Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 6
1. Малые белки теплового шока (sHsp) 6
1.1 Структура малых белков теплового шока 7
1.2 Фосфорилирование малых белков теплового шока . 12
1.3 Малые белки теплового шока человека 13
1.4 Некоторые функции малых белков теплового шока человека 15
1.4.1 Предотвращение накопления белковых агрегатов 15
1.4.2 Защита клеток от апоптоза 16
1.4.3 Взаимодействие малых белков теплового шока с элементами цитоскелета 19
1.4.4 Внеклеточные функции малых белков теплового шока 23
2. Флуоресцентные белки 24
3. Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока 30
4. Линкерные последовательности в химерных белках 32
II. Цели и задачи 35
III. Материалы и методы 36
1. Получение молекулярно-генетических конструктов 36
2. Получение химически компетентных клеток E. coli 38
3. Экспрессия химерных белков 38
3.1 Выращивание бактериальных культур 40
3.2 Тестовая экспрессия 41
3.3 Препаративная экспрессия 42
4. Выделение и очистка рекомбинантных белков 43
4.1 Выделение и очистка химерных белков 43
4.2 Выделение и очистка белков из телец включения с последующей ренатурацией 46 4.3. Выделение и очистка рекомбинантных флуоресцентных белков 47
5. Исследование олигомерного состояния 48
5.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков 48
5.1.1 Динамическое лазерное светорассеяние 48
5.1.2 Гель-хроматография 48
5.1.3 Электронная микроскопия 49
5.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков 50
6. Флуоресцентные методы исследования 51
6.1 Измерение спектров возбуждения и флуоресценции химерных белков 51
6.2 Исследование взаимодействий химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) 52
6.2.1 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между разными флуоресцентными белками (гетеро-FRET) 52
6.2.2 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между одинаковыми флуоресцентными белками (гомо-FRET) 53
6.2.3 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гетеро-FRET 54
6.2.4 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гомо-FRET 54
7. Исследование шапероноподобной активности 56
8. Некоторые аналитические методы 57
8.1 SDS-электрофорез по методу Леммли 57
8.2 Иммунохимическое окрашивание (Western Blotting) 58
8.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка 59
IV. Результаты и их обсуждение 62
1. Подбор условий экспрессии химерных белков 62
2. Выделение и очистка белков 65
2.1 Выделение и очистка химерных белков 65
2.2 Выделение химерных белков из телец включения 69
3. Исследование олигомерного состояния химерных белков 71
3.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков 72
3.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков 79
4. Шапероноподобная активность химерных белков 91
V. Заключение 96
Выводы: 97
Список литературы: 98
- Фосфорилирование малых белков теплового шока
- Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока
- Экспрессия химерных белков
- Исследование взаимодействий химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Малые белки теплового шока – АТФ независимые
шапероны, ключевой функцией которых является поддержание белкового гомеостаза за счет
предотвращения накопления агрегатов неправильно свернутых или частично
денатурированных белков. Кроме этого sHsp способны выполнять широкий спектр функций, затрагивающих практически все стороны жизнедеятельности клетки, например, такие как транспорт везикул и органелл, подвижность, пролиферация, программируемая гибель и многие другие .
В геноме человека идентифицировано 10 генов, кодирующих 10 разных малых белков теплового шока. Некоторые из этих белков экспрессируются только в определенных тканях, другие представители этого семейства синтезируются повсеместно . Малые белки теплового шока постоянно синтезируются в клетках, однако в условиях стресса может происходить существенное увеличение уровня экспрессии определенных членов этого семейства. Кроме того, уровень экспрессии некоторых sHsp изменяется в зависимости от стадии клеточного цикла и/или этапа развития организма в процессе онтогенеза .
Интерес к малым белкам теплового шока в последние десятилетия неуклонно растет, что обусловлено участием этих белков в регуляции ключевых процессов жизнедеятельности. При повреждениях sHsp и утери их способности поддерживать гомеостаз создаются условия, зачастую приводящие к развитию патологий. На сегодняшний день установлена связь sHsp со многими заболеваниями, такими как различные виды миопатий и невропатий, онкологические заболевания, болезни Альцгеймера, Паркинсона и многие другие [2].
sHsp млекопитающих обладают очень подвижной структурой и способны образовывать сложно построенные динамичные олигомеры, что существенно затрудняет изучение их свойств. Эти особенности вынуждают разрабатывать и использовать различные методы для исследования sHsp [ . Одним из подходов, применяемых для изучения этих белков, является создание химер малых белков теплового шока и флуоресцентных белков. Использование подобных химер представляет уникальную возможность для изучения свойств sHsp непосредственно в живых клетках [, а также делает доступным новые
Список сокращений: ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние, ДТТ – дитиотрейтол, кДНК – комплементарная ДНК, -МЭ – -меркаптоэтанол, ECFP – улучшенный циановый флуоресцентный белков, EYFP – улучшенный желтый флуоресцентный белок, FP – флуоресцентный белок, FRET – фёрстеровский резонансный перенос энергии, IPTG – изопропил--D-1-тиогалактопиранозид, GFP – зеленый флуоресцентный белок, PMSF – фенилметансульфонил фторид, sHsp – малые белки теплового шока, WT – белок дикого типа
подходы для исследования белок-белковых взаимодействий в условиях in vitro . Следует
заметить, что молекулярная масса мономеров sHsp человека не превышает 23 кДа, а масса
флуоресцентного белка составляет 27 кДа. В ходе создания химер флуоресцентный белок
прикрепляется либо к N-, либо к C- концу малых белков теплового шока, т.е. к тем участкам
белка, которые задействованы в формировании олигомеров и в реализации функциональной
активности sHsp . Можно предположить, что модификация важных для
функционирования участков может привести к изменению свойств sHsp. Поэтому прежде чем использовать такие химеры, необходимо сравнить их свойства со свойствами белков дикого типа. Удивительно, что несмотря на широкое использование флуоресцентных химер sHsp , до последнего времени не проводилось подробных исследований их структуры и свойств. Целью данной работы было создание и изучение свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека, и сравнение их свойств со свойствами белков дикого типа.
Цели и задачи работы. Целью данной работы был анализ структуры и свойств различных типов химерных флуоресцентных белков, состоящих из малых белков теплового шока человека HspB1, HspB5, HspB6, HspB8 и флуоресцентных белков ECFP или EYFP. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Получить молекулярно-генетические конструкты, несущие кДНК химерных флуоресцентных белков, отличающихся по составу, комбинации частей химеры и длине и природе линкера.
-
Разработать методику выделения химерных флуоресцентных белков и получить их в гомогенном состоянии.
-
Исследовать четвертичную структуру флуоресцентных химер sHsp.
-
Проанализировать взаимодействие химерных белков между собой и белками дикого типа, их способность обмениваться субъединицами и формировать гетероолигомерные комплексы.
-
Исследовать шапероноподобную активность химерных белков.
-
Изучить влияние состава и длины линкерных последовательностей на свойства химерных белков.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Присоединение флуоресцентного белка к малым белкам теплового шока человека оказывает заметное влияние на их свойства.
-
Четвертичная структура, склонность к агрегации и шапероноподобная активность
химерных sHsp существенно зависят от локализации флуоресцентного белка в составе
химеры.
-
Флуоресцентные химеры могут быть использованы для изучения белок-белковых взаимодействий in vitro.
-
Состав и длина линкерных последовательностей влияют на свойства химер sHsp, при этом влияние уменьшается по мере увеличения длины и подвижности линкера.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения работы была разработана методика экспрессии и выделения флуоресцентных химер sHsp, позволяющая получать до 110 мг целевого белка из 1 л бактериальной культуры. Проанализированы свойства 14 различных флуоресцентных химер sHsp человека.
С помощью метода гель-хроматографии установлено, что олигомеры флуоресцентных химер малых белков теплового шока, склонных образовывать крупные комплексы (HspB1, HspB5), содержат меньшее количество субъединиц, чем соответствующие беки дикого типа. Олигомерный состав химер малых белков теплового шока, склонных образовывать только малые олигомеры (HspB6, HspB8), не отличается от олигомерного состава белков дикого типа. При модификации N-концевого участка sHsp, участвующего в формировании крупных олигомеров, наблюдается более сильное изменение структуры комплексов флуоресцентных химер, чем при модификации C-концевого участка. Методом ДЛС показано, что С-концевые химеры HspB1 и HspB5 обладают повышенной гетерогенностью и наибольшим размером олигомеров. Таким образом, установлено, что присоединение флуоресцентного белка, влияет на четвертичную структуру, которая во многом определяет функциональную активность sHsp.
Гетероолигомерные комплексы, сформированные флуоресцентными химерами,
отличаются по своему составу от гетероолигомерных комплексов, образованных
соответствующими белками дикого типа. При этом сохраняется специфичность
взаимодействия различных малых белков теплового шока, что делает возможным
использование флуоресцентных химер для исследования белок-белковых взаимодействий in
vitro.
С использованием модельных белков-субстратов исследована шапероноподобная
активность химерных белков. Установлено, что шапероноподобная активность зависит как
от локализации флуоресцентного белка (на N- или С-конце малых белков теплового шока),
так и от природы флуоресцентного белка (ECFP или EYFP). Показано, что наибольшей
шапероноподобной активностью обладают N-концевые химеры, что согласуется с
существенным уменьшением размера олигомеров у этих типов химерных белков. Состав и
длина линкера также влияют на шапероноподобную активность химер, при этом химеры с
длинными высокоподвижными линкерами в наименьшей степени отличаются по своей
шапероноподобной активности от белков дикого типа.
С помощью метода гомо-FRET исследованы взаимодействия химерных белков с различными sHsp дикого типа. По изменениям анизотропии флуоресценции химерных белков рассчитаны кажущиеся константы скорости обмена субъединиц различных малых белков теплового шока человека. Продемонстрирована возможность использования флуоресцентных химер для выявления белок-белковых взаимодействий in vitro и измерения скорости обмена субъединиц в гетероолигомерных комплексах. Изучение свойств 14 химерных sHsp, различающихся как по типу присоединенного флуоресцентного белка и его локализации, так и по составу и длине линкерной последовательности, позволило сформулировать рекомендации для получения флуоресцентных химер, в наименьшей степени отличающихся от белков дикого типа. При этом оптимальным представляется использование химер, содержащих флуоресцентный белок, прикрепленный к N-концу малых белков теплового шока длинным гибким линкером.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на 38-м Международном Конгрессе Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2013 г. (Санкт-Петербург); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2011-2013 гг. (Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы в рецензируемых научных журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 106 страницах, иллюстрирована 36 рисунками и 8 таблицами.
Фосфорилирование малых белков теплового шока
-Кристаллиновый домен sHsp животных не имеет в своей структуре выступающей петли и складки 6. Вместо этого димеризация обеспечивается удлиненными 7 складками (обозначаемыми в некоторых источниках как 6+7). Димеризация происходит за счет образования ионных и водородных связей между антипараллельно расположенным 7 складками (рис. 1 В) [119]. Взаимодействующие поверхности в зоне контакта двух мономеров получили название антипараллельного интерфейса (AP). Существуют различные конфигурации AP, при которых 7 складки "скользят" друг относительно друга на несколько аминокислотных остатков [104, 153]. Предполагается, что наличие вариабельного интерфейса создает дополнительные возможности для существования гигантского количества различных форм олигомеров sHsp млекопитающих [82]. При этом следует отметить, что образование динамичных олигомеров, имеющих множество различных конформаций, является существенным препятствием для изучения структуры sHsp млекопитающих.
За счет взаимодействия N- и С-концевых последовательностей димеры собираются в крупные гомо- или гетероолигомерные комплексы, содержащие до нескольких десятков субъединиц и имеющих молекулярные массы 800 - 1000 кДа [120]. Если олигомеры sHsp млекопитающих динамичны и полидисперсны, и поэтому не поддаются кристаллизации [104], то в других случаях такие олигомеры представлены структурами с определенным числом субъединиц и архитектурой, свойственной отдельным представителям этого семейства (рис. 2 А-В). Так в случае термофильной археи Methanocaldococcus jannaschii белок Hsp16.5 образует сферические полые олигомеры, состоящие из 24 субъединиц [100], Hsp16.9 из пшеницы Triticum aestivum формирует 12-субъединичные комплексы из двух соединенных N- и С-концевыми доменами гексамерных "дисков" [170]. Всего на настоящий момент получено 6 кристаллических структур малых белков теплового шока, кроме уже упомянутых это XaHspA из Xanthomonas axonopodis [80], Tsp36 из плоского червя Taenia saginata [156], StHsp14.0 из археи Sulfolobus tokodaii [74] и SpHsp16.0 из дрожжей Schizosaccharomyces pombe [73].
Для изучения структуры sHsp млекопитающих исследователи вынуждены применять комбинированные подходы [14] и пользоваться такими методами как ядерный магнитный резонанс [27], крио-электронная микроскопия [130], малоугловое рентгеновское рассеяние [91], компьютерное моделирование [27] или подвергать кристаллизации и рентгено-структурному исследованию изолированные -кристаллиновые домены sHsp [13, 16, 43]. Изолированные кристаллиновые домены не способны формировать крупные олигомеры, характерные для интактных белков, однако изучение укороченных фрагментов малых белков теплового шока позволяет получать информацию о третичной структуре белков и, в том числе, о влиянии мутаций на эту структуру [43]. Сегодня, вероятно, наиболее подробно изучена структура В-кристаллина (HspB5) человека.
Строение олигомеров малых белков теплового шока [120]. А) Hsp16.5 из Methanocaldococcus jannaschii, 24 субъединицы образуют полую сферу. Б) Hsp16.9 из Triticum aestivum, 12 субъединиц формируют два гексамерных кольца. В) Tsp36 из Taenia saginata, димер, в котором каждая субъединица содержит два -кристаллиновых домена, формирует тетрамерные комплексы. Субъединицы отмечены разным цветом.
Комбинирование нескольких экспериментальных подходов позволило выяснить, что "базовой" олигомерной формой этого белка является структура из 24 субъединиц – 4 гексамерных кольца, соединенных вместе N- и С-концевыми участками мономеров (рис. 3 А) [27, 52, 91]. Этот олигомер может диссоциировать на промежуточные комплексы или наращивать число субъединиц модульным путем, присоединяя к специальным участкам узнавания дополнительные димеры HspB5. Таким образом, могут образовываться комплексы, включающие до 40 субъединиц [27]. При этом могут образовываться олигомеры, как с четным, так и с нечетным числом субъединиц. Это становится возможным из-за диссоциации мономеров sHsp, процесса, зависящего от перемещения С-концевых последовательностей HspB5 между связанным и экспонированным в растворитель состояниями [15, 81].
Многие малые белки теплового шока животных способны образовывать гетероолигомерные комплексы с sHsp других типов. Формирование гетероолигомеров происходит в клетках тканей, экспрессирующих сразу несколько типов этих белков [162]. Причем в состав гетероолигомеров входят даже те белки, которые в изолированном состоянии преимущественно формируют только малые олигомерные комплексы. Например, HspB6 человека, склонный в изолированном состоянии образовывать только димеры, может взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока человека (HspB1, HspB5) и образовывать с ними крупные гетероолигомеры [30]. Пока нет точного понимания механизма формирования гетероолигомеров sHsp, однако установлено, что в условиях in vitro этот процесс происходит путем обмена мономеров указанных белков [121]. Предполагается, что благодаря формированию гетероолигомеров становится
Компьютерная модель строения В-кристаллина человека [27]. А)
Олигомер, состоящий из 24 субъединиц (4 гексамера). На переднем плане - гексамерное кольцо, звездами отмечены скопления массы по данным электронной микроскопии. Б) Участок соединения трех гексамеров. Цветными сферами отмечены фосфорилируемые остатки серина на N-конце В-кристаллина. Красный – Ser19, синий – Ser45, циановый – Ser59. Модификация этих остатков способствует диссоциации крупных олигомеров. возможным образование новых конформационных состояний sHsp, что позволяет им распознавать большее количество субстратов и белков-клиентов. Таким образом, разнообразие функций может обеспечиваться разнообразием состава и олигомерного состояния малых белков теплового шока [10, 151].
Функциональная активность малых белков теплового шока зависит от их четвертичной структуры. Считается, что при диссоциации крупных олигомеров многих sHsp происходит увеличение их шапероноподобной активности [148]. В этом случае крупные олигомеры выступают лишь в качестве "хранилища" активных элементов и могут диссоциировать вплоть до димеров [1]. Согласно другим представлениям рассматривается иной механизм действия – укрупнение олигомерных комплексов, как было показано на примере -кристаллина человека, сопровождается увеличением шапероноподобной активности [123]. Вероятно, оба механизма могут в равной степени участвовать в регуляции функционирования разных представителей семейства sHsp или в функционировании одного и того же белка малого белка теплового шока с разными белками-субстратами. Так, например, Hsp18.1 из гороха при повышении температуры образует олигомеры как большего, так и меньшего размера [157]. По отношению к прочим функциям олигомерное состояние sHsp рассматривается как некий "триггер", изменение которого приводит к "включению" или "выключению" определенных функций, например, способности взаимодействовать с тем или иным белком [10, 128].
Малые белки теплового шока могут изменять свое олигомерное состояние под действием различных факторов, например, при повышении температуры, появлении большого количества денатурированных белков или в результате фосфорилирования [1]. При этом фосфорилирование является одним из наиболее эффективных способов регуляции олигомерного состояния sHsp.
Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока
Цитоскелет клетки – комплексная сеть элементов, состоящая из микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных филаментов. Цитоскелет играет важную роль в определении формы и механической устойчивости клетки, а также в клеточном делении, мышечном сокращении, образовании клеточных контактов и процессах транспорта [179]. Нарушение целостности цитоскелета зачастую является причиной гибели клетки. Малые белки теплового шока участвуют в стабилизации практически всех элементов цитоскелета: актиновых микрофиламентов [147, 179], промежуточных филаментов [58] и микротрубочек [84], защищая их в условиях стресса и регулируя процессы сборки филаментов [179].
Постулировано участие нескольких sHsp человека (HspB1, HspB5, HspB6) в регуляции актинового цитоскелета. Однако до сих пор спорным остается вопрос о непосредственном взаимодействии малых белков теплового шока с F- или G-актином [147]. Например, было высказано предположение о том, что HspB1 является актин-кэпирующим белком, препятствующим его полимеризации [117]. При этом кэпирующая активность приписывалась только нефосфорилированным мономерам HspB1 [20]. В то же время данные литературы практически исключают наличие нефосфорилированных мономеров HspB1 в клетке [78]. Следует отметить, что более поздние исследования не подтвердили наличие прямого функционального взаимодействия актина и HspB1 [124, 132]. Однако нет сомнения в том, что HspB1 каким-то образом влияет на актиновый цитоскелет. Так в клетках, оверэкспрессирующих HspB1, наблюдается более быстрое восстановление актиновых филаментов после стресса, причем этот эффект зависит от фосфорилирования HspB1 [85], а ингибирование экспрессии HspB1 приводит к нарушению целостности актинового цитоскелета [112].
Прямое взаимодействие HspB5 и HspB6 с актином также остается спорным. В 1992 году в экспериментах Беннардини было описано взаимодействие HspB5 с актином, однако работы в этом направлении не получили продолжения [19]. Некоторые данные литературы свидетельствуют о том, что HspB5 [152] и HspB6 [99] колокализуется с актиновыми филаментами при том, что большая часть малых белков теплового шока располагается в цитозоле. Кроме того, повышенная экспрессия HspB5 препятствует повреждению актинового цитоскелета при стрессе, вызванном тепловым шоком и некоторыми реагентами, и этот эффект зависит от фосфорилирования HspB5 по остаткам Ser45 и Ser59. Ингибирование фосфорилирования указанных остатков предотвращает колокализацию HspB5 и актина [152]. HspB6 также способен защищать актиновые филаменты от повреждения. Помимо этого, данные литературы свидетельствуют о том, что фосфорилирование Ser16 HspB6 каким-то образом может приводить к расслаблению гладких мышц [140] и, по некоторым данным, деполимеризации актиновых филаментов [56]. Выдвигались различные гипотезы, объясняющие механизм действия HspB6 на актиновый цитоскелет, однако точного ответа на этот вопрос до сих пор нет [56, 120].
В отсутствие точных данных можно постулировать несколько путей, по которым осуществляется защитное действие sHsp на актиновые микрофиламенты. Во-первых, sHsp могут взаимодействовать с каким-то актин-связывающим белком или белками, оказывающими влияние на полимеризацию и стабильность филаментов. Нельзя исключить и взаимодействия sHsp с частично денатурированным актином, в том числе и в составе филаментов. Шапероноподобный эффект в этом случае может обеспечивать стабилизацию цитоскелета при стрессе. Помимо этого, малые белки теплового шока могут участвовать в защите клетки от окислительного стресса, сопровождающегося тяжелыми и зачастую необратимыми повреждениями актинового цитоскелета. Антиоксидантный эффект малых белков теплового шока будет опосредованно сказываться на стабильности актиновых филаментов. Наконец, взаимодействуя с другими элементами цитоскелета, малые белки теплового шока могут также влиять на стабильность актиновых филаментов. Конкретные ответы на вопрос о том, как sHsp влияют на актиновый цитоскелет предстоит получить в будущем [147].
Жизненно важной для функционирования клетки является сеть промежуточных филаментов. Эти элементы цитоскелета формируют оболочку ядра, а также участвуют в формировании клеточных контактов [58, 179] и позиционировании некоторых органелл [116]. Малые белки теплового шока человека взаимодействуют с различными белками промежуточных филаментов [108], регулируя формирование сети филаментов, предотвращая их агрегацию и защищая в стрессовых условиях [179]. Установлено, что HspB1 и HspB5 колокализуются с кератином 18 и GFAP (glial fibrillary acidic protein), влияя на их сборку и функционирование сети, причем указанное взаимодействие усиливается в условиях теплового шока [129]. Согласно новым данным взаимодействие HspB1 с кератином 8 и 18 способствует формированию сети относительно тонких филаментов, в то время как в отсутствие HspB1 кератиновые филаменты в процессе сборки слипаются между собой, образуя толстые, слабо ветвящиеся фибриллы [98].
HspB5 ингибирует агрегацию десмина, что, как предполагается, необходимо для поддержания стабильности сети промежуточных филаментов [58]. В связи с этим важным оказалось исследование точечного мутанта R120G HspB5, который демонстрировал повышенную склонность к агрегации и увеличенное сродство к десмину. В клетках, экспрессирующих этот мутант, наблюдалось образование агрегатов десмина. На уровне организма это приводит к развитию связанной с десмином миопатии – тяжелого наследственного заболевания, поражающего мышцы [58, 174]. Мутация R120G кристаллина приводит к значительным изменениям структуры В-кристаллина, следствием чего помимо прочего является развитие катаракты. В клетках хрусталика при этом наблюдается образование агрегатов виментина [154]. В литературе описаны мутации HspB1, которые часто коррелируют с развитием нейродегенеративной болезни Шарко-Мари-Ту второго типа [49]. Предполагается, что некоторые мутации HspB1 (например, S135F) нарушают нормальное взаимодействие HspB1 с элементами цитоскелета нейронов – микротрубочками и нейрофиламентами, что может являться причиной возникновения болезни [3].
Экспрессия химерных белков
Компетентные клетки для химической трансформации получали по методике Чанга и соавт. [41] с изменениями. Для этого 2 мл ночной культуры переносили в 200 мл среды LB, не содержащей антибиотика, и выращивали при 37С до достижения величины оптической плотности на длине волны 600 нм 0,3-0,4 ( 2 часа). Затем охлаждали колбу с культурой на льду 15 мин (далее все процедуры проводили на льду) и осаждали клетки центрифугированием 15 мин 1500 g при охлаждении. Супернатант стерильно убирали, осадок суспендировали в буфере TSS (среда Луриа-Бертани с содержанием 10% PEG6000 (wt/vol), 5% DMSO, 50 mM MgCl2, pH 6,5) в объеме 5% от начального объема культуры. Суспензию инкубировали на льду 10 минут, затем разделяли на аликвоты по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -80С.
Для экспрессии химерных белков в клетках бактерий использовали Т7 систему, описанную Стадиер в 1985 г [161]. Она является высокоселективной и позволяет получать высокие уровни синтеза целевого белка ( 50% клеточных белков). Данная система основана на использовании РНК-полимеразы бактериофага Т7. Этот фермент узнает только “свой” промотор (Т7 промотор), а кроме того синтезирует РНК до 5 раз эффективнее РНК-полимеразы E.coli , и в норме отсутствует в клетках бактерий [161]. В используемой нами системе (штаммы E.coli DE3) ген Т7 РНК-полимеразы был включен в состав бактериальной хромосомы под контролем индуцибельного lacUV5 промотора – улучшенного варианта lac-промотора клеток E.coli. lac-Промотор используется клеткой для переключения путей метаболизма: если в среде, на которой растут бактерии, присутствует глюкоза, то lac-промотор находится в репрессированном состоянии, РНК-полимераза клетки не может с ним связаться и начать синтез РНК с генов, расположенных за промотором, а клетка при этом получает энергию за счет метаболизма глюкозы. После появления в среде лактозы или ее аналогов и истощении источников глюкозы, происходит индукция lac-промотора, что приводит к экспрессии генов, расположенных за ним и отвечающих за переработку лактозы; и таким образом метаболизм клетки перестраивается на переваривание лактозы [88].
Клонируя ген Т7 РНК-полимеразы под индуцибельный промотор, мы можем регулировать наличие данного фермента в клетке, и, следовательно, синтез белков, чья кДНК располагается после Т7 промотора. При экспрессии белков это свойство используется для наращивания биомассы клеток, несущих плазмиду с каким-либо целевым белком под управлением Т7 промотора. При наращивании биомассы синтез Т7 РНК-полимеразы ингибирован, поэтому фермент в клетке имеется в следовых количествах за счет фонового уровня синтеза. После получения достаточного количества клеток осуществляют индукцию lacUV5 промотора, в клетке появляются значительные количества Т7 РНК-полимеразы и начинается широкомасштабный синтез целевого белка. Т7 промотор не узнается РНК-полимеразами бактериальной клетки, что обеспечивает специфичность синтеза. Необходимо отметить, что из-за высокой эффективности Т7 РНК-полимеразы, даже ее следовых количеств хватает для синтеза целевого белка на детектируемом уровне. Это создает проблему при экспрессии токсичных для клетки белков, так как продукты синтеза могут ингибировать жизнедеятельность или даже убивать клетку до того момента, как нарастет достаточное количество биомассы и будет осуществлена индукция lacUV5 промотора [161]. В таких случаях используются специально разработанные штаммы бактерий [118].
Для экспрессии химерных и флуоресцентных белков использовали вектор pET23b(+), который содержал кДНК целевого белка, клонированную после Т7 промотора, а также ген устойчивости к ампициллину. Этим вектором трансформировали клетки E.coli штаммов BL21 (DE3), С41 (DE3) или С43 (DE3). Необходимость использования нескольких штаммов бактерий была обусловлена тем, что С-концевые флуоресцентные химеры, как оказалось, имели склонность к агрегации в процессе синтеза. Поэтому для их получения мы пытались использовать штаммы бактерий C41 и C43, специально разработанные для экспрессии токсичных или склонных к агрегации белков [118]. Кроме того, в процессе разработки методики получения рекомбинантных белков были протестированы различные условия выращивания бактериальных культур.
Традиционно при экспрессии белков с использованием Т7 системы индукцию lacUV5 промотора осуществляют добавлением в среду искусственного аналога лактозы – изопропил--D-тиогалактопиранозида (IPTG). В нашей работе мы использовали альтернативный способ, который позволял получать большие выходы белка и который основан на явлении автоиндукции и описан Стадиер в 2005 году [160]. В ряде случаев такой метод позволяет получать большие выходы белка там, где обычная экспрессия оказывается неэффективной. Этот способ заключается в том, что клеточные культуры выращиваются в концентрированных средах (в нашем случае в трехкратной среде LB). При создании подходящих условий для роста клеточные культуры достигают больших показателей по содержанию биомассы. В таких культурах индукция lacUV5 промотора происходит автоматически, без добавления IPTG. Автоиндукция обусловлена тем, что в большинстве сред содержатся следовые количества лактозы, но до тех пор, пока в культуре мало клеток, а в среде много глюкозы или других питательных веществ, lacUV5 промотор репрессирован. Когда культура разрастается, и бактерии используют большую часть питательных веществ, следовые количества лактозы инициируют синтез Т7 РНК-полимеразы [160].
Минусом при данном способе выращивания клеточных культур является то, что следовые количества лактозы в питательных средах в большинстве случаях не входят “официально” в их состав. Их можно отнести к категории примесей, попадающих в продукт во время производства из некоторых ингредиентов. Поэтому содержание лактозы может существенно варьироваться даже в разных партиях питательной среды одного и того же производителя, что приводит к различному протеканию процессов автоиндукции при использовании других питательных сред [160]. 3.2 Тестовая экспрессия
В процессе разработки методики получения химерных белков, проводили тестовую экспрессию в различных условиях с целью определить, при каких параметрах экспрессии (температура, время инкубации) содержание целевых белков в растворимом состоянии было наибольшим. Подобранные условия затем использовали в препаративной экспрессии для получения целевого белка в приемлемых для исследований количествах.
На первом этапе работы химически трансформировали выбранный штамм E.coli и высевали бактерии на чашки Петри с питательной средой LB-агар, содержащей 100 мкг/мл ампициллина (Amp). Чашки Петри инкубировали ночь при 37С. Затем выращивали ночные культуры путем инокуляции одной бактериальной колонии с чашки Петри в пробирку с 20 мл среды Луриа-Бертани (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина (Amp). Культуры инкубировали ночь при 37С и перемешивании. Для проведения тестовой экспрессии 1 мл ночной культуры отбирали и переносили в пробирку с 19 мл питательной среды, содержащий 100 мкг/мл Amp.
В ходе тестовой экспрессии были опробованы различные условия. В первой группе экспериментов, индукцию синтеза белка проводили путем добавления IPTG до конечной концентрации 1 мМ. IPTG добавляли после того, как оптическая плотность бактериальной культуры при 600 нм достигала величины 0,5-0,6. Бактерии выращивали в однократной питательной среде LB и варьировали такие параметры, как время (5-7 или 20 часов) и температура инкубации (37С, 30С, 20С или 15С) после добавления IPTG. Во втором случае использовали явление автоиндукции. При этом бактериальные культуры выращивали в трехкратной среде Луриа-Бертани (3x LB) в 2 этапа. Сперва бактерии растили 7 часов при 37С, а затем понижали температуру (или оставляли неизменной) и продолжали инкубацию культур на качалке в течение 15-18 часов. На втором этапе инкубации варьировали температуру и выращивали бактерии при 15, 20, 25, 30 и 37С.
Исследование взаимодействий химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET)
В норме малые белки теплового шока способны образовывать гетероолигомерные комплексы, содержащие в своем составе субъединицы разной природы. Считается, что формирование гетероолигомеров повышает разнообразие конформационных состояний sHsp, и придает им способность взаимодействовать с новыми партнерами или денатурированными субстратами. Механизм формирования гетероолигомерных комплексов, а также способность отдельных малых белков теплового шока формировать гетероолигомеры являются предметом детальных исследований, а полученные к настоящему времени данные остаются довольно противоречивыми. В связи с этим использование флуоресцентных химер может позволить лучше изучить процесс формирования гетероолигомеров sHsp и их свойства. Однако прежде необходимо удостовериться, что присоединение флуоресцентного белка не приведет к существенным нарушениям при формировании гетероолигомерных комплексов sHsp.
Флуоресцентные химеры с общим типом линкера оказались способны образовывать гетероолигомерные комплексы между собой или с sHsp дикого типа и при этом сохраняли специфичность взаимодействий, характерную для белков дикого типа. Другими словами это означает, что гетероолигомерные комплексы могли образовывать только те флуоресцентные химеры, в состав которых входили малые белки теплового шока способные в изолированном состоянии взаимодействовать между собой. В то же время, если изолированные малые белки теплового шока дикого типа не были способны взаимодействовать между собой, то и химеры, имеющие в своем составе такие малые белки теплового шока, не были способны образовывать гетероолигомерные комплексы. Результаты показали, что гетероолигомеры флуоресцентных белков могли существенно отличаться от гетероолигомеров, образуемых белками дикого типа.
Так, например, HspB1 и HspB6 дикого типа формируют два вида гетероолигомерных комплексов с кажущимися молекулярными массами 300 и 110 кДа соответственно (рис. 26 А). Флуоресцентные химеры образуют только один тип гетероолигомеров с кажущейся молекулярной массой 280 кДа (рис. 26 Б). Иммунохимическое окрашивание (рис. 26 В, Г) и данные FRET (рис. 26 Д, Е) подтверждают формирование только одного типа гетероолигомерных комплексов флуоресцентными химерами HspB1 и HspB6.
Аналогичное исследование N-концевых химер HspB5 и HspB6 показало, что указанные химеры также, как и белки дикого типа, способны формировать прочные гетероолигомерные комплексы, молекулярная масса которых (330 кДа) меньше молекулярной массы гетероолигомерных комплексов сформированных белками дикого типа (470 кДа) (рис. 27 А-Е).
Может показаться странным, что даже при инкубации в условиях, препятствующих обмену субъединиц малых белков теплового шока, сигнал FRET (флуоресценция EYFP при возбуждении ECFP) детектируется во фракциях, содержащих химеры с желтым флуоресцентным белком (рис. 26-28, Д). При этом в тех же фракциях не детектируется собственной флуоресценции ECFP. Такое поведение объясняется тем, что желтый флуоресцентный белок имеет широкий пик возбуждения флуоресценции. Даже в области максимума поглощения ECFP (438 нм) располагается небольшое плечо пика возбуждения флуоресценции EYFP. Поэтому при исследовании наличия FRET в пробах, содержащих только химеры с желтым флуоресцентным белком, наблюдается ложноположительный сигнал.
Мы также исследовали взаимодействие HspB8 с HspB1 и HspB5. Метод гель фильтрации, успешно использованный при анализе взаимодействия в двух ранее описанных парах малых белков теплового шока, не позволил выявить взаимодействия HspB8 с анализируемыми белками (рис. 28 А-Е). В связи с тем, что использованные методы (FRET и иммунохимическое окрашивание) отличаются высокой чувствительностью, мы можем заключить, что ни HspB8 дикого типа, ни его флуоресцентные химеры не способны образовывать стабильные гетероолигомерные комплексы с HspB1 и HspB5. Эти результаты противоречат данным, полученным в лаборатории Бенндорфа [66]. В тоже время результаты согласуются с данными, полученными ранее в нашей лаборатории [121] и свидетельствующими, что HspB8 не способен образовывать прочные гетероолигомерные комплексы ни с одним из анализируемых sHsp. Указанное противоречие может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, в двух лабораториях использовались различные методы. Во-вторых, в работах группы Бенндорфа сами авторы указывали на противоречивость некоторых результатов и невозможность зарегистрировать формирование гетероолигомерных комплексов HspB8 в целом ряде экспериментальных условий. Номер пробы
Исследование взаимодействия HspB1 и HspB6. А) Гель-хроматография изолированного HspB1 (1), изолированного HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для наглядности кривая 3 сдвинута на 5 mAu вверх. Б) Гель-хроматография изолированного EYFP-HspB1 (1), изолированного ECFP-HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для наглядности кривая 3 сдвинута на 10 mAu вверх. В-Г) Иммунохимическое окрашивание проб после гель-хроматографии смеси FP-HspB1 и FP-HspB6, инкубированной при 4С (В) или 42С (Г). Номера проб указаны над дорожками. Д-Е) Распределение интенсивности флуоресценции ECFP, (--) и FRET () на профиле элюции смеси химерных белков, инкубированных при 4С (Д) или 42С (Е). Номер пробы
Исследование взаимодействия HspB5 и HspB6. А) Гель-хроматография изолированного HspB5 (1), изолированного HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Б) Гель-хроматография изолированного EYFP-HspB5 (1), изолированного ECFP-HspB6 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). В-Г) Иммунохимическое окрашивание проб после гель-хроматографии смеси FP-HspB5 и FP-HspB6, инкубированной при 4С (В) или 42С (Г). Номера проб указаны над дорожками. Д-Е) Распределение интенсивности флуоресценции ECFP, (--) и FRET (-Т-) на профиле элюции смеси химерных белков, инкубированных при 4С (Д) или 42С (Е). EYFP-HspBl
Исследование взаимодействия HspBl и HspB8. А) Гель-хроматография изолированного HspBl (1), изолированного HspB8 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для ясности кривая 3 сдвинута на 5 mAu вверх. Б) Гель-хроматография изолированного EYFP-HspBl (1), изолированного ECFP-HspB8 (2), смеси белков, инкубированной при 4С (3) или 42С (4). Для ясности кривая 3 сдвинута на 10 mAu вверх. В-Г) Иммунохимическое окрашивание проб после гель-хроматографии смеси FP-HspBl и FP-HspB8, инкубированной при 4С (В) или 42С (Г). Номера проб указаны над дорожками. Д-Е) Распределение интенсивности флуоресценции ECFP, (--) и FRET () на профиле элюции смеси химерных белков, инкубированных при 4С (Д) или 42С (Е). Таким образом, хотя N-концевые химеры формируют гетероолигомеры, отличающиеся по своему строению от гетероолигомеров белков дикого типа, прикрепление флуоресцентного белка не влияет на избирательность взаимодействия малых белков теплового шока. Поэтому химерные белки теоретически могут быть использованы для исследования белок-белковых между малыми белками теплового шока.
В описанных выше экспериментах мы исследовали способность различных химер образовывать гетероолигомерные комплексы. Не менее важным представлялся вопрос о том, способны ли полученные нами флуоресцентные химеры взаимодействовать с белками дикого типа. Этот вопрос становится особенно важным при экспрессии флуоресцентных химер в живых клетках.
Оказалось, что большинство N- и С-концевых химер с общим типом линкера способны взаимодействовать с соответствующими белками дикого типа, а образующиеся при этом олигомеры, содержащие в своем составе, как субъединицы белка дикого типа, так и субъединицы флуоресцентных химер, отличаются по строению от олигомеров, образованных только из субъединиц белка дикого типа. Так, например, HspB5 дикого типа образовывал смешанные олигомеры со своими N- и С-концевыми химерами (рис. 29). Если смесь исследуемых белков инкубировали в условиях, препятствующих обмену субъединиц (4С), то профиль элюции практически совпадал с алгебраической суммой профилей элюции изолированных белков (рис. 29 А, Б). Это свидетельствовало о том, что никакого обмена субъединиц не происходило. Если же белки инкубировали в условиях, способствующих быстрому протеканию обмена субъединиц (42С), то как в случае с EYFP-HspB5, так и с HspB5-EYFP можно было наблюдать формирование смешанных олигомеров (рис. 29 В, Г). Причем гетероолигомеры, сформированные с участием С-концевой химеры HspB5, сильнее отличались от олигомеров белка дикого типа, чем аналогичные гетероолигомеры, сформированные с участием N-концевой химеры. Возможно, это связано с тем, что С-концевые химеры обладают склонностью к образованию крупных комплексов и агрегации.
