Введение к работе
Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) - широко распространенная группа белков с молекулярной массой мономера от 12 до 43 кДа (8, 21). Отличительной чертой всех белков этого семейства является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, состоящего из 80-90 аминокислотных остатков и получившего свое название от белка а-кристаллина, в составе которого он был впервые обнаружен. sHsp склонны к образованию крупных олигомерных комплексов, размер которых может достигать 600-700 кДа (16). Все члены семейства обладают так называемой шапероноподобной активностью, т.е. способны связывать частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации (8). Помимо этого малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции протеолитической деградации денатурированных белков (7), тем самым защищая клетку от накопления агрегатов поврежденных белков. Кроме того, считается, что sHsp могут участвовать в регуляции сократительного аппарата и цитоскелета, клеточной подвижности, а также в защите клетки от окислительного стресса, регуляции процессов пролиферации и апоптоза (1). Функционирование малых белков теплового шока может регулироваться разными способами, в частности, путем фосфорилирования, катализируемого различными протеинкиназами. Фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние sHsp (1), их взаимодействие с белками-партнерами (4) и шапероноподобную активность (8).
В настоящее время в геноме человека найдено 10 генов, кодирующих малые белки
теплового шока, и свойства некоторых представителей этого семейства белков (аА- и аВ-
кристаллины, Hsp27) достаточно подробно изучены. Сравнительно недавно описанный белок
Hsp22 (HspB8, НИ киназа, продукт гена E2IG1) на начальных этапах исследования относили
к классу протеинкиназ (19), однако позднее было показано наличие в его структуре а-
кристаллинового домена (2) и отсутствие протеинкиназной активности (12). Данные
двумерного электрофореза свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих Hsp22,
который является типичным представителем семейства малых белков теплового шока, может
находиться в фосфорилированном состоянии (2). В условиях in vivo в разных тканях
фосфорилированию могут подвергаться остатки Ser24 и Thr/Ser87 Hsp22 (3, 6).
Список сокращений: цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ГА - глутаровый альдегид; ДМС - диметилсуберимидат; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотрейтол; МЭ - (3-меркаптоэтанол; ПААГ - полиакриламидный гель; ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа; ФМСФ - фенилметилсульфанилфторид; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; ERK1 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1)- киназа, активируемая внеклеточными сигналами; TLCK - N-тозил-Ь-лизин гидрохлорид хлорметилкетона; wt - белок дикого типа.
Протеинкиназы, участвующие в фосфорилировании Hsp22, остаются не установленными, однако обнаружено, что несколько протеинкиназ (протеинкиназа С, казеинкиназа второго типа и ERK1 киназа) способны фосфорилировать Hsp22 в условиях in vitro (2). Кроме того, анализ первичной структуры Hsp22, проведенный с использованием программы NetPhos 2.0, свидетельствует о том, что в структуре этого белка есть остатки (Ser24 и Ser57), расположенные в последовательностях, узнаваемых и фосфорилируемых протеинкиназой А. Таким образом, к настоящему моменту накоплено большое количество экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о том, что Hsp22 может подвергаться фосфорилированию. В то же время в литературе нет данных о том, каким образом фосфорилирование влияет на структуру и свойства этого белка.
Цель и задачи работы. Целью данной работы был анализ влияния фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и свойства Hsp22. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Изучить процесс фосфорилирования Hsp22 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы ERK1.
При помощи различных методов исследовать влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование на вторичную, третичную и четвертичную структуру Hsp22.
3. Изучить влияние фосфорилирования на шапероноподобную активность Hsp22.
Основные положения, выносимые на защиту.
Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа может фосфорилировать Ser57, а протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22. При этом по данным литературы остатки Ser24 и Thr87 могут быть фосфорилированы в условиях in vivo.
Фосфорилирование (или точечные мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на различные уровни структурной организации и стабилизируют димеры Hsp22 при низкой концентрации белка.
Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на шапероноподобную активность Hsp22.
Научная новизна и практическая ценность работы. Проанализирован процесс фосфорилирования Hsp22 под действием двух протеинкиназ. Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа в условиях in vitro фосфорилирует Ser57 Hsp22. Протеинкиназа ERK1 в условиях in vitro фосфорилирует остатки Ser24, Ser27 и Thr87, при этом остатки Ser24 и Thr87 могут находиться в фосфорилированном состоянии в условиях in vivo. Данные
спектроскопии кругового дихроизма свидетельствуют о том, что значительная часть структуры Hsp22 неупорядочена, при этом разведение приводит к дальнейшему разупорядочиванию структуры белка. Этот эффект может быть связан с происходящей при разведении диссоциацией димеров Hsp22. Используя методы гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования, установили, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) увеличивают вероятность образования димеров Hsp22. Фосфорилирование (или мутации, имитирующее фосфорилирование) остатков, расположенных в N-концевой части Hsp22 (Ser24, Ser27, Ser57), уменьшают шапероноподобную активность Hsp22, в то время как фосфорилирование Thr87, расположенного в центральной части белка, приводит к увеличению шапероноподобной активности Hsp22. Таким образом, установлено, что фосфорилирование влияет на структуру и шапероноподобную активность Hsp22. Полученные экспериментальные данные позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования Hsp22, что особенно важно, учитывая существенную роль, которая отводится Hsp22 в регуляции процессов протеолиза, пролиферации и апоптоза, а также тот факт, что точечные мутации Hsp22 коррелируют с развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ; на 33-м и на 35-м Конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ в Афинах (2008 г.) и в Гетеборге (2010 г.); на 10-м Форуме Молодых Ученых Федерации Европейских Биохимических Обществ в Гетеборге (2010 г.); на Второй международной конференции по стрессу в Будапеште (2007 г.); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2007 и 2010 годах (Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 3 статьи и 5 тезисов сообщений.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 111 страницах печатного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование.
