Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль метаболитов ненасыщенных жирных кислот во внутриклеточной сигнализации 8
1.1. Основные представления о внутриклеточной сигнализации
1.1.1. Внутриклеточные посредники передачи сигнала 9
1.1.2. МАР-киназы в передаче внутриклеточного сигнала 11
1.2. ФЛАг и основные пути окисления арахидоно вой и линолевой кислот 12
1.2.1 ФЛАг и регуляция ее активности 12
1.2.2.0сновные пути ферментативного окисления арахидоновой и линолевой кислот 13
1.2,3. Участие арахидоновой кислоты и продуктов окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот воо внутриклеточной сигналиизации 16
1.3. Роль ненасыщенных жирных кислот в регуляции основных клеточных функций... 18
1.3.1.Участие продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в воспалительных реакциях 18
1.3.2. Роль ненасыщенных жирных кислот и продуктов их окисления в пролиферации и гибели клеток 20
Резюме 22
ГЛАВА 2, Метабол ненасыщенных жирных кислот в опухолевых клетках 25
2.1. Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток 26
2.2. Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток 29
Резюме 32
ГЛАВА 3. Радиационный апоптоз тимоцитов 33
3.1. Апоптоз тимоцитов в норме 33
3.2. Апоптоз тимоцитов после облучения (феноменология) 34
3.3. О некоторых аспектах генной регуляции радиационного апоптоза 35
3.4. О внутриклеточной сигнализации при радиационном апоптозе тимоцитов 37
3.5. Роль мембран в радиационном апоптозе тимоцитов 40
Резюме 43
Экспериментальная часть. Материалы и методы исследования
1. Объект исследования 44
2. Ингибиторный анализ 44
3. Методы определения апоптоза 45
4. Выделение белка из тимоцитов 46
5. Выделение 15-липоксигеназыизретикулоцитов 46
6. Определение активности 15-липоксигеназы 47
Результаты исследований и их обсуждение.
Часть 1. Исследование метаболизма ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток лимфолейкоза Р388 48
1.1. Исследование действия общих ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на клетки лимфолейкоза Р388 48
1.2. Исследование действия специфических ингибиторов липоксигеназ на клетки лимфолейкоза Р388 52
1.3. Исследование действия продукта циклооксигеназы - простагландина Ег на клетки лимфолейкоза Р388 57
Резюме 61
Часть 2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в гибели нормальных лимфоидных клеток 62
2.1. Исследование действия неспецифических ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты 62
2.2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели тимоцитов 64
2.3. Исследование действия продукта 15-липоксигеназы на интактные тимоцйты крыс in vitro 70
Резюме 72
Часть 3. Исследование активности 15-ЛО при радиационном апоптозе тимоцитов 74
3.1. Отработка оптимальных условий измерения активности 15-липоксигеназы 74
3.2. Исследование активности 15-липоксигеназы спленоцитов крысы 76
3.3. Исследование активности 15-липоксигеназы в интактных и облученных тимоцитах 77
Резюме 80
Заключение 81
Выводы 84
Список литературы 85
- МАР-киназы в передаче внутриклеточного сигнала
- Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток
- О некоторых аспектах генной регуляции радиационного апоптоза
- Исследование действия продукта циклооксигеназы - простагландина Ег на клетки лимфолейкоза Р388
Введение к работе
Межклеточная и внутриклеточная сигнализация участвует в регуляции гибели, пролиферации и дифференцировки клеток в организме. Показано, что существует несколько основных сигнальных систем, специфичных не только для типа клеток, но и для сигналов. Это означает, что один и тот же сигнал может включать в разных клетках разные системы сигнализации и приводить к разным клеточным ответам. Известно также, что многие мутации, приводящие к трансформации клеток, являются мутациями генов сигнализации, что позволяет трансформированной клетке не реагировать на контролирующие сигналы организма и размножаться до образования макроскопических опухолей. В идеале, при химиотерапии опухолей препарат должен вызывать гибель опухолевых клеток и не действовать на нормальные клетки. Этот идеал, однако, пока не реализован и существует мнение, что он в принципе невозможен. Традиционная химиотерапия опухолей базируется, в основном, на селективном поражении делящихся клеток и при этом вместе с опухолевыми клетками погибают также нормальные делящиеся клетки, за счёт которых осуществляется регенерация крови, иммунной системы и всех эпителиев, В результате при химиотерапии происходит нарушение кроветворения, иммунитета и поражение различных эпителиев.
Имеются отдельные и противоречивые данные о том, что в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток задействованы метаболиты ненасыщенных жирных кислот. Так, например, лейкотриены - продукты 5-ЛО стимулируют пролиферацию лейкемических клеток, а в клетках эритролейкемии, нейробластомы и меланомы наработка этих продуктов увеличивается во время программируемой гибели клеток. Показано также, что в некоторых типах опухолей изменена, по сравнению с нормальными тканями сигнализация метаболитами ненасыщенных жирных кислот. В частности для деления и выживания опухолевых клеток эпителиального происхождения (рак толстой кишки, предстательной железы) необходимы продукты циклооксигеназ, в то время как в нормальных клетках простагландины являются агентами, участвующими в воспалительных реакциях клетки. Поддержание концентрации этих продуктов на необходимом высоком уровне в опухолевых клетках обеспечивается благодаря экспрессии дополнительной циклооксигеназы: циклооксигеназы 2. Такое различие в сигнализации между нормальными и опухолевыми клетками можно использовать для настоящей селективной химиотерапии. И действительно, ингибиторы циклооксигеназ
подавляют рост этих опухолей, а эпидемиологические исследования показывают снижение частоты рака этих локализаций у людей, постоянно принимающих такой ингибитор циклооксигеназ, как аспирин.
Другим основным способом терапии опухолей является радиотерапия. При радиотерапии также повреждаются не только опухолевые, но и нормальные клетки. Особенно чувствительны к радиации тимоциты, при дифференцировке которых формируется Т-клеточный иммунитет. Кроме того, при облучении могут активироваться события, связанные с метаболизмом ненасыщенных жирных кислот. Поэтому кроме изучения различий в сигнализации нормальных и опухолевых клеток в решении вопросов терапии опухолей, важно и исследование механизмов гибели нормальных клеток, в частности механизма радиационного апоптоза иммунных клеток. Известны многие мессенджеры и ферменты, опосредующие радиационную гибель клеток, однако данные о роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели нормальных клеток отсутствуют.
Целью настоящей работы явилось исследование роли внутриклеточной сигнализации, осуществляемой метаболитами ненасыщенных жирных кислот, в регуляции пролиферации и гибели опухолевых и нормальных лимфоидных клеток.
В работе были поставлены следующие задачи:
Оценить роль продуктов различных липоксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388 на стационарной и логарифмической стадиях роста.
Исследовать роль продуктов циклооксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388.
Исследовать действие ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты.
Оценить участие 5-липоксигеназы, 12-липоксигеназы и 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов методом ингибиторного анализа.
Изучить роль продуктов 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов.
Изучить активность 15-липоксигеназы тимоцитов в норме и после облучения и оценить ее возможную роль в регуляции радиационного апоптоза.
МАР-киназы в передаче внутриклеточного сигнала
Передача сигнала от клеточной поверхности к ядру происходит через каскад последовательного фосфорилирования протеинкиназ. На последней ступени находятся МАР-киназы (mitogen activated protein kinases), субстратами которых обычно являются факторы транскрипции.
Митогенактивируемые киназы являются важными ферментами, участвующими в регуляции пролиферации клеток, к активации МАР-киназ сводятся многие ферментативные каскады. Так, фактор роста тромбоцитов (PDGF), EGF, инсулиновый фактор роста (IGF) через активацию гена ras активируют внеклеточную митогенактивнруемую киназу (МАРК) (Leevers, 1992; Ruderman, 1991). Известно, в частности, что МАР-киназы регулируют транскрипцию гена, кодирующего циклин D, -один из позитивных регуляторов клеточного цикла (Епифанова, 2003). В МАР-каскаде протеинкиназы, фосфорилирующие каждую последующую митогенактивируемую протеинкиназу, играют роль в усилении стимулирующего сигнала или его «выключении», а также имеют большое значение для ядерной сигнализации - активированная терминальная МАР-киназа может мигрировать в ядро и там фосфорилировать и активировать транскрипционные факторы. Весь процесс передачи митогенного сигнала от момента взаимодействия фактора роста с рецептором до начала экспрессии генов пролиферативного ответа занимает 8-10 минут.
Существуют три группы киназ, входящих в семейство МАР-киназ. Повреждения ДНК, ингибиторы метаболизма, провоспалительные цитокины, ростовые факторы и другие факторы стресса, включая ультрафиолетовую радиацию, термический и осмотический шок, активируют группы JNK (c-Jun Nerminal kinase) и р38, так называемые стресс активируемые киназы (stress activated protein kinases - SAPKs) (Davis, 2000). Третья группа киназ - ERK (extracellular signal regulated kinases) связана с клеточной выживаемостью, в то время как две другие в основном опосредуют события апоптоза.
МАР-киназы считаются ферментами, объединяющими рецепторную поверхность клеток с критическими внутриклеточными мишенями, отвечая на химические и физические стрессы, а МАР-киназный каскад - главным механизмом, контролирующим транскрипцию генов эукариот (Seger and Krebs, 1995).
Активация тирозинкиназы ростовыми факторами и цитокинами может приводить к активации фосфолипазы Аг (Peppelenbosch et al., 1992). Было высказано предположение, что тирозинкиназа непосредственно активирует ФЛАг, возможно это происходит через агрегацию мембранных рецепторов, однако прямых данных в пользу этого нет. ФЛАг является основным ферментом, ответственным за образование свободной арахидоновой кислоты (АК) и лизофосфолипидов из фосфолипидов мембран. Показано, что активацию метаболизма свободной арахидоновой кислоты вызывают многие митогенные факторы, такие как PDGF, EGF, инсулин (Bandyopadhyay et al.,I988), фактор некроза опухолей TNFa (Topley et al., 1989), лимфокины, стимулирующие иммунную систему, например, интелейкин 1 (ИЛ-1) (Maier et al., 1990), интерферон-а (Hannigan and Williams, 1991). ПКС, активируемая диацилглицерином, тоже может стимулировать ФЛАг, активируя при этом высвобождение липидов из мембран (Whatley et al., 1990). ПКС может активировать АК независимо от ПТК. ФЛАг являются цитозольными, Са2+-зависимыми и Са2+-независимыми ферментами - активируются при миллимолярной концентрации внутриклеточного Са2+. Кальциевые ионофоры и другие агенты, повышающие внутриклеточную концентрацию свободного кальция, увеличивают активность ФЛАг. Предполагают, что ДАГ может изменять активность фосфолипазы Аг, вызывая структурные перестройки мембранных липидов (Zidovetzki et al., 1992). Активность ФЛАг значительно увеличивается вследствие включения ДАГ в фосфолипидный субстрат (фосфотидилхолин). Показано, что глюкокортикоиды вызывают синтез белков, липокортинов, ингибирующих ФЛАг. Липокортины связывают ионы Са2+, содержат участки гликозилирования и фосфорилируются различными киназами. Показано, что липокортины образуют комплекс с ФЛАг, а последняя освобождается из комплекса при активации клетки и фосфорилировании липокортина (Touqui et al., 1986). Представляют интерес данные, что неэстерифицированные полиненасыщенные і жирные кислоты и продукты их окисления - эйкозаноиды могут выступать в качестве эндогенных блокаторов активности ФЛАг, окислительные же превращения, например, арахидоновой или олеиновой кислоты, ослабляют их блокирующее действие. Аналоги а-токоферола ингибируют синтез эйкозаноидов путем избирательного блокирования ФЛАг, производные витамина Д регулируют метаболизм АК путем прямого влияния на ФЛАг (Крутецкая, Лебедев., 1993). Эффективным блокатором ФЛАг является п-бромфенацилбромид. Бромфенацилбромид необратимо алкилирует остаток гастидина (Гис-48), входящий в состав активного центра фермента. 1.2-2. Основные пути ферментативного окисления арахидоновой и линолевой кислот. Существует несколько путей образования АК: 1. При активации ФЛАг АК высвобождается из фосфолипидов мембран. Фосфолипазы Аг являются эстеразами, которые специфически катализируют гидролиз сложноэфирной связи между жирной кислотой и глицерофосфолипидом молекулы фосфолипида. Гидролизуемые фосфолипиды могут включать в себя фосфотидилхолин, фосфотадилэтаноламин, фоосфотидилсерин, фосфотидилинозитиды, фосфатидную кислоту и плазмалогены. В результате этой реакции образуется арахидоновая кислота и лизофосфолипид. 2. АК способна освобождаться из ДАГ, образуемого ФЛС, через реакцию диацилирования диглицеридлипазой. 3. АК может освобождаться из фосфатидной кислоты, образуемой при фосфорилировании ДАГ фосфолипазой Д, под действием ФЛА2. Общепринятой точкой зрения считается, что рецепторопосредованное освобождение АК происходит преимущественно через активацию ФЛАг. Фосфотидилхолин является первичным субстратом для ФЛАг- Это подтверждается недавними работами, где показано, что клеточное деление лимфоцитов сопровождается метаболизмом мембранных липидов. Важную роль в реализации пролиферативных стимулов лимфоцитов играет Са2+-независимая фосфолипаза А2 (Roshak., 2000). Аналогичным образом, по-видимому, освобождаются и другие жирные кислоты, в частности линолевая кислота. В отличие от АК линолевая кислота (ЛК) кроме фосфолипидов содержится в триацилглицерине, и главным образом освобождается из этого соединения (Muller:, 2002). Основные пути окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот во внутриклеточной сигнализации изображены на схеме, стр. 24. Освобожденные АК и ЛК претерпевают быстрое ферментативное окисление по месту двойных связей с образованием широкого спектра производных — эйкозаноидов. Известны три ферментативных пути окисления АК и ЛК - с помощью липоксигеназ, циклооксигеназ и эпоксигеназ (цитохром-Р450-подобных ферментов). Тип окисления ненасыщенных жирных кислот определяется набором ферментов, которым обладает клетка.
Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток
Несмотря на большинство данных о необходимости ненасыщенных жирных кислот и их продуктов в пролиферации и выживания опухолевых клеток, многими авторами обращается внимание на участие ненасыщенных жирных кислот в ингибировании пролиферации опухолевых клеток. Есть сообщения о прямом ингибировании арахидоновой кислотой пролиферации лимфоидных клеток, индуцируемой цитокинами (Rotondo, 1994). Существуют также данные, что липоксигеназный продукт 13(S)HODE подавляет клеточную пролиферацию и индуцирует апоптоз в трансформированных эпителиальных клетках, а также в клетках рака толстой кишки (Shureiqi et аЦ 2000). 13(S)HODE - это продукт окисления линолевой кислоты при участии 15-ЛО. Этим автором считается, что в опухолевых клетках этих линий снижена активность 15-ЛО, продукты которой являются необходимыми в «проведении» иммуного ответа на воспалительные реакции нормальных клеток. Нестероидные противовоспалительные агенты, ингибирующие продукцию простагландинов, могут индуцировать апоптоз через индукцию синтеза 15-ЛО-1. 13(S)HODE, как известно, вносит вклад в дегенеративный процесс внутриклеточных органел, таких как митохондрий во время созревания ретикулоцитов (Kuhn, 1996), и может подобным образом вести себя в апоптозе колониеобразующих клеток. На этих же клетках рака толстой кишки получены несколько отличные данные о том, что экспрессия 15-ЛО необходима во время дифференцировки и гибели клеток, то есть во время индуцированной бутиратом натрия клеточной дифференцировки или гибели увеличивается экспрессия 15-ЛО и снижается экспрессия ЦО-2 в этих клетках (Kamitani et al, 1998). Предполагается, что ЦО-2 и 15-ЛО могут работать согласованно, участвуя в регуляции процессов апоптоза и клеточной дифференцировки. Так, например, индометацин в этих клетках усиливал экспрессию 15-ЛО, а 15-ЛО используя в качестве субстрарта линолевую кислоту, но не арахидоновую, нарабатывала во время такой индуцированной дифференцировки 13(S)HODE. С другой стороны, есть сведения, что липоксигеназные метаболиты, включая и метаболиты 15-ЛО, являются ингибиторами апоптоза (Tang and Honn, 1997). 13(S)HODE и 9(S)HODE продукты 15-ЛО, связываются с активирующим пролиферацию рецептором PPRARy (Nagy, 1998), эти метаболиты линолевой кислоты индуцируют созревание моноцитов и регулируют генную экспрессию. Так же как и в нормальных клетках цитокины ИЛ-13 и ИЛ-4 вызывают экспрессию 15-ЛО в легочной карциноме человека (Brinckmann, 1996).
Метаболиты не только линолевой кислоты, но и арахидоновой кислоты могут участвовать в гибели трансформированных клеток. Так, работами (Maccarone, et al., 1997, 2001) показано, что во время программируемой клеточной гибели клеток эритролейхемии, нейробластомы и меланомы увеличивается наработка липоксигеназных метаболитов АК, а именно продуктов 5-ЛО. Эти данные подкрепляются работами других ученых, что липоксигеназные метаболиты являются мессенджерами, играющими большую роль в регуляции программируемой гибели клеток (McGahon et al., 1995), и что их роль может сводиться к регуляции мембранных свойств, инициирующих запуск апоптоза (Schnurr et al., 1996). Не исключается, что эта роль может сводиться к пероксидации мембран продуктами липоксигеназ. Ингибиторы липоксигеназ (НДГК и кофеиновая кислота) снимают такую индуцированную гибель этих клеток. В последние годы участие липоксигеназ в пролиферации и гибели разных клеток связывают с тем фактом, что их продуктами являются гидроперекисные продукты, активно участвующие в радикальных реакциях клетки. Однако, окисленные липидные продукты и радикальные соединения важны как в опухолевой пролиферации (Noguchi, 1995), так и в апоптозе (Hockenbery, 1993). Поэтому, метаболизм арахидоновой кислоты, опосредуемый липоксигеназами, отражает возможную роль липоксигеназ как в регуляции апоптоза, так и клеточного выживания.
Существующие противоречивые данные относительно роли липоксигеназ в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток свидетельствуют о том, что точный механизм регуляции этих процессов с помощью липоксигеназ не известен. Белок, активирующий 5-ЛО - FLAP, является интегральной частью пути окисления арахидоновой кислоты 5-липоксигеназой. Ингибитор этого белка МК886 способен индуцировать апоптоз в некоторых опухолевых линиях при значительно низких концентрациях. Небольшой группе ученых удалось выявить, что FLAP локализован в ядерной мембране в близости к белкам семейтва bcl-2, обладающими антиапоптозными свойствами (Woods, 1995, Chao et al., 1995). Работами другого ученого показано, что в клетках, сверхэкспрессирующих Ъс1-2, снижено количество FLAP белка, и что после действия ингибитора этого белка - МК886 снижается экспрессия bcl-2 в клетках (Datta et al., 1998). Такие «согласованные» изменения этих белков предполагают их взаимосвязанную функциональную или регуляторную роль. Есть другой пример регуляторной роли липоксигеназных продуктов арахидоновой кислоты во взаимосвязанной активности белков генов семейства bcl-2. Общий ингибитор липоксигеназ - НДГК, специфический ингибитор 12-ЛО - байкалеин и ингибитор освобождения арахидоновой кислоты из мембран — БФБ приводили к снижению уровня белков bcl-2 клеток моноцитоидного происхождения - карциномы W256. Это событие предшествовало вступлению клеток в апоптоз (Tang and Ноші., 1997), изменяя общий клеточный гомеостаз на осуществление гибели. Авторы этой работы, кроме того, сообщают, что в выживание клеток W256 основной вклад вносят продукты 12-ЛО -12(S)HETE и продукты 15-ЛО - 15-НЕТЕ. Общий ингибитор липоксигеназ - НДГК снижал экспрессию гена 12-ЛО и вызывал апоптоз, который был выражен сильнее, чем при ингибировании только 12-ЛО, а продукты 12-ЛО и 15-ЛО блокировали индуцированный ингибиторами апоптоз.
Останавливаясь на участии липоксигеназных продуктов арахидоновой и линолевой кислот в клеточной гибели и выживании, ученые отводят им роль регуляторов внутриклеточного оксидативного потенциала. Окисленные липидные производные и свободные радикалы вовлечены в процесс апоптоза, и могут не только повреждать мембраны, но и регулировать активность целого ряда генов, продукты которых задействованы в регуляции выживания и гибели клеток, как показано на примере bcl-2 (Tang, 1996; Datta, 1998). Однако, это не всегда так, поскольку есть множество примеров, описывающих липоксигеназные метаболиты в качестве медиаторов пролиферативных и апоптозных сигналов.
О некоторых аспектах генной регуляции радиационного апоптоза
Во время апоптоза тимоцитов происходит активация генов с последующей экспрессией соответствующих продуктов (Sellins, 1987, Williams, 2001). Как уже говорилось, белок р53, возможно, участвует в положительной селекции тимоцитов (Lowe, 1993). Этим автором показано, что радиация в тимоцитах вызывает увеличение уровня р53. Аккумуляция белка р53 отмечается уже через час после облучения перед значительной деградацией ДНК, причем экспрессия гена наблюдалась после действия радиации или Са2+-зависимых стимулов, но не глюкокортикоидов. Клетки, лишенные р53, остаются чувствительными к глюкокортикоидам. Незрелые тимоциты с дефицитом р53 устойчивы к летальным эффектам ионизирующей радиации (Lowe, 1993), оставаясь жизнеспособными при воздействии до 2 Гр, по сравнению с клетками нормальными по р53.
Известно, что ген р53 вовлечен в контрольную проверку клеток во время прохождения ими фазы Gi, т.е. в проверку статуса ДНК перед входом ее в стадию S. Таким образом, такие ответы, как блок клеточного цикла может происходить из активации различных генов-мишеней р53. Нарушение работы р53 может позволять накапливать клеткой мутации, обусловленные неисправностью Gi проверки. Кроме того, любой недостаток р53 функции, приводящий к выживанию клеток после действия радиации, способствует накоплению таких клеток и их неопластической трансформации в организме.
Продукт гена р53 является онкосупрессором: клетки, дефицитные по р53 устойчивы к химиотерапии и не способны подвергаться апоптозу (Thompson, 1995). Роль р53, как фактора, запускающего апоптоз клеток, очень часто упоминается при действии ионизирующей радиации на тимоциты, при этом некоторые ученые стремятся рассматривать функции р53 белка в комплексе с циклин-зависимой киназой 2 (cdk2). Весь клеточный цикл подразделяется на интерфазный период и митотический. Передвижение клеток по циклу регулируется последовательно сменяющими друг друга киназами. Циклин-зависимая киназа 2 во время апоптоза, индуцированного дексаметазоном или радиацией, увеличивает свою активность. Однако, активность cdk2 в апоптозе тимоцитов не зависит от ее функций в клеточном цикле. Cdk2 киназная активность во время апоптоза тимоцитов не связана с циклинами Е и А, но для её активации требуется синтез белков de novo (Gil-Gomez, 1998). Синтезирующиеся новые регуляторные субъединицы могут изменять субстратную специфичность cdk2 и приводить к гибели, а не к прогрессии клеточного цикла (Peeper et al., 1993). Клеточный цикл и апоптоз взаимосвязаны (Meikratz and Schlegel, 1995). Так, экспрессия протоонкогена с-тус стимулирует клеточную пролиферацию и также предрасполагает клетки к апоптозу в условиях ограничения доступности ростовых факторов (Evan et al., 1992). Известно, что циклогексемид способен снимать увеличение уровня cdk2 во время апоптоза, что может привести к снижению апоптоза в ответ на дексаметазон или у-радиации. С другой стороны, показано, что активация cdk2 регулируется членами семейства bcl-2: сверхэкспрессия bcl-2 снижает увеличение cdk2, а сверхэкспрессия Ьах - увеличивает. Также cdk2 может регулироваться и фактором р53 (Gil-Gomez, 1998). В bax-трансгенных мышах увеличивается количество клеток, проходящих клеточный цикл, в то время как ЬсІ-2-трансгенньгх мышах - наоборот. Показано также, что, Ъс\-2 задерживает вход клеток в S-фазу клеточного цикла (Brady et aL, 1996; Lmette et al., 1996), в то время как bax - ускоряет. Все эти данные согласуются с негативной регуляцией cdk2, к которой имеет отношение белок p27klpl, известный как негативный регулятор активности циклинзависимых киназ (Polyak et al., 1994; Totoshima and Hunter, 1994). р27ыр1 работает как блокатор клеточного цикла, который должен быть деградирован, для перехода клетки в S фазу. Предполагается, что, скорее всего, функция этого белка не только в регуляции клеточного цикла, но также и в контроле апоптозного процесса. Известно, что Ьах, увеличивая количество клеток, проходящих по клеточному циклу, ускоряет деградацию p27kipl, a bcl-2 - наоборот. По мнению Gil-Gomez (1998), активация cdk2 - это наиболее важное событие в различных способах реализации апоптоза и узловой момент для клеточного цикла и программы гибели. В исследованиях этого автора была показана взаимосвязь между активацией cdk2 и тимоцитного апоптоза, регуляторами которого служат р53, Ьах и bcl-2. Облученные тимоциты, лишенные р53 (рЗЗ"7"), не способны к клеточной гибели, в них не наблюдается деградация p27kipI и не наблюдается увеличение киназной активности. Активность р53 необходима для того, чтобы запустить деградацию p27tlpl в облученных клетках. Деградация p27klpl - это функция как р53-зависимого пути гибели, так и пути, опосредованного глюкокортикоидными рецепторами.
Таким образом, Gj-S переход клеточного цикла - это наиболее чувствительная точка для запуска программы гибели. Возможно, покоящиеся тимоциты запускаются в гибель, вследствие активации биохимической "машины", являющейся частью нормального клеточного цикла: cdk2 и p27klpl.
Исследование действия продукта циклооксигеназы - простагландина Ег на клетки лимфолейкоза Р388
В литературе существуют данные о необходимости продуктов как липоксигеназ, так и циклооксигеназ для пролиферации и выживаемости других типов опухолевых клеток (см. гл. 2). Однако эффект лейкотриенов и простаглаядинов на пролиферацию зависит от типа опухолевых клеток.
В предыдущей части работы было показано, что блок синтеза простагландинов в клетках лимфолейкоза Р388 ингибитором циклооксигеназы - индометацином не снижал пролиферацию клеток и не вызывал их гибель. Следовательно, снижение концентрации простагландинов не влияет на выживаемость клеток Р388. Известно, что при действии ингибиторов липоксигеназ большая часть ненасыщенных жирных кислот превращается в простагландины (гл. 2), поэтому апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 при действии ингибиторов липоксигеназ может быть обусловлен не только недостатком продуктов липоксигеназ, но и избытком простагландинов. Для проверки этого предположения исследовали влияние продукта циклооксигеназы - простагландина Ег на клетки лимфолейкоза Р388 на стационарной стадии роста. На рис. 8 показано, что простагландин Ег в зависимости от дозы снижает выживаемость и вызывает повреждение ядер клеток лимфолейкоза. Концентрация простагландина Ег, снижающая выживаемость на 50%, На рис. 9 приведено распределение клеток по содержанию ДНК после действия ПГЕ2 на клетки лимфолейкоза Р388. Доля клеток с гиподиплоидным набором ДНК при действии простагландина Ег увеличивается, а доля клеток, находящихся в фазе синтеза (S) ДНК - уменьшается.
Гибель клеток лимфолейкоза по типу апоптоза при действии продукта циклооксигеназы - ПГЕг подтверждается межнуклеосомной фрагментацией ДНК (рис. 10). При сроке инкубации 22 час и при действии достаточно малых концентраций ПГЕг, начиная с 0,01 мкМ, наблюдается появление низкомолекулярных фрагментов ДНК апоптозных клеток.
Таким образом, увеличение концентрации простагландина Ег от 1 -10 нМ подавляет пролиферацию клеток Р388 и вызывает апоптоз. По-видимому, эффекты ингибиторов липоксигеназ могли быть обусловлены не только уменьшением в клетках лейкотриенов, но и увеличением простагландинов.
На рис. 12 показано распределение клеток по содержанию ДНК после сочетанного действия общего ингибитора липоксигеназ - нордигидрогуаретовой кислоты, 10 мкМ и продукта циклооксигеназы простагландина Ег, 1 мкМ. Видно, что при совместном их действии доля апоптозных клеток резко возрастает (до 79 %), а переход клеток в фазу синтеза ДНК практически полностью блокируется. Таким образом, продукты циклооксигеназы усиливают антипролиферативный и апоптозный эффекты ингибиторов липоксигеназ в клетках Р388.
Таким образом, для пролиферации и выживания клеток Р388 необходимы продукты 5- и 12-липоксигеназ. Подавление пролиферации и апоптоз клеток при действии ингибиторов липоксигеназ может быть обусловлен как недостатком продуктов липоксигеназ, так и увеличенной продукцией простагландина Ег. Резюме:
Показано, что продукты липоксигеназ необходимы для роста и выживаемости исследуемых клеток, причем на разных стадиях роста меняется их вклад в пролиферацию. Так, клетки ранней стадии, находящиеся в логарифмической стадии роста, более чувствительны к недостатку продуктов 5-липоксигеназы. Следовательно, лейкотриены -продукты 5-ЛО, для этих клеток - не только факторы выживания, но и факторы, участвующие в пролиферативной активности клеток. Чувствительность к ингибированию 12-ЛО не зависела от стадии роста - байкалеин снижал выживаемость и вызывал апоптоз клеток сравнительно одинаково на клетках ранней и поздней стадиях роста. Клетки стационарной стадии роста более чувствительны к ингибированию продуктов всех трех липоксигеназ, т.е. к общему ингибитору липоксигеназ (НДГК), чем клетки в логарифмической стадии. По-видимому, для клеток поздней (стационарной) стадии роста концентрации НДГК (1-10 мкМ) являются токсичными, вследствии их большей чувствительности к окислительному стрессу.
Ингибирование циклооксигеназы не вызывало апоптоза опухолевых клеток Р388, то есть, метаболиты циклооксигеназы не нужны для роста и выживаемости этих клеток. Более того, в этой части работы показано, что добавление простагландинов (ПГЕг) к клеткам вызывает их апоптоз уже при малых концентрациях этого продукта (0,01 мкМ). Возможно, при подавлении липоксигеназ часть ненасыщенных жирных кислот окисляется циклооксигеназами и превращается в простагландины. Гибель клеток, таким образом, может быть обусловлена не только недостатком продуктов липоксигеназ, но и избытком продуктов циклооксигеназ. Были поставлены эксперименты, результаты которых показали, что ПГЕг усиливал антипролиферативный и апоптозный эффекты НДГК.
Таким образом, для роста и выживания клеток лимфолейкоза Р388 необходимы продукты липоксигеназ метаболизма ненасыщенных жирных кислот. Апоптоз клеток вызывает как недостаток продуктов липоксигеназ, так и избыток продукта циклооксигеназы - ПГЕг.
