Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 . Современные подходы к изучению белков в скелетномышечных миобластах, а также в некоторых других нормальных и злокачественных клетках человека (обзор литературы). 9
1.1. Общая характеристика сателлитных клеток скелетной мускулатуры.
1.2. Ростовые факторы и их роль в регуляции роста сателлитных клеток .17
1.3. Исследование мышечных белков с помощью постгеномных технологий. 21
1.4. Использование постгеномных технологий для исследования белкового состава предстательной железы. 36
Глава 2. Материалы и методы. 39
2.1. Реактивы и биологические материалы.
2.2. Методы культивирования клеток человека. 40
2.3. Определение влияния исследуемых препаратов на пролиферацию культивируемых клеток. 40
2.4. Электрофоретическое разделение белков . 41
2.5. Детекция белков на гелевых пластинах с использованием кумасси голубого R-250 и азотнокислого серебра. 45
2.6. Фотодокументирование изображений и архивирование гелей. 46
2.7 Масс-спектрометрическая идентификация белков. 46
2.8. Методы статистической обработки результатов. 47
Глава 3. Результаты и их обсуждение. 48
3.1. Исследование белкового состава культивируемых миобластов человека на разных сроках дифференцировки.
3.2. Идентификация новых белков в культивируемых миобластах человека. 57
3.3. Сопоставление данных протеомного анализа белков культивируемых мышечных клеток человека с информацией о конфликтных определениях аминокислотной последовательности белков, содержащейся в базе данных Swiss-Prot. 58
3.4. Сравнительный протеомный анализ белков культивируемых миобластов человека и некоторых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения.
3.5. Оптимизация клеточной тест-системы, использующей в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека. 74
Заключение. 79
Выводы. 82
Благодарности. 84
Использованная литература. 85
Приложения. 107
- Ростовые факторы и их роль в регуляции роста сателлитных клеток
- Использование постгеномных технологий для исследования белкового состава предстательной железы.
- Электрофоретическое разделение белков
- Идентификация новых белков в культивируемых миобластах человека.
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из актуальных направлений современной науки является изучение пролиферации и дифференцировки клеток, так как эти процессы определяют ход роста, развития и регенерации различных тканей и органов. Рост, регенерация и гипертрофия скелетной мускулатуры происходят в результате пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток [Goldring et al., 2002; Charge, Rudnicki, 2004; Dhawan, Rando, 2005]. Экспериментальное изучение молекулярных механизмов, вовлеченных в протекание указанных биологических процессов, является важной задачей современной биомедицинской науки, так как позволяет выработать новые подходы к диагностике, профилактике и лечению ряда распространенных и социально значимых заболеваний. Завершение в 2001 году проекта «Геном человека» позволило достигнуть качественно нового уровня исследования молекулярных механизмов функционирования клетки за счет сочетания традиционных биохимических методов с рядом подходов, разработанных в рамках геномных и постгеномных дисциплин [Anderson, Anderson, 1998; Арчаков, 2000; Говорун, Арчаков, 2002; Шишкин, 2002; Шишкин и др., 2004]. Так, сочетание традиционных электрофоретических и хроматографических методов фракционирования белков с их идентификацией методами масс-спектрометрии позволяет существенно расширить возможности изучения белкового состава различных биологических объектов [Tomlinson et al., 2001; Koomen et al., 2005; Chen et al., 2006; Doran et al., 2007]. Использование нормальных и опухолевых культивируемых клеток человека в качестве экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки и злокачественного перерождения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов указанных процессов в организме человека, не сталкиваясь с разнообразными трудностями (в том числе и этическими), неизбежно возникающими при постановке соответствующих экспериментов на животных или человеке.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение протеомными технологиями особенностей белкового состава миобластов человека, культивируемых в условиях, обеспечивающих пролиферацию и индуцирующих дифференцировку, а также выяснение возможного участия отдельных белков в этих процессах и при опухолевой трансформации на примере злокачественных клеток мышечного и эпителиального происхождения.
В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:
Провести сравнительный протеомный анализ белков пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов человека, направленный на выявление и идентификацию белков, изменяющихся в ходе дифференцировки.
Сопоставить результаты протеомного анализа идентифицированных белков миобластов человека с материалами баз данных NCBI и Swiss-Prot.
Изучить различия белкового состава пролиферирующих нормальных миобластов человека и некоторых культивируемых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения с целью идентификации потенциальных онкомаркеров.
Оптимизировать клеточную тест-систему, использующую в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, для определения эффектов биологически активных соединений, подавляющих пролиферацию клеток.
Научная новизна работы. Получены новые данные об особенностях белкового состава пролиферирующих и дифференцирующихся культивируемых миобластов человека. В культивируемых миобластах человека обнаружено 3 новых белка.
Для 40 аминокислотных конфликтов в 12 белках культивируемых мышечных клеток человека подтверждена достоверность определения одного из вариантов аминокислотной последовательности.
Научно-практическая значимость. Работа имеет фундаментальный характер и направлена на изучение особенностей белкового состава культивируемых клеток человека и механизмов их дифференцировки.
. Использование культивируемых опухолевых клеток человека позволило уточнить специфичность некоторых потенциальных онкомаркеров. В частности, показано присутствие белка AGR2, рассматриваемого в качестве перспективного онкомаркера, в культивируемых клетках рака предстательной железы, но не в культивируемых клетках мышечного происхождения.
Оптимизация клеточной тест-системы (в частности, использование бессывороточного контроля) позволила использовать ее для тестирования ростовых факторов, не только стимулирующих, но и подавляющих пролиферацию культивируемых миобластов человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
Протеомными технологиями изучен белковый состав культивируемых миобластов человека на разных этапах дифференцировки; при этом идентифицировано 42 белковых фракции (в том числе 13 фракций, количество которых меняется в ходе дифференцировки) и три новых белка.
Подтверждено существование по одному из вариантов для 40 расчетных «конфликтных» определений в аминокислотных последовательностях 12 идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.
Проведенный сравнительный протеомный анализ белков нормальных миобластов человека и некоторых опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволил выявить ряд белков, потенциально вовлеченных в процессы опухолевой трансформации.
4. Оптимизирована клеточная тест-система, что позволило использовать ее для тестирования как стимулирующих, так и подавляющих пролиферацию рекомбинантных белковых факторов роста. Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, симпозиумах и школах, в том числе на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (2006 г., Санкт-Петербург), Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (2007 г., г.Дубна), 2-м съезде Общества клеточной биологии (2007 г., Санкт-Петербург), 6-й Парнасовской конференции «Molecular Mechanism of Cellular Signaling» (2007 г., Польша, г.Краков), 32-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (2007 г., Австрия, г.Вена), Летней школе «Hottest Topics in Protein Research» (2008 г., Хорватия, г.Сплит), Европейском мышечном конгрессе (2008 г., Великобритания, Г.Оксфорд), Европейском симпозиуме по калыдий-связывающим белкам (2008 г., Бельгия, г.Левен), Школе молодых ученых «Методы культивирования клеток» (2008 г., Санкт-Петербург), Совещании «Muscle regeneration and Stem Cells: a multiorganismic approach» (2008 г., Польша, г.Неполомице) и др. Работа была отмечена присуждением стипендии им. члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича на 2008 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ (из них 5 в зарубежной печати), включая 6 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах, 3 статьи в сборниках и 8 тезисов докладов.
Ростовые факторы и их роль в регуляции роста сателлитных клеток
Белковые факторы роста играют важную роль в регуляции роста и дифференцировки сателлитных клеток. В 1986 году работами Bischoff было показано, что экстракт из поврежденных скелетных мышц содержит факторы, усиливающие пролиферацию сателлитных клеток [Bischoff, 1986]. В настоящее время ряд таких факторов идентифицирован. К ним относятся факторы из семейств FGF, IGF, TGF-P, HGF, TNF-a, IL-6 и других (рис. 7). Данные об участии некоторых ростовых факторов в регуляции пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток показаны на рис 7.
Ростовые факторы семейства IGF регулируют процессы роста и развития многих тканей, в том числе и мышечных. IGF-1 способен стимулировать пролиферацию сателлитных клеток как in vitro, так и in vivo [Coleman et al., 1995; Jacquemin et al., 2004]. Развитие мышечной гипертрофии под действием IGF-1 является следствием увеличения не только пролиферации сателлитных клеток, но и усилением анаболических процессов в уже сформировавшихся миофибриллах [Semsarian et al., 1999; Musaro et al., 1999]. Действие IGF-1 также проявляется и в предотвращении апоптоза сателлитных клеток [Barton et al., 2002]. Макрофаги Нейтрофилы Т-клетки Тромбоциты
К семейству IGF относится и механозависимый фактор роста, являющийся продуктом альтернативного сплайсинга гена IGF-1. Данный ростовой фактор выделяется непосредственно мышечными волокнами в ответ на механическое воздействие. Он обладает ярко выраженной способностью стимулировать пролиферацию сателлитных клеток, но, в отличие от IGF-1, не оказывает стимулирующего влияния на немышечные клетки (в том числе на фибробласты) [Yang, Goldspink, 2002]. Это делает механозависимый ростовой фактор эффективным средством стимуляции роста и регенерации скелетной мускулатуры.
Ростовые факторы семейства TGF-p1 способны подавлять пролиферацию, а отчасти и дифференцировку сателлитных клеток. При этом чувствительность к действию TGF-pi в процессе дифференцировки падает, что было связано со снижением экспрессии рецепторов к TGF-p 1 в дифференцирующихся миоцитах [Ни, Olson, 1990]. Другой ростовой фактор из семейства TGF-J3, миостатин, способен выраженно подавлять пролиферацию сателлитных клеток, что было показано в экспериментах с миобластами линии С2С12, а также с культивируемыми мышиными и бычьими первичными миобластами [Thomas et al., 2000; Rios et al., 2002; Joulia et al., 2003; McCroskery et al., 2003; Шишкин, 2004; Wagner et al., 2005]. Отсутствие данного фактора приводит к формированию так называемого «двойного мышечного» фенотипа, при этом усиленный рост мышечной массы происходит за счет увеличения как количества миофибрилл, так и их диаметра [McPherron et al., 1997; Grobet et al., 1997; Wagner et al., 2002; Wagner et al., 2005]. Соответственно, подавление экспрессии миостатина или связывание свободного миостатина может выступать эффективным методом стимуляции регенерации и роста скелетной мускулатуры.
Отдельные ростовые факторы, относящиеся к семейству FGF, также способны стимулировать пролиферацию мышечных клеток. FGF-2 содержится в базальной мембране, окружающей растущие и зрелые миофибриллы [Cornelison et al., 2001]. Его нейтрализация инъекцией анти-FGF-2 антител после нанесения травмы приводит к замедлению регенерации мышцы, уменьшению числа и размера регенерирующих миофибрилл [Lefaucheur, Sebille, 1995]. Экспрессия другого ростового фактора этого семейства, FGF-6, специфична для мышечной ткани и усилена в регенерирующей мышце. Этот фактор способен усиливать пролиферацию миобластов, что было показано в экспериментах на миобластах линии С2С12 [Israeli et al., 2004]. Однако ростовые факторы данного семейства не играют ключевой роли в регуляции пролиферации сателлитных клеток. Основная их функция в мышечной ткани заключается, судя по всему, в стимуляции реваскуляризации регенерирующего участка мышцы, благодаря их выраженному ангиогенному действию [Lefaucheur et al., 1996].
HGF был впервые выделен из сыворотки крови подвергнутых частичной гепатэктомии крыс как фактор, придающий ей способность стимулировать пролиферацию клеток первичной культуры гепатоцитов [Nakamura et al., 1986; Nakamura et al., 1989]. В настоящее время этот фактор рассматривают как митогенный фактор для клеток разного типа дифференцировки. Также было показано, что HGF, содержащийся в экстракте из поврежденной мышечной ткани, является основным фактором, придающим ему способность индуцировать пролиферацию покоящихся мышечных клеток [Tatsumi et al., 1998]. HGF способен стимулировать пролиферацию и подавлять дифференцировку мышечных клеток in vitro [Allen et al., 1995; Gal-Levi et al., 1998; Tatsumi et al., 1998; Miller et al., 2000]. Кроме того, HGF способен усиливать миграцию сателлитных клеток к месту повреждения [Bischoff, 1997; Suzuki et al., 2000]. Все это свидетельствует о важности HGF на ранних этапах регенерации мышцы. В то же время длительное введение HGF снижает эффективность регенерации мускулатуры за счет подавления дифференцировки мышечных клеток [Tatsumi et al., 1998; Miller et al., 2000]. Следует отметить, что HGF, участвующий в регуляции регенерации мышцы, имеет различное происхождение. Он выделяется собственно сателлитными клетками и новообразованными миофибриллами [Anastasi et al., 1997; Gal-Levi et al., 1998; Sheehan et al., 2000], высвобождается из базальной мембраны после ее повреждения во время травмы, причем ключевую роль в этом процессе играет высвобождаемая из базальной же мембраны NO-синтетаза и образуемый ею оксид азота [Anderson, 2000; Tatsumi et al., 2002], а также поступает из кровотока, поскольку повреждение мышечной ткани вызывает усиление образования HGF в селезенке [Suzuki et al., 2002]. Таким образом,
Использование постгеномных технологий для исследования белкового состава предстательной железы.
Изучение белкового состава предстательной железы привлекает многих исследователей, прежде всего по причине высокой частоты заболеваний этого органа в развитых странах (рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний у мужчин).
Сравнение белкового состава раковой и неозлокачествленной гиперплазированной ткани предстательной железы, проведенное Alaiya и соавторами (сочетание двумерного электрофореза с последующей компьютерной обработкой изображений гелей и идентификацией белков методом MALDIOF масс-спектрометрией) выявило ряд различий в представленности некоторых белков в злокачественной и неозлокачествленной ткани [Alaiya et al., 2000; Alaiya et al., 2001].
Среди идентифицированных белков можно отметить ядерный антиген пролиферирующих клеток, кальретикулин, онкопротеин 18, фактор элонгации 2, глутатион-8-трансферазу, супер оксиддисму тазу, триозофосфатизомеразу, а также ряд белков теплового шока. Так как ткань предстательной железы является весьма гетерогенной по составу (помимо эпителиальных клеток, из которых развивается собственно рак, в ней представлены стромальные клетки, внеклеточный матрикс, ткань сосудов и следовые количества крови и т.д.), для получения более специфических результатов было предпринято исследование белкового профиля эпителиальных клеток предстательной железы, выделенных методом лазерной микродиссекции [Ahram et al., 2002]. Авторам удалось идентифицировать 40 белков, количество которых отличалось в гиперплазированной и раковой ткани.
Также следует отметить работу, посвященную поиску белков, исчезающих при раке предстательной железы. Авторам удалось идентифицировать 20 таких белков (в том числе простатоспецифический антиген, альфа-1 антихимотрипсин, гаптоглобин, лактоилглутатионлиазу, убиквитиноподобный белок NEDD8, кальпонин и фоллистатин-родственный белок) [Meehan et al., 2002].
Естественно, что в качестве объекта исследования выступали не только образцы ткани человека, но и культивируемые клетки, являющиеся распространенной лабораторной моделью для изучения рака предстательной железы [Chung et al., 1997; Dvorzhinski et al., 2004]. В частности, клетки линии LNCaP были исследованы с использованием как хроматографических [Meehan et al., 2004; Roveri et al., 2008], так и традиционных гелевых подходов [Dvorzhinski et al., 2004; Hasegawa et al., 2006; Liu et al., 2007; Rowland et al., 2007 и др.]. Хроматографические методы также были использованы для сравнения белкового состава клеток линий LNCaP и РС-3 [Sun et al., 2008]. Вызывает интерес ряд работ, направленных на изучение белков, секретируемых культивируемыми клетками рака предстательной железы в культуральную среду, поскольку именно белки, выделяемые клетками, представляются наиболее удобными потенциальными биомаркерами [Martin et al., 2004; Sardana et al., 2008].
Поскольку лучевая терапия занимает важное место в комплексном лечении рака предстательной железы, представляет интерес и изучение процессов, происходящих в клетках в ходе облучения. С этой целью путем последовательного облучения клеток линий LNCaP, РС-3 и Dul45 были выведены линии клеток, резистентных к действию облучения.
Использование протеомного анализа с последующей обработкой полученных данных программой Pathway Studio 5.0 позволило выявить 27 белков, количество которых различалось в исходных и радиоустойчивых клетках. Кроме того, часть указанных белков вовлечены в функционирование сигнальных путей, благодаря которым клетки реагируют на сигналы от эпидермального фактора роста и андрогенов, приводящие к ускорению пролиферации и миграции клеток, а также способствущие их выживанию [Skvortsova et al., 2008].
Электрофоретическое разделение белков
После предварительной инкубации в бессывороточной среде в течение 1 часа (с целью снятия адсорбированных белков сыворотки, использованной при культивировании) клетки механически снимали с поверхности матрасов и осаждали центрифугированием (при 800 g, 5 мин.). Образцы клеток до экстракции белков хранились при температуре - 70С. Для проведения двумерного электрофореза образцы клеток (содержащие приблизительно 5 млн. клеток) гомогенизировали в 200 мкл лизис-буфера следующего состава: 9 М мочевины, 5% меркаптоэтанола, 2% тритона Х-100, 2% амфолинов рН 3,5 — 10. Полученный гомогенат центрифугировали при 800 g 5 мин и надосадочную фракцию, содержащую солюбилизированные белки, использовали для фракционирования. Для проведения электрофореза брали 100 мкл раствора на трубку.
Защитный раствор: 4,5 М мочевина, содержащая 1 % Тритон Х-100; 2,5% меркаптоэтанола, 1% амфолинов рН 3,5-10; 1.8. Переводный буфер для геля первого направления: 30% глицерина, 5 % меркаптоэтанола, 2 % додецилсульфата Na в 0,0625 М Трис-HCl (рН 6,8). Растворы 1.1.; 1.2.; 1.7.; 1.8. хранили при температуре +4С в течение 2-3 недель. Остальные растворы использовали свежеприготовленными. Изоэлектрофокусирование в градиенте рН. Изоэлектрофокусирование проводили в стеклянных трубках длиной 180 мм и внутренним диамером 2,4 мм. Трубки устанавливали в штатив, герметизировали нижние отверстия и заливали полимеризационной смесью (табл. 1). Для приготовления 22 мл полимеризационной смеси, необходимой для заполнения 12 трубок, брали 12,4 г мочевины, 6,8 мл дистиллированной воды, 3 мл раствора 1.1., 2,25 мл раствора 1.2. Эту смесь обрабатывали ионообменной смолой амберлит МБ-1 и добавляли к ней 225 мкл амфолинов рН 3,5-10 и 900 мкл амфолинов рН 5-8. Смесь дегазировали, а непосредственно перед заливкой в трубки к ней добавляли 32,5 мкл раствора 1.4.и22,5мклТЕМЕД.
Полимеризационную смесь в трубки вносили шприцом, заполняя трубки до одинакового уровня (на 2-3 см ниже верхнего края). Сверху наслаивали дистиллированную воду. После окончания полимеризации геля воду над его поверхностью удаляли и трубки устанавливали в электроферетическую камеру ("Bio-Rad", США). В нижний резервуар камеры (катод) наливали раствор 1.6. В трубки наносили анализируемые образцы, содержащие -500 мкг белка. Сверху, до краев трубки, наслаивали защитный раствор 1.7. и верхнюю камеру прибора (анод) заполняли раствором 1.5. Изоэлектрофокусирование проводили при напряжении 1000 В, суммарно до набора 2400 В/ч. По окончании изоэлектрофокусирования колонки геля вынимали из трубок с помощью шприца, наполненного водой, выдерживали в 2,5 мл раствора 1.8. в течение 10 мин при комнатной температуре, затем быстро замораживали и хранили при температуре -30С, либо сразу использовали для фракционирования во втором направлении. 2.4.2.2. Второе направление (SDS-электрофорез в пластинах ПААГ). Для фракционирования во втором направлении использовали одну из модификаций метода Лэммли [Laemmli, 1970] в пластинах с градиентом ПААГ 7,5 - 25% в присутствии SDS. Для проведения фракционирования во втором направлении готовили следующие растворы: Раствор 2.5 готовили непосредственно перед употреблением, остальные хранили при температуре +4С. Фракционирование во втором направлении осуществляли в пластинах ПААГ размером 200x200x1 мм с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5 - 25 %, в приборе для вертикального электрофореза ("Helicon", Россия).
Для формирования гелевых пластин с градиентом концентрации акриламида готовили два раствора: легкий (концентрация АА 7,5%) и тяжелый (концентрация АА 25%). Для приготовления 100 мл тяжелого раствора брали 36 мл раствора 2.2., 240 мкл раствора 2.5., 1 мл раствора 2.4., 53 мкл ТЕМЕД, 41,8 мл раствора 2.1., 20,4 мл дистиллированной воды (тяжелый раствор). При приготовлении 100 мл легкого раствора количество раствора 2.1. менялось на 12,5 мл, дистиллированной воды - на 49,3 мл. Состав растворов приведен в табл. 2. Через смеситель эти растворы подавали перистальтическим насосом в формы для пластин, заполняя их до уровня на 2 см ниже верхнего края. Одновременно заполнялось 6 пластин, что обеспечивало идентичность их изготовления и высокую воспроизводимость полученных результатов. После заполнения на полимеризационную смесь наслаивали воду. Полимеризация продолжалась 30-40 мин. Затем воду удаляли и заливали раствор, формирующий концентрирующий гель. Для приготовления 50 мл такого раствора брали 3,3 мл раствора 2.1., 33,3 мл дистиллированной воды, 12,7 мл раствора 2.3., 500 мкл раствора 2.4., 16,4 мкл ТЕМЕД и 300 мкл раствора 2.5. Состав концентрирующего геля приведен в табл. 2.
Идентификация новых белков в культивируемых миобластах человека.
Три из идентифицированных белков миобластов человека не были ранее описаны, хотя их существование предполагалось, поскольку ранее были обнаружены соответствующие им мРНК. Два из этих белков уменьшались в количестве в ходе дифференцировки миобластов. Один из них (№32 в списке белков) был идентифицирован как неизвестный белок, сходный по структуре с виментином (gi: 16552261). Однако его экспериментальная молекулярная масса оказалась на 9,5 кДа меньше расчетной.
Участок полипептидной цепи Мол. масса, Да Аминокислотнаяпоследовательностьпептида Модификации Экспериментальная Расчетная Рисунок 17. Результаты масс-спектрометрической идентификации неизвестного белка с Мм/р! 38,0/4,90. Выявленные пептиды перекрывают фрагмент белка между 93 и 403 а.о. Пептиды, полученные при трипсинолизе указанного белка, перекрывают участок от 93 до 403 а.о. (рис. 17), при этом расчетные молекулярная масса и изоэлектрическая точка фрагмента гипотетического белка без первых 92 а.о. оказались близкими к полученным экспериментально (37,4/4.81 и 38,0/4,90 соответственно). Это позволяет предположить, что обнаруженный белок является, по всей видимости, укороченным вариантом гипотетического белка gi: 16552261. Другие два белка (№ 3 и 42) были идентифицированы как соответствующие гипотетическому белку gi: 62702215. Молекулярная масса обнаруженных белков соответствовала указанному белковому продукту, однако изоэлектрическая точка отличалась в меньшую сторону. Интересно, что белок с большей pi исчезал в ходе дифференцировки, в то время как количество другого белка оставалось постоянным (рис. 18). Пролиферирующие миобласты Дифференцирующиеся миобласты А: Рисунок 18. Динамика неизвестных белков с Мм/р1 58,0/7,90 (№3) и 59,0/8,30 (№42) в ходе миогенной дифференцировки. Таким образом, эти белки, будучи продуктами одного гена, различно представлены в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах, возможно, в силу их разных функциональных особенностей. 3.3. Сопоставление данных протеомного анализа белков культивируемых мышечных клеток человека с информацией о конфликтных определениях аминокислотной последовательности белков, содержащейся в базе данных Swiss-Prot.
В базе данных Swiss-Prot в описаниях свойств белков приводятся многочисленные указания на различные «единичные конфликты при определении аминокислотной последовательности» (single amino acid conflict). Аминокислотные конфликты в первичной структуре белка определяют как альтернативное присутствие одной или другой аминокислоты в одной из позиций. В подавляющем большинстве таких случаев сведения о первичных структурах белков являлись результатами перерасчетов данных секвенирования соответствующих нуклеиновых кислот двумя группами авторов. Для разрешения указанных «конфликтных определений» представляется наиболее логичным использование протеомных технологий, позволяющих получить информацию о конечном продукте - белке.
Как видно из данных, приведенных в таблицах 6 и 7, результаты масс-спектрометрического анализа, проводимого с целью идентификации белков культивируемых мышечных клеток человека, свидетельствовали о присутствии пептидов, содержащих аминокислотный остаток, соответствующий одному из «конфликтных» определений. При этом в некоторых случаях проводилось сопоставление результатов идентификации белков в культивируемых клетках и образцах тканей человека, полученных в лаборатории ранее. Например, в препаратах белка из скелетных мышц, идентифицированного как енолаза 1, был обнаружен пептид с Mz 1143.60, для которого известен аминокислотный конфликт 187 Е / G (здесь и далее подчеркнут выявленный вариант). Тот же самый конфликт 187 Е / G присутствовал в пептиде с близким значением Mz (1143.64), который был получен при анализе енолазы 1 из коры мозга. Таким же способом удалось верифицировать наличие одного из двух вариантов для другого известного аминокислотного конфликта (252 F / S) в структуре енолазы 1, благодаря определению общего пептида с экспериментальными значениями Mz 1556.67 и 1556.81 в препаратах енолазы 1, полученных из мышц и из ткани мозга.
Сходная ситуация оказалась при анализе белка, идентифицированного как триозофосфатизомераза 1. В частности, один из вариантов аминокислотной последовательности 167 Р / N присутствовал в пептидах с экспериментальными значениями Mz 1602.71 и 1602.89, которые были обнаружены в образцах скелетных мышц и в простате. Аналогичные данные были получены еще для четырех известных конфликтов аминокислотной последовательности триозофосфатизомеразы 1: 20-21 QS I KN; 27 G / S; 30 31 NA / QG и 43-44 АР / IG.
