Введение к работе
Актуальность темы. Молибдокофастор (Мосо) - каталитический центр всех, за исключением китрогеназы, молибден-содержащих ферментов, играющих существенную роль в жизнедеятельности бактерий, водорослей, грибов, растений и животных. Список этих ферментов включает в себя гидроксилазы, оксидоредуктазы и дегидрогеназы, которые катализируют биохимические превращения азота, углерода и серы. Молибден-содержащие ферменты участвуют в ассимиляции нитратного азота, окислении альдегидов и сульфитов, в метаболизме пуринов и других N-гетероциклических соединений.
Необходимость изучения молибдокофактора диктуется той ролью, которую играют молибдоферменты в биосфере. Например, с помощью нитратной ассимиляции, по данным Гуерреро (Guerrero et al., 1981), усваивается по приблизительным оценкам более чем 2x104 мегатонн органического азота в год, что на два порядка выше, чем усвоение атмосферного азота в процессе азотфиксации. Благодаря нитратной ассимиляции удовлетворяются потребности в азоте всех форм жизни на земле. Ключевым звеном в иепи реакций, осуществляющих этот процесс, является первая лимитирующая реакция, катализируемая одним из важнейших молибдоферментов - нитратредуктазой.
Исследование Мосо является фундаментальной проблемой, решение которой позволит понять механизмы функционирования каталитических центров молибдоферментов. Отсутствие Мосо или дефекты в структуре кофактора в результате мутаций или нарушения регуляции биосинтеза приводят к потере ферментативной активности молибдоферментов и, как следствие, к серьезным нарушениям обмена веществ. Так, например, нарушения в биосинтезе молибдокофактора у человека приводят к ряду тяжелых урологических и неврологических заболеваний, поэтому исследование Мосо имеет также большую медицинскую значимость.
Молибдокофактор растений в отличие от Мосо бактериального и животного происхождения изучен в наименьшей степени и представлен главным образом, в составе двух Mo-ферментов (нитратредуктазы и ксантиндегидрогеназы), а также белков растений, не обладающих активностями Мо-ферментов.
Аккумуляция молибдокофактора в семенах гороха имеет генотипическуто обуслошіенность. Накопление "семенного" Мосо связано с физиолого-биохимическимн показателями растения. Следовательно.
подробное." изучение свойств, форм и механизмов запасания кофактора в семенах важно для понимания физиологического смысла его накопления и может иметь методическое значение в селекционно-генетических исследованиях. Неизвестны, также пути биосинтеза Мосо, поэтому поиск и идучение возможных предшественников кофактора представляет несомненный интерес.
Цель и задачи исследования. Для выделения и исследования структуры Мосо наша работа строилась на использовании в качестве материала двух совершенно разных молибдоферментов с контрастными свойствами: а) по филогенетическому (эукариот и прокариот) происхождению, б) по величине и сложности организации его белковой структуры. Были выбраны ксантиноксидаза молока с . молекулярной массой 300 кДа и нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина с молекулярной массой 67 кДа. В то же время эти ферменты, благодаря содержанию Мосо, обладали способностью осуществлять одну и ту же реакцию восстановления нитратов с участием исскуственного донора электронов (метилвиологена).
В нашей лаборатории было обнаружено присутствие Мосо-содержащих белков, не обладающих активностями Mo-ферментов в семенах бобовых растений, в частности у гороха (Швецов и др., 1992). Обнаружение связанной с неферментативным белком формы Мосо, позволило начать сравнительное изучение и идентификацию этой формы кофактора у высших растений.
Таким образом ,в можно суммировать задачи, которые решались в настоящей работе:
-
Расшифровка структуры и изучение свойств молибденового кофактора молибдоферментов из организмов прокариотического и эукариотического происхождения.
-
Исследование форм молибдокофактора не связанных с молибдоферментами.
Научная новизна работы. 1. Сравнительное изучение продуктов окисления Мосо из источников бактериального (нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина), животного (ксантиноксидаза молока) и растительного (Мосо-содержащий белок семян гороха) происхождения позволило расшифровать химическую структуру молибдокофактора и показать единство основы кофактора, представляющего собой уникальный серусодержащий птерин с боковой цепью в 6-положении, конечным продуктом окисления которого является
птерин-6-карбоновая кислота. В.На основе изучения продуктов окисления Мосо выдвинута теоретическая модель координационной структуры молибденового центра кофактора, существеной особенностью которой является участие птеринового кольца кофактора в координации молибдена наряду с одной из двух тиольных групп боковой цепи..-?. Впервые выделен и охарактеризован не лвляющися молибдоферментом растительный Мосо-содержащий белок гомодимер с молекулярной массой 300 кДа, который аккумулирует преобладающую часть молибдокофактора в семенах гороха. Впервые выделен и идентифицирован молибденовый кофактор высших растений, относящийся к мононуклеотидной форме (характерной также для Мосо животного происхождения), входящий в состав Мосо-содержащего белка семян гороха.
Практическая ценность работы. Разработанный способ очистки до гомогенного состояния Мосо-содержащего белка может быть использован для дальнейшего изучения Мосо, а также применяться в медицинских целях, в качестве препарата при лечении различных заболеваний, связанных с недостатком или нарушениями в биосинтезе Мосо в организме (Подана заявка на' изобретение N 95114012 от 14.08.95). Модификация метода определения активности Мосо в растительном материале может быть применена для определения содержания активного Мосо из других источников растительного происхождения.
Апробация. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях" (Алма-Ата, 1981), . IX Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов в биологии (Кишинев, 1981), Всесоюзном совещании "Экологические последствия использования агрохимикатов /удобрения/" (Пущино, 1982), 5-ой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Целиноград,' 1984), V Всесоюзном" биохимическом съезде (Киев, 1985), IV Конференции биохимиков респ. Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), X Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов (Чебоксары, 1986), XIV Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография физиологически активных препаратов на полимерных сорбентах" (Ленинград, 1988), Международной конференции по проблемам современной физико-химической биологии и биотехнологии (Алма-Ата, 1989), IV Международном симпозиуме по ассимиляции неорганического азота (Зеехайм, Дармштадт, Германия, 1995).
Работа была дважды удостоена второй премии на конкурсе лучших научных работ Института биохимии им. А.Н.Баха РАН (в 1988 и 1995 годах).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ и две приняты к печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа наложена на 230 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения и выводов. Работа содержит 52 рисунка и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 259 публикаций.
