Введение к работе
Актуальность темы. Изучение молекулярных основ функционирования специализированных структур тканей, органов и клеток человека-традициокная и интенсивно разрабатываемая область биохимии. Морфологическая гетерогенность уакого важного для поддержания гоме-остаза органа как почка, состоящего из целого ряда специализированных структур, и выполняющих различные функции, обуславливает сложные межклеточные взаимодействия, которые можно оценить,изучая различия в их белковом составе. Многие аспекты функционирования выдетительной системы (молекулярных основ) широко представлены в литературе. Активно изучаются структурные компоненты, формирующие разные отделы почки [Templeton et al., 1990; Хасигов П.З. и со-авт.,1996], гормональная регуляция tKoeclln et al.,1989; Tejedor et al., 1988]. механизмы реабсорбции бежа [Gelbel, 1990; Nielsen, 1990] и пр. Важная сторона исследований - изучение изменений в белках почек при различных видах патологических процессов, таких как,нарушения гомеостатической деятельности почки в утилизации азотистых продуктов распада белков, регуляции водно-солевого баланса, выполнение экскреторной, эндокриной и метаболической функций, что также широко освещено в литературе СВельтищев р.Р,, Игнатова М. С., 1992: Karam et al., 1995; Jardlne, 1995].
В соответствии с этим, проведение наиболее полной характеристики белков, составляющих почку и ее морфологические компоненты, представляет явный теоретический и практический интерес' Развитие методической базы исследований - модифицирование и разработка новых методов получения морфологических структур, а также методов разделения и анализа, . открывает новые существенные возможности получения дополнительной информации о процессах, протекающих в организме человека. За последние годы зарубежными и отечественными исследователями достигнут существенный прогресс в изучении метаболизма и функционировании почек, что выражалось в расширении наших знаний, начиная от выявления новых генов и балков, и заканчивая решением' ряда вопросов этиологии и патогенеза, а также выявлении новых био-маркеров ряда патологий почки человека [Kleppel . et al.. 1987: Furuse et al.. 1992: Кузнецов В. к. и соавт.. 1993: Sa-lusky et al.. 1995; Krleg et al.,1995; Kreisberg-et al., 19951.
Новые возможности в изучении особенностей деятельности генетического аппарата, и его продуктов, возникли благодаря техническому прогрессу, развитию биохимической и ..олекулярной генетики, обосновавшей фундаментальные положения о взаимоотношениях между генами и белками, а также развитию методологии анализа белков как продуктов генной экспрессии [Araterson and Anderson. 1982; Klose. 1995; Cells et al., 1993. 19961. Появление высокоразрешающего
двумерного (2ДЭФ) электрофореза [O'Farrell, 1975, 1977], позволяющего анализировать тысячи индивидуальных белков, стало началом формирования комплексного подхода к изучению особенностей функционирования генетического аппарата в клетках разных типов и отдельных органах и тканях. Этот подход, получивший название "системный", нашел применение в изучении геномов ряда организмов и человека [Inter.Meet. "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" 1994; Int. Meet. "From genome toproteome', 1996]. Исследования на, базе системного подхода ткани почки человека, и особенно ее структур, отражены лишь в незначительном количество публикаций, , в основном посвященных исследованиям отдельных аспектов [Smith et al.,1980; Tracy et al... 1982; Zlal et al.,1984; Кирри-лова И.А. и соавт.,І988; Ковалев Л.И. и соавт.. 1988; Хасанбаева Г. Ш. и соавт.,1992]. Вместе с тем, значительный потенциал системного подхода в изучении особенностей экспрессии генома в ткани почки остается пока неполностью использованным. ,
В настоящей работе представлены результаты изучения на базе системного подхода белкового состава ткани почки, .и,отдельных клеток и морфологических структур, с развитием унифицированного 2ДЭФ каталога белков почки, совместимого с 2ДЭФ каталогом поперечнополосатой мышечной ткани. . Для. полученной базы данных начато применение в изучении ряда патологических процессов у человека.
Цель и задачи исследования. Целью .настоящей, работы явилось
создание базы данных на основе системного анализа, для изучений
особенностей белкового состава компонентов Нефрона, включая клу
бочки, канальцы и эпителиальные клетки, а также изменений,обус
ловленных физиологическими и патологическими процессами в ткани
суммарной почки. ' .-,
В рамках исследования этих проблем в работа были поставлены
следующие задачи: ' '
-
Получение основных структурных компонентов нефронаг клубочков, проксимальных отделов канальцев и .эпителиальных клеточ Канальцев и проведение 2ДЗФ анализа ос бенностей белкового состава выделенных структур. .
-
Формирование базы данных (двумешого электрофоретического каталога белков почки человека), совместимой с базой Других тканей человека. На основе полученной базы данных' проведение анализа специфичности белкового состава разных морфологических структур.
-
Идентификация белков почки человека на 2ДЭФ картах.
„ Использование полученной базы данных для анализа изменений
в составе белков почки человека, и других объектов, при выраженных патологических поражениях почек.
Научная новизна работы. С помощью модификации метода О'Фаррел-ла построена 2ДЭФ карта и каталог распределения 190 наиболее представленных белков почки, отдельных морфологических' структур и клеток почки, в диапазоне Мм 12,5-200 кДа и pi 4,8-7,20. Для 190 полипептидных Фракций определены значения мол. массы и pi. Каталог1 сделан в единой системе обозначений, и совместим с существую-. щим каталогим поперечнополосатой мышечной ткани человека, что позволило расширить сводный каталог до 482 полипептидов. На построенной карте идентифицированы 3 полипептидные фракции.
Оптимизирована методика получения эпителиальных клеток проксимальных канальцев почки. Проведен 2ДЭФ анализ белкового состава суммарной почки И отдельных морфологических структур. Впер- ые получены данные по особенностям—белкового состава эпителиальных клеток Проксимальных канальцев. Проведено изучение и выявлен ряд белков, специфичных для ряда морфо-функциональных структур нефро-на. которые могут являться потенциальными маркерами поражения соответствующих структур.
Изучена возможность использования . полученных результатов для анализа патологических образцов. Выявлено при хроническом отторжении трансплантата сердца появление в ткани почки в атипичных количествах белков, идентифицированных микросеквенированием- как <-цепь В кристаллика ( В) и его продукта деградации, возможно кар-диального генеза. Tatotte, обнаружено появление в ткани почки при терминальной стадии хронической почечной недостаточности в выраженных количествах атипичного варианта белка, идентифицированного микросеквенированием как гдицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа. . Теоретическая и практическая значимость работы: Охарактеризован комплекс 19Q основных белков ткани цельной почки, отдельных морфологических структур и клеток почки, которые можно рассматривать как своеобразный "белковый портрет" исследованных объектов. Полученная информация использована для формирования наиболее пол-' ной огодной базы данных белков почек человека.
Построенная двумерная карта белков почки и ее компонентов открывает возможности, изучения изменений белкового спектра по 190 полипептидным фракциям при различных физиологических и патологических состояниях, и открывает возможности исследования молекулярных механизмов функционирования экскреторной системы человека.
Использование полученной базы данных позволило выявить ряд
белков-маркеров, как отторжения трансплантатов миокарда и почки, тал и хронической почечной недостаточности, что открывает новые возможности в изучении патогенеза этих патологических процессов.
Внедрдние результатов работы. Практические рекомендацич, разработанные по результатам проведенного исследования применяются.в практической работе кафедры биохимии Московской медицинской академии им, И. М.Сеченова, Москва; кафедры гистологии Северо-Осе-тинской" медицинской академии, Владикавказ; Медико-генетическом научном центре РАМН, Институте оиомедицинокой химии РАМН, Москва; ЙШ наследственных и вродденных заболеваний Ш Белоруссии, Минск.
Основные положения, выносимые на защиту,
-
На основе фракционирования белковых экстрактов почки человека, з также отделов и ряда морфо-функщганалъных структур и клеток почки ДЭФ по О'Фзрреллу постройча схема распределения наиболее представленных белков, отражающая особенности их белкового состава Комплекс основных белков почки человека в координатах иэоэлектрическая точка/' мол. масса, дополненный информацией по белкам эпителиальных клеток, составил 190 полипептидов.
-
Полученные данные суммированы с двумерным электрофоретичес-ким каталогом белков поперечнополосатой мышечной ткани человека и сводный каталог- расширен с 312 до 482 полипептидов.
3. Идентифицированы на двумерной карге, используя микросекве-
'ниров ние, полипептидные пятна Б криоталлина, митохондриальной
суперокснддисмутазы -и фасфатидилэтаноламин связывающего белка.
4. Выявлен ряд изменений в белковом составе почки, представля
ющих интерес как бпо-маркери патологии: появление при хроническом
отторжении трансплантата сердца в ткани почки в атипичных коли
чества;: белков, идентифицированных микрсоеквенированием как В
крисТаллин и его. продукт деградации, и при терминальной почечной
недостаточности появление, атипичного белка, идентифицированного
мнкросеквенированием как глицеральдегид-3-фосфзт дегидрогенаеа.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на. Международной встрече злектрофоретического общества (QUA,1991), на 22 Международной встрече ФЕБО (Швеция,1993), на 16 международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия, 19&4). на . (Ill) Российском съезде медицинских генетиков (Мссквз, 1994), на Ученом Совете Северо-Осетинской медицинской академии (1997).
Публикации. Пс теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Of<гем и структура диссертации Диссертация содержит следующие раз; -лы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследовании, реэуль-таты и обсуждение, выроды, заключение, список литературы. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 таблиц «и и 16 рисунками. Список литературы со-рердит 201 источник, включая 1Б9 работ зарубежных авторов.
