Введение к работе
Актуальность темы. Одним из наиболее распространенных и эффективных способов регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки являются различные посттрансляционные модификации, среди которых особое значение имеет фосфорилирование. Этот процесс, катализируемый протеинкиназами, сопровождается переносом остатка фосфата от АТР на спиртовые группы аминокислот, что приводит к появлению дополнительного отрицательного заряда и зачастую приводит к изменению структуры и свойств белка, а также его способности взаимодействовать с другими белками. В настоящее время обнаружено несколько белков-адаптеров, узнающих и связывающих фосфорилированные белки-субстраты. Одним из таких белков является белок 14-3-3, способный узнавать участки фосфорилирования, расположенные в характерных последовательностях, и способный взаимодействовать более чем с 200 различными белками эукариотической клетки [1].
Белки семейства 14-3-3 широко распространены среди эукариот, причем, за редким исключением, у каждого организма найдено несколько изоформ 14-3-3. Семь изоформ 14-3-3 человека обозначаются греческими буквами от а до о [2, 3] и кодируются разными генами [4]. Будучи небольшими белками с массой около 30 кДа, представители семейства 14-3-3 формируют гомо- или гетеродимеры [5], каждая субъединица которых содержит по одному центру связывания фосфосерина/фосфотреонина в белках-партнерах [6]. Считается, что для нормального функционирования необходима именно димерная структура 14-3-3 [7]. Взаимодействуя с различными белками-субстратами, 14-3-3 принимают участие в регуляции апоптоза, клеточного деления, транскрипции, передаче внутриклеточного сигнала, контролируют функционирование ионных каналов и многие другие процессы. Благодаря распространению белков 14-3-3 практически во всех тканях человека [8] и вовлеченности в ключевые процессы жизнедеятельности клетки [9], это семейство белков является предметом пристального внимания и объектом постоянно расширяющихся исследований.
14-3-3 преимущественно взаимодействуют с фосфор илированными белками-партнерами. При этом связывание белков-мишеней может зависеть не только от их фосфорилирования, но может регулироваться путем фосфорилирования 14-3-3.
Список сокращений: цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ДМС -диметилсуберимидат; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотрейтол; МЭ - (3-меркаптоэтанол; ПААГ - полиакриламидный гель; ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа; ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; тЗ - короткая изоформа may белка; ТФХК - ТЧ-тозил-Ь-фенилаланин хлорметилкетон; WT - белок дикого типа; ЗА - тройная мутантная форма may с заменами Serl56, Ser235, Ser267 на аланин; ЗЕ - тройная мутантная форма 14-3-3 с заменами Ser58, Serl84 и Thr232 на остатки глутаминовой кислоты, имитирующими фосфорилирование.
Фосфорилирование различных изоформ 14-3-3 изучено достаточно подробно, при этом установлено, что Ser58, Serl84 и Thr232 в структуре 14-3-3^ могут фосфорилироваться как in vitro, так и in vivo [3, 10, 11]. В литературе есть разрозненные данные о влиянии фосфорилирования на взаимодействие 14-3-3 с различными белками, вовлеченными в регуляцию апоптоза, а также некоторыми протеинкиназами. В то же время, в литературе практически нет данных о влиянии фосфорилирования (или мутаций, имитирующих фосфор илирование) на структуру и физико-химические свойства 14-3-3. Кроме того, набор исследованных белков-мишеней, взаимодействие с которыми регулируется путем фосфорилирования 14-3-3, крайне ограничен и практически не включает в себя белки цитоскелета.
В этой связи представлялось целесообразным исследовать влияние фосфорилирования 14-3-3^ на его физико-химические свойства и взаимодействие с белками-мишенями. К сожалению, детальный анализ влияния фосфорилирования на свойства белка затруднен (а зачастую технически не выполним) из-за того, что невозможно получить препаративные количества исследуемого белка с высокой степенью фосфорилирования по одному строго определенному участку. По этой причине исследование функциональной роли фосфорилирования зачастую проводят на мутантах исследуемого белка, имитирующих структурные изменения, происходящие при фосфорилировании. Для этой цели фосфорилируемые остатки серина/треонина заменяют на остатки аспарагиновой или глутаминовой кислоты [12-14].
Цель и задачи работы. Целью данной работы было определение влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и физико-химические свойства 14-3-3(^, а также на взаимодействие 14-3-3^ с may белком человека. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Получить в гомогенном состоянии препараты рекомбинантного белка 14-3-3^ дикого типа и его точечных мутантных форм S58E, S184E и Т232Е, а также тройного мутанта (S58E/S184E/T232E), имитирующих структурные изменения, происходящие при фосфорилировании.
Исследовать влияние указанных мутаций на различные уровни структурной организации и некоторые физико-химические свойства 14-3-3^.
3. Определить влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, на
взаимодействие 14-3-3^ с may белком, играющим важную роль в формировании цитоскелета
нервных клеток.
4. Установить, как фосфорилирование may белка влияет на его взаимодействие с 14-
3-3(^, и определить участки may белка, обеспечивающие его взаимодействие с 14-3-3^.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Мутации, имитирующие структурные изменения, происходящие при
фосфорилировании (S58E, S184E, Т232Е и ЗЕ (S58E/S184E/T232E)), не изменяют вторичной
структуры 14-3-3(^, однако влияют на его третичную и четвертичную структуру. Мутация
S58E изменяет гидрофобные свойства 14-3-3, провоцирует диссоциацию димеров 14-3-3,
(особенно при низкой концентрации белка), а также снижает термостабильность и
устойчивость 14-3-3 к ограниченному трипсинолизу. Мутации S184E и Т232Е практически
не влияют на третичную структуру 14-3-3^ и его олигомерное состояние, лишь
незначительно изменяя гидродинамические свойства белка. При этом мутация S184E
заметно увеличивает термостабильность 14-3-3(^.
Фосфорилирование под действием протеинкиназы А (ПКА) резко увеличивает способность may белка человека взаимодействовать с 14-3-3^. Точечный мутагенез остатков серина, фосфорилируемых ПКА [15, 16], позволил установить, что участки вблизи остатков Serl56, Ser235 и/или Ser267 короткой изоформы may белка вовлечены в образование комплексов с 14-3-3(^.
Мутации S184E и Т232Е практически не влияют на способность 14-3-3^ взаимодействовать с may белком, в то время как мутация S58E снижает способность 14-3-3^ взаимодействовать с may белком, что, вероятно, связано с дестабилизацией димерной структуры 14-3-3.
Научная новизна и практическая значимость. Проведен систематический анализ влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и физико-химические свойства 14-3-3. Установлено, что мутация S58E способствует диссоциации димеров 14-3-3^. Этот эффект особенно выражен при низкой концентрации белка, и может быть уменьшен при добавлении ионов магния. Мутация S58E уменьшает термостабильность и увеличивает скорость трипсинолиза 14-3-3^. Эти результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование Ser58 дестабилизирует структуру 14-3-3^ и может увеличивать скорость его деградации в клетке. Проведенные исследования позволяют разрешить ряд противоречий, накопившихся в литературе и касающихся влияния фосфорилирования Ser58 на структуру 14-3-3^ [11, 12, 17], а также охарактеризовать изменения структуры, происходящие при введении точечных мутаций, имитирующих фосфорилирование двух других остатков 14-3-3^- Serl84 и Thr232.
Проведен систематический анализ влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его взаимодействие с may белком, играющим важную роль в развитии многих нейродегенеративных заболеваний [18]. Тау белок является одним из очень немногих цитоскелетных белков, взаимодействие которых с 14-3-3 было постулировано, но
лишь поверхностно описано в литературе [19]. Установлено, что фосфорилирование под действием ПК А значительно усиливает взаимодействие may с 14-3-3. Показано, что фосфорилирование трех остатков серина (Serl56, Ser235 и Ser267) обеспечивает прочное взаимодействие may с 14-3-3(^. Обнаружено, что мутация S58E, дестабилизирующая структуру димеров 14-3-3(^, значительно ослабляет его взаимодействие с may белком.
Оптимизированы методы выделения и очистки рекомбинантных 14-3-3^ и may белка, что позволило получать -100 мг 14-3-3 и 2-5 мг may с 1 литра бактериальной культуры. Разработанные методы могут быть использованы в исследованиях как белков дикого типа, так и их точечных мутантов.
Обнаруженное в работе влияние фосфорилирования на взаимодействие 14-3-3 с may белком может оказаться полезным при разработке новых подходов к лечению различных нейродегенеративных заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2008, 2009 и 2010 гг. (Москва), на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» в 2010 г. (Пущино), на 34-м и 35-м Международных Конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2009 г. (Прага, Чешская республика) и 2010 г. (Ґетеборг, Швеция), на Форуме Молодых Ученых и 12-й конференции Международного Союза Биохимиков и Молекулярных Биологов (IUBMB) в 2010 г. (Мельбурн, Австралия).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, включая 6 статей в рецензируемых журналах и 7 тезисов сообщений.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 10 таблицами. Список цитированной литературы содержит 234 наименования.
