекания РНКи у различных организмов 20
1.2 Свойства и структура siPHK 22
1.2.1 Нуклеотидный состав siPHK... 23
1.2.1.1 Влияние мисматчей на эффективность действия siPHK. 24
1.2.2 Термодинамические параметры дуплекса 24
1.2.3 Влияние вторичной структуры мРНК-мишени на активность siPHK 26
1.2.4 Влияние длины зіРНКна её активность 27
1.2.5 Химически модифицированные siPHK 27
1.2.5.1 Влияние химических модификаций З'-и 5'- концов зіРНКна ее
биологическую активность 28
1.2.5.2 Влияние химических модификаций нуклвотидов и фосфатных группе составе э/РНКна ее биологическую активность 41
Модификация фосфата 41
Модификации рибозы 41
Модификации азотистых оснований 44
1.2.6 Специфичность действия siPHK 45
1.2.6.1 Индукция интерферонового ответа 46
1.2.6.2 Действие siPHK на экспрессию частично гомологичных генов 47
1.2.6.3 Конкуренция siPHK за компоненты комплекса RISC 48
1.3 Использование siPHK in vivo 48
1.3.1 Локальное применение 50
1.3.2 Системное применение 51
1.3.2.1 Гидродинамическая доставка 51
1.3.2.2 Рецептор- опосредованная доставка 52
1.4 Испытание siPHK на мышиных моделях заболеваний человека 53
1.4.1 Воспалительные заболевания 55
1.4.2 Онкологические заболевания 55
1.5 Заключение 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59
2.1 Материалы 59
2.1.1 Реактивы, препараты и оборудование 59
2.1.2 Линии клеток 59
2.1.3 Оли гону клеотиды 59
2.1.4 Буферы и растворы, использованные в работе 60
2.2 Методы 61
2.2.1 Электрофорез 61
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле 61
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 61
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нашивных условиях 62
2.2.2 Введение [32Р]-метки в 5'-концевое положение олигорибонуклеотидов
2.2.3 Введение остатка флуоресцеина в З'-концевое положение антисмысловои qennsiPHK 62
2.2.4 Гибридизация олигорибонуклеотидов (образование siPHK дуплекса) 63
2.2.5 Частичный гидролиз олигорибонуклеотида в денатурирующих условиях... 63
2.2.5.1 Статистическое расщепление олигорибонуклеотида 2 М имидазолом 63
2.2.5.2 Расщепление олигорибонуклеотида РНКазой Т1 в денатурирующих условиях 63
2.2.6 Исследование нуклеазоустойчивости siPHK в среде IMDM, содержащей 5%-нуюРВЭ 64
2.2.7 Исследование эффективности проникновения siPHK Е в клетки линии КВ-8 64
2.2.7.1 Трансфекция клеток siPHK. 64
2.2.7.2 Оценка проникновения siPHK в клетки 64
2.2.3 Выделение суммарной клеточной РНК 65
2.2.9 Измерение уровня экспрессии определенных генов в культивируемых
клетках методом ОТ-ПЦР 65
2.2.9.1 Обратная транскрипция 65
2.2.9.2 ПЦР 66
2.2.10 Определение чувствительности клеток к винбластину (МТТтест) 67
2.2.11 Измерение функциональной активности Р-гликопрстеина 67
2.2.12 Вестерн-блот анализ (определение количества белка Р-гликопротеина)„67
Глава 3. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с
помощью малых интерферирующих РНК (Результаты и обсуждение) 69
3.1 Выбор мишени 69
3.2 Характеристика использованных линий клеток 71
3.3 Исследование ингибирования экспрессии гена MDR1 под действием siPHK 73
3.3.1 Анализ проникновения siPHK в клетки КВ-8-5 в присутствии и отсутствие трансфецирующего реагента Олигофектамина 74
3.3.2 Влияние siPHK на уровень мРНК гена MDR1 76
3.3.3 Восстановление чувствительности клеток к цитостатикам под действием siPHK 77
3.4 Анализ специфичности действия используемых siPHK 79
3.5 Влияние выбора мишени в составе мРНК гена MDR1 на эффективность
подавления экспрессии этого гена под действием siPHK 83
3.5.1 Восстановление чувствительности клеток к винбластину под действием siPHK, направленных к различным участкам мРНКгена MDR1 83
3.5.2 Действие siPHK на клетки КВ-3-1 и КВ-8-5 при культивировании без винбластина 85
3.5.3. Влияние анти-MDR siPHK на уровень Р-гликопротеина 85
3.5.4 Влияние использования различных siPHK на функциональную активность Р-
гликопротеина 36
3.6. Химические модификации . ...91
3.6.1. Использованные химические модификации 91
3.6.2. Исследование сохранности SIPHKB культуральной среде 91
3.6.3. Биологическая активность siPHK и ее химически модифицированных
аналогов 96
3.6.3.1 Влияние на биологическую активность siPHK содержания в ее составе
полностью 2-0 метилированных цепей 96
3.6.3.2 Влияние на биологическую активность полностью 2'-0~ метилированной siPHK З'-З' инверсии 98
3.6.3.3 Влияние на проявление биологической активности siPHK цепей, содержащих 2'-0- метильных звена на 3'- выступающих концах, и З'-З' инверсию99
3.7. Продолжительность ингибирующего действия 99
3.8. Восстановление чувствительности клеток к сниженной концентрации винбластина под действием siPHK. 100
Выводы 105
Список литературы 106
Введение к работе
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) злокачественных новообразований - сохранение клетками жизнеспособности под воздействием широкого спектра лекарственных препаратов - является одной из основных причин неудач при лечении раковых заболеваний [1]. Раковые клетки, обладающие фенотипом МЛУ, становятся нечувствительными к химиотерапии независимо от комбинации применяемых лекарств. Феномен МЛУ имеет долговременный и стабильный характер, так как возникшая резистентность сохраняется в поколениях клеток. Большинство случаев проявления МЛУ связано с гиперэкспрессией гена MDR1, который кодирует трансмембранный белок Р-гликопротеин (Р-др) [2, 3], обеспечивающий активный АТР-зависимый транспорт из клеток цитотоксических препаратов различной структуры.
На сегодняшний день используется ряд соединений, разрешенных в медицинской практике, способных ингибировать активность Р-др и, таким образом, увеличивать внутриклеточную концентрацию химиопрепаратов и, соответственно, их токсическое действие на Р-др экспрессирующие раковые клетки как in vitro, так и in vivo [4-8]. Эффективность этих соединений тяжело поддается оценке вследствие сильного побочного действия, поэтому разработка эффективной и специфической стратегии для преодоления P-gp-опосредованного фенотипа МЛУ является актуальной проблемой как молекулярной биологии, так и медицины. Одним из возможных путей преодоления МЛУ и повышения эффективности лечения неоплазий могло бы стать избирательное подавление экспрессии гена MDR1 с помощью ген-направленных биологически активных препаратов, адресованных к мРНК гена MDR1, таких как антисмысловые олигонуклеотиды [9] и рибозимы [10], в сочетании с традиционной химиотерапией. Однако, на сегодняшний день существуют лишь немногочисленные примеры успешного подавления экспрессии мРНК, присутствующей в клетках в больших количествах или транскрибируемой с амплифицированных генов, как это происходит в случае MDR1 мРНК [11-13].
В настоящее время наиболее эффективным подходом к подавлению экспрессии генов является технология, основанная на явлении РНК-интерференции (РНКи), которая уже вскоре после открытия [14, 15] стала широко использоваться для этих целей [16, 17]. Суть явления заключается в том, что малые интерферирующие РНК (siPHK), попадая в клетку, вызывают специфическую деградацию мРНК-мишени, последовательность которой комплементарна антисмысловой цепи siPHK [18]. Показано, что siPHK действуют в наномолярных концентрациях и, таким образом, являются наиболее эффективным средством подавления экспрессии генов, siPHK нашли широкое применение в функциональной геномике [19-25], а также испытываются как перспективные терапевтические средства [26-30], К сожалению, отсутствие четких параметров выбора наиболее эффективных последовательностей siPHK и их невысокая стабильность в биологических жидкостях, клетках и тканях организма является существенным препятствием на пути их терапевтического применения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование процесса подавления экспрессии гена MDR1 и обращение фенотипа МЛУ под действием siPHK. В ходе исследования решались следующие задачи;
Выбор siPHK для подавления экспрессии гена MDR1, обладающих высокой биологической активностью и не вызывающих неспецифические эффекты.
Исследование биологической активности и устойчивости к действию нуклеаз siPHK, содержащих различные химические модификации.
class1 Механизм РНК-интерференции и перспективы применения
интерферирующих РНК в биомедицине {обзор литературы) class1
Механизм РНК-интерференции
Механизм РНКи наиболее подробно изучен у D.melanogaster, однако исследования, проведенные на других организмах, показали, что этот механизм достаточно консервативен и, в общих чертах, его можно разделить на два этапа (рис. 1). На первом этапе - фаза инициации - длинная дцРНК разрезается на короткие дуплексы длиной 21 - 23 нт (siPHK) РНКаза III подобным ферментом Дайсер ("Dicer", от английского "dice" - резать на мелкие кусочки). На втором этапе - эффекторная фаза, молекулы siPHK включаются в состав мультибелкового комплекса, называемого RISC (RNA-induced silencing complex, РНК-зависимый ингибирующий комплекс) [38], который после активации (RISC ) специфично связывается с РНК-мишенью и индуцирует ее эндонуклеазное расщепление. Благодаря образованию незащищенных концов РНК
Реактивы, препараты и оборудование
В работе использовали ДНК-полимеразу Taq, ревертазу M-MuLV (ЛБХФ, ИХБФМ СО РАН), Т4-полинуклеотидкиназу ("Fermentas», Литва), акриламид, N,N -метиленбисакриламид, ТЕМЕД, трис, EDTA, Na2EDTA, DMSO, ацетат натрия, бромфеноловый синий, ксиленцианол, среду IMDM, винбластин, FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин, трипсин, препарат poly(l:C) ("Sigma", США), МТТ, Хекст-33258, родамин-123, антитела мыши к Ртликопротеину и /З-актину человека, р кумаровую кислоту, люминол, 6-меркалтоэтанол, SDS ("Sigma", США), флуоресцеин, глицерин ("Serva", Германия), Олигофектамин ("invitrogen", США), у-32Р-АТР с удельной активностью более 1 ПБк/моль ("Биосан», Россия),
В работе использовали амплификатор OMN-E ("Hybaid", США); прибор для полусухого электропереноса ("Hoefer", США); многоканальный спектрофотометр Multiscan RC ("Labsystems", Финляндия); спектрофотометр BioMate 3 ("Thermo", США); флуоресцентный микроскоп Axioskop 2 Plus (увеличение 400х), оснащенный CCD камерой ("ZEISS", Германия); вакуумную сушку для акриламидных гелей ("LABCONCO", США); рН-метр "Orion 41ОА", счетчик радиоактивности; центрифуга "Eppendorf 5415" (Германия). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС" (Россия). В работе использовали культуральный пластик фирмы "Costar" (США).
class3 Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с
помощью малых интерферирующих РНК (Результаты и обсуждение) class3
Выбор мишени
К причинам низкой эффективности некоторых из использованных siPHK можно отнести участие последовательности мишени в образовании структурированных участков мРНК и во взаимодействии с белковыми факторами, а также эффективность образования комплекса RISC, связанное с термодинамическими характеристиками siPHK (см раздел 1.2.2) [121,148,149].
Известно, что активность антисмысловых олигонуклеотидов сильно зависит от вторичной структуры последовательности-мишени [150]. В ряде работ была показана корреляция между активностью антисмысловых олигонуклеотидов и соответствующих им по последовательностям siPHK [121, 149]. Тем не менее, наблюдались случаи, когда siPHK эффективно подавляли экспрессию гена, а гомологичные им антисмысловые олигонуклеотиды не оказывали подобного действия или наоборот [139].
Ранее [13, 292], была продемонстрирована возможность подавления экспрессии гена MDR1 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Была показана высокая степень корреляции данных об эффективности гибридизации олигонуклеотидов с мРНК MDR1 и эффективностью ингибирования ими экспрессии этой мРНК в клетках линии KB 8-5 (рис.11).
Похожие диссертации на Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК
