Содержание к диссертации
Список Сокращений 6
Введение 7
Глава 1. Онкогены семейства туе как терапевтические мишени
(обзор литературы) 9
1.1. Транскрипционные факторы семейства Мус 9
Биологические функции Мус 9
Структура белков семейства Мус 12
Регуляция транскрипции белками семейства MYC 14
Мус и Мах: структура и функции 14
Механизмы Мус-зависимой активации транскрипции 16
113.3. Механизмы Мус-зависимой репрессии транскрипции 17
1.1.3.4. Регуляция функции Мус и Мус-индуцируемый онкогенез 19
1.1.4. MYC как терапевтическая мишень 26
Блокирование взаимодействий Мус с Мах 28
Экспрессия токсинов под контролем Мус-регулируемых промоторов 30
114.3. Ингибирование экспрессии Мус 31
1.1.4.3.1. Антигенный подход 31
Триплекс-формирующие олигонуклеотиды 31
Соединения, стабилизирующие образование
G-тетраплексов 32
Антисмысловой подход.. 33
Рибозимы 35
РНК-интерференция и микроРНК. 36
Использование феномена РНК-интерференции в
молекулярной биологии 38
Специфичность действия интерферирующих РНК. 40
Ингибирование экспрессии генов семейства туе
с помощью интерферирующих РНК. 41
1.2. Длинные дцРНК как противоопухолевые агенты 42
1.2.1. Неспецифический клеточный ответ на двуцепочечную РНК 43
1.2.1.1. ДцРНК-зависимая протеинкиназа R 43
2'-5'-Олигоаденилатсинтетаза и РНКаза L 48
Toll-подобные рецепторы 48
Интерфероны 50
1.2.2. Потенциал интерферонового ответа в противоопухолевой терапии 53
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Материалы 55
Реактивы и препараты 55
Линии клеток 56
Олигонуклеотиды 56
Буферные растворы, использованные в работе 57
2.2. Методы 58
2.2.1. Ферментативный синтез siPHK 58
Получение дцДНК-матриц в реакции с фрагментом Кленова... 58
In vitro транскрипция 58
Выделение in vitro транскриптов 58
Гибридизация РНК-транскриптов и гидролиз РНКазой Т1 59
Введение 32Р-метки по З'-концу РНК 59
Статистическое расщепление олигорибонуклеотидов ЕхЗ-AS
и ЕхЗ-S 2 М имидазолом 59
Гибридизация химически синтезированных олигорибонуклеотидов.... 59
Выделение суммарной клеточной РНК 60
Ферментативный синтез длинной дцРНК 60
Обратная транскрипция 60
Амплификация фрагментов генов с-тус и EGFP. 61
In vitro транскрипция 61
Гибридизация РНК-транскриптов и очистка целевых дцРНК.. 61
Клеточные культуры и трансфекция 61
Измерение уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР 62
2.2.8.1. Обратная транскрипция 62
2.2.8.2 ПЦР 62
2.2.8.3. ПЦР в режиме реального времени 64
2.2.10. Вестерн блот анализ 64
Определение количества живых клеток (МТТ-тест) 65
Определение эффективности накопления siPHK в клетках 65
Введение остатка флуоресцеина в siPHK. 65
Анализ проникновения siPHK в клетки 66
2.2.13. Электрофорез 67
Электрофорез в ПААГ. 67
Электросрорез в агарозном геле 67
2.2.14. Статистика 67
Глава 3. Ингибирование экспрессии онкогенов семейства туе и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью
двуцепочечных интерферирующих РНК (результаты и обсуждение) 68
3.1. Результаты 68
3.1.1. siPHK как ингибиторы экспрессии генов семейства туе 68
Выбор последовательностей siPHK. 68
Получение siPHK. 70
Подавление экспрессии генов семейства туе
с помощью siPHK. 74
3.1.1.3.1. Подавление экспрессии гена с-тус с помощью
siPHK в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC 77
Проникновение меченной флуоресцеином siPHK
$іЕхЗ в клеточные линии разного происхождения 83
3.1.1.3.2. Подавление экспрессии гена N-myc с помощью
siPHK siEx2 в клетках IMR-32. 85
3.1.1.4. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1
и нейробластом SK-N-MC и IMR-32 с помощью siPHK. 85
3.1.2. Длинные дцРНК как неспецифические ингибиторы экспрессии
генов семейства туе и пролиферации раковых клеток человека 92
Получение длинных дцРНК. , 93
Подавление экспрессии гена с-тус с помощью длинных дцРНК
в клетках карциномы КВ-3-1 и нейробластомы SK-N-MC 93
3.1.2.3. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1 и
нейробластом SK-N-MC и IMR-32 с помощью длинных дцРНК... 98
3.1.3. Динамика изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа
под действием siPHK и длинных дцРНК в раковых клетках человека 104
3.1.3.1. Изменение уровня экспрессии генов OAS1 и PKR под действием
коротких siPHK и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ-3-1
и нейробластомы SK-N-MC 104
3.1.3.2. Изменение уровня экспрессии в-актина под действием коротких
siPHK и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ-3-1 и
нейробластомы SK-N-MC 108
3.2. Обсуждение результатов 115
3.2.1. Специфическое подавление экспрессии генов с-тус и N-myc
и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью siPHK 115
3.2.2. Неспецифическое подавление экспрессии гена с-тус и пролиферации
раковых клеток человека с помощью siPHK и длинных дцРНК 121
3.2.3. Синергическое подавление экспрессии гена с-тус препаратом
dsMyc по специфическому и неспецифическому механизмам 124
3.2.4. Изменение уровня экспрессии генов-маркеров интерферонового
ответа под действием siPHK и протяженных дцРНК 125
Заключение 427
Выводы 128
Список литературы 129
мРНК
ДЦРНК
siPHK
miPHK
RISC
RNAP
Трис
TEMED
EDTA
DMSO
ВЭЖХ
ПААГ
dNTP
ОТ-ПЦР
H. П.Н.
poly(l:C)
HEPES
FITC
DMEM
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
дезоксирибонуклеиновая кислота
рибонуклеиновая кислота
матричная (информационная) РНК
двуцепочечная РНК
малая интерферирующая РНК
микроРНК
РНК-зависимый ингибирующий комплекс
РНК-полимераза
Toll-подобные рецепторы
интерферон
трис-(оксиметил)-аминометан
МХЫ'.М'-тетраметилэтилендиамин
этилендиаминтетрауксусная кислота
1,4-дитиотреитол диметилсульфоксид аденозин-5'-трифосфат додецилсульфат натрия
высокоэффективная жидкостная хроматография полиакриламидный гель рибонуклеозидтрифосфаты дезоксирибонуклеозидтрифосфаты обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция нуклеотид пар нуклеотидов
3-(4,5-диметилтиазолил)-2,5-дифенилтетразолиум бромида дцРНК-зависимая-2-5"-олигоаденилатсинтетаза дцРНК-зависимая протеинкиназа R Рг-микроглобулин
поли-инозиновая-поли-цитидиловая кислота бычий сывороточный альбумин 4(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота флуоресцеин-5-изотиоцианат фосфатный солевой буфер культуральная среда Дульбекко эмбриональная телячья сыворотка
Введение к работе
Транскрипционные факторы семейства Мус (с-Мус и N-Myc) участвуют в контроле пролиферации клеток, их дифференцировке и канцерогенезе. Эти факторы рассматриваются как перспективные терапевтические мишени, так как они стоят в начале каскада сигнальных событий, приводящих к злокачественному перерождению клеток. Гиперэкспрессия гена с-тус наблюдается в таких опухолях, как миеломы, лимфомы, карциномы, нейробластомы и др., в то время как N-myc играет ключевую роль при развитии ретинобластом и нейробластом - опухолей, наиболее часто встречающихся у детей. Традиционные схемы лечения нейробластом, а также некоторых других типов опухолей, включают а-интерферон и ретиноевую кислоту, которые оказывают ингибирующее действие на экспрессию генов семейства туе и индуцируют дифференцировку опухолевых клеток. Однако в случае мутаций, затрагивающих регуляторные районы генов туе, опухоли становятся резистентными к такому лечению [1, 2]. Кроме того, в некотрых типах нейробластом, например в клетках линии IMR-32, подавление экспрессии гена N-myc с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводит к активации онкогена с-тус [3], т.е. наблюдается их перекрестная регуляция. Следовательно, для ингибирования пролиферации клеток таких опухолей необходимо одновременное подавление экспрессии генов с-тус и N-myc. Идентификация высокоэффективных и специфичных ингибиторов экспрессии генов семейства туе является актуальной задачей при разработке противоопухолевых препаратов.
Двуцепочечные РНК рассматриваются как перспективные препараты для применения в терапии, благодаря их уникальной способности запускать в клетках процесс РНК-интерференции, приводящий к специфической дефадации мРНК гомологичных им генов. Выбор высокоэффективных siPHK, направленных на подавление экспрессии как гена с-тус, так и N-myc, позволит использовать их для ингибирования пролиферации разных типов нейробластом, а также преодолеть перекрестную активацию этих онкогенов.
Помимо создания siPHK, действующих по механизму РНК-интерференции и вызывающих направленное расщепление специфических мРНК, особый интерес представляет использование длинных дцРНК, способных активировать интерфероновый ответ, вызывающий неспецифическое ингибирование синтеза мРНК и белка, и индуцирующий гибель клеток путем апоптоза [4]. Известно, что интерфероны способны специфически регулировать экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл, в том числе генов семейства туе (с-тус и N-myc) [5]. Одним из подходов к снижению экспрессии гена с-тус может стать применение длинных двуцепочечных РНК, гомологичных по последовательности участкам мРНК этого гена. Можно ожидать, что такие дцРНК будут ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, действуя сразу на
двух уровнях регуляции по механизму РНК-интерференции и активируя неспецифический интерфероновый ответ.
Целью данной работы являлось создание специфических ингибиторов экспрессии протоонкогенов с-тус и N-myc и индукторов интерферонового ответа на основе двуцепочечных РНК и исследование их действия на пролиферацию раковых клеток человека различного происхождения. Были поставлены следующие задачи:
Получить с помощью ферментативного синтеза siPHK и протяженные дцРНК, соответствующие различным участкам генов с-тус и N-myc и исследовать их действие на экспрессию генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-MC и IMR-32.
Исследовать действие полученных siPHK и дцРНК на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения.
3. Исследовать динамику изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа
под действием siPHK и дцРНК.
