Множественные формы протеинкиназ из клеток асцитной карциномы Эрлиха Токмаков Александр Александрович

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Токмаков Александр Александрович. Множественные формы протеинкиназ из клеток асцитной карциномы Эрлиха : ил РГБ ОД 61:85-3/885

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛЖЕРАТУШ

сАМР-зависимые протеинкиназы 9
сАМР-связыващие белки 21
сАМР-независимые протеинкиназы 28
Активность протеинкиназ в клеточном цикле 36
Активность протеинкиназ в трансформированной ткани молочной железы ". 44

ЭКОПЕШ/ШНТАЛШАЯ ЧАСТЬ

Материалы 50

Методы 50

Культивирование клеток асцитной карциномы Эрлиха 51
Фракционирование клеток асцитной карциномы Эрлиха методом седиментации в градиенте плотности сахарозы.... 51
Определение S - фазы в клеточном цикле клеток Эрлиха.. 53
Выделение и фракционирование протеинкиназ 53
Определение активности протеинкиназ 55
Определение сАМР-связывающей способности. 57
Выделение ингибитора каталитической активности сАМР-зависимых протеинкиназ 60
Получение дефосфорилированного казеина 61
Получение препаратов гистонов 61

10. Определение молекулярного веса ферментов

методом гельфильтрации 63

Определение концентрации белка 63
Приложение !5 I. Инструкция по использованию биохимического набора для определения протеинкиназной активности 64
Приложение № 2. Инструкция по использованию биохимического набора для определения сМР-связывающей способности 71

РЕЗУЛЬТАТЫ

Общая характеристика множественных форм протеинкиназ клеток асцитной карциномы Эрлиха...". 75
Свойства казеинкиназ клеток асцитной карциномы Эрлиха 85
Динамика изменений протеинкиназнои активности в ходе роста опухоли Эрлиха и в клеточном цикле

клеток асцитной карциномы Эрлиха 95

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102

ВЫВОДЫ 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

СІЖСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ

ATP - аденозинтрифосфорная кислота

сАГЛР - вдклический-3', 5'-аденозин'монофосфат

GTP - гуанозинтрифосфорная кислота

cGMP - циклический-3', б'-гуанозинмонофосфат

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха

АСО - активностное соотношение

ДМЕА - диметилбензантрацен

ДЭАЭ-

целлкшоза - диэтилашноэтил целлюлоза

ДТТ - дитиотреитол

ИШК - 3-изобутил - 1-метилксантин

MES - морфолиноэтансульфонат

РОРОР - 1,4 ди/2 (5 фенилоксизоил) - бензол

РРО - 2,5 дифенил оксазолил

трис - амино-2 - (гидроксшдетил) - 1,3 - пропандиол

Ш - трихлоруксусная кислота

ФМСФ - фенилметилсульфонилфлюорид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА - этиленгликоль-бис - (2-аминоэтил) - N,H - тетраук-

сусная кислота

Введение к работе

Одной из основных задач современной энзимологии является расшифровка тонких механизмов регуляции функциональной активности клетки. Сложные и многоступенчатые метаболические процессы предполагают наличие разветвленной, хорошо скоординированной системы их регуляции, адекватно реагирующей на любые изменения внешней и внутренней среды. В последние годы накопилось множество фактов, свидетельствующих о том, что реакции фосфорилирования белков служат медиаторами регуляторних сигналов в клетке. В настоящее время уже не подвергается сомнению положение об уникальной регуляторной роли фосфорилированных белков, действующих как физиологические эффекторы при опосредовании влияния самых различных регуляторних агентов, таких как кальций, циклонуклеотиды, стероидные гормоны и др. ( Greengard, 1978 ).

Регуляторная роль процессов фосфорилирования представляется еще более важной, если принять во внимание последние данные о том, что энзиматические посттрансляционные модификации белков, такие как метилирование, ацетилирование, поли-ADP - рибозилиро-вание, видніло, также регулируются через систему протеинфосфори-лирования. Так, изменение уровня фосфорилирования гистонспеци-фичных ацетилаз и метилаз приводит к модуляции их ферментативной активности. Фосфорилирование белковой молекулы по остаткам сери-на делает невозможным её поли-ADP - рибозилирование в данных сайтах.

Фосфорилирование белков в клетке представляет собой энзима-тический процесс, осуществляемый при участии специфических ферментов - протеинкиназ. Согласованность действия этих ферментов наряду со строгими различиями их субстратной специфичности, а также способность к модуляции ферментативной активности различными эффекторами обеспечивают строго дифференциированную и направленную регуляцию уровня фосфорилирования белков-субстратов.

Открытие циклических нуклеотидов ознаменовало собой начало новой эпохи в изучении механизмов регуляции клеточных процессов (Sutherland, i960 )_# обнаружение сМР-зависимых протеинкиназ привело к установлению того факта, что регуляция уровня активности этих ферментов является, по-видимому, основной функцией оАМР в клетке и опосредует все биологические эффекты циклонуклеотида. сЖР-зависимые протеинкиназы фосфорилируют разнообразные белковые субстраты, включая ферменты многих метаболических путей, а также структурные белки, такие, например, как гистоны.

Вместе с тем, и циклонуклеотид-независимые протеинкиназы также играют важную регуляторную роль в клетке. Так, по-видимому, исключительно велика роль протеинкиназ кислых белков, ввиду обнаруженной положительной корреляции между уровнем фосфорилирования кислых ядерных белков и уровнем транскрипционной активности хроматина (Philips et al., 1979 ).

Среди многочисленных процессов, регуляция которых осуществляется при участии системы протеинфосфорилирования, процесс клеточной пролиферации и выяснение механизмов его регуляции занимают особое место. Понимание этих механизмов связано с решением таких актуальных на сегодняшний день проблем, как злокачественная трансформация, дифференцировка, эмбриональное развитие.

В последние годы было показано, что характер фосфорилирования белков значительно изменяется как в ходе пролифера-тивного. процесса, так и при переходе клеток от пролиферации к покою, а также при воздействии на покоящиеся клетки стимуляторов пролиферации (Епифанова и др., 1983; Нестерова и др., 1981).

Несмотря на значительные успехи в изучении физико-химических и кинетических свойств протеишшназ, вопрос о их биологической роли и, в частности, о роли в регуляции процесса клеточной пролиферации остается открытым. Обзор имеющейся по этой теме литературы показывает, что исследования закономерностей изменений протеинкиназнои активности в клеточном цикле немногочисленны и ограничены достаточно узким крутом изучаемых объектов, что объясняется, в первую очередь, сложностью получения синхронизированных клеточных культур.

В настоящей работе мы использовали в качестве объекта исследований клетки быстрорастущей перевиваемой на мышах асцитнои опухоли молочной железы - асцитнои карциномы Эрлиха. Сравнительная простота поддержания культуры, а также возможность получения большого количества биоматериала, достаточного для проведения биохимического анализа, во многом способствовали выбору этого объекта. Применение метода фракционирования клеток в градиенте плотности сахарозы позволило быстро и в достаточных количествах получать клетки на различных стадиях митотического цикла. Еще одним важным свойством исследуемых клеток является их опухолевый характер, что позволяет говорить о закономерностях изменений протеинкиназнои активности, связанных с опухолевым ростом.

Основные задачи данного исследования состояли в следующем: определить состав множественных форм протеишшназ в цитоплазме клеток асцитнои карциномы Эрлиха, включая сШР-зависи-мые протеинкиназы, сАМР-связывакщие белки, никлонуклеотид-неза-висимые протеинкиназы кислых белков, охарактеризовать обнаруженные ферменты по их кинетическим и физико-химическим свойствам, исследовать характер изменений протеинкиназной активности в процессе роста опухоли Эрлиха в условиях in vivo, исследовать характер изменений активности протеинкиназ в ходе клеточного цикла клеток асцитнои карциномы Эржиха.

9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. сАМР-ЗШСИШЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ

Фосфорилирование белков представляет собой каталитический процесс, осуществляемый специфическими ферментами, протеинкина-зами (АТР:протеин фосфотрансферази Ш 2.7.1.37). Протеинкиназы катализируют перенос терминального Y~ фосфата АТР на различные акцепторы, главным образом, на гидроксильные группы серина и треонина белков. аАМР-зависимые протеишшназы, найденные первоначально в скелетной мышце ( Walsh et al. , 1968), широко распространены и были обнаружены во всех животных клетках. Способность к стимуляции сАМР этих ферментов оказалась общим механизмом действия сАМР в клетках зукариот (рис. I). Участие протеинкиназ в шюгочисленных клеточных процессах дало основание предположить, что они опосредуют все эффекты сЖР в зукариотических клетках ( Кио, \/ Greengard _t 1969). Уникальная регуляторная роль сАМР, являющегося "вторичным посредником" при действии на клетки многочисленных гормонов ( Sutherland , I960), большое количество важнейших процессов, находящихся под контролем системы щклонуклеотидов, таких как гликолиз ( Krebs et al. , 1968), липолиз ( Soder -ling et al. _f 1973), клеточный рост ( Епифанова и др., 1983), а также важная роль фосфорилированных белков в регуляции индукции ферментов и генетической активности клетки стимулировали многочисленные исследования сЖР-заБИСимых протеинкиназ и механизмов их действия.

Было показано, что сАМР-зависимые протеинкиназы состоят из двух типов субъединиц: регуляторной (S), которая связывает оАМР, и каталитической (С), осуществляющей фосфорилирование белков-субстратов (Gill, Garren , 1971;Rosen et al., 1975). Холоэнзим представляет собой тетрамер, содержащий 2в и 2С субъединицы и способный диссоциировать под действием а/ШЕР.

В холоферменте активный центр каталитической субъединицы блокируется R-субъединицей. Взаимодействие сАМР с регуляторной субъединицей вызывают конформационные изменения, которые приводят к диссоциации протеинкиназы и высвобождению каталитически-актив-ной С-субъедшшцы, согласно следующей схеме:

Стехиометрия описанного процесса активации изучена в ряде работ ( Gorbin et al. , 1978*, Builder et al. , I960). Более подробно процесс диссоциации рассмотрен в разделе 2 литобзора. оАМР-зависимые протеинкиназы локализованы, главным образом, в цитозольной фракции клеток ( Hofmaim et al. , 1977). Однако, в тканях мозга и сердца обнаружена значительная доля (30-50$) мембранно связанных протеинкиназ ( Corbin et al. , 1977', Rubin et al. 1979). Более 70$ общей сіШР-зависимой протеинкиназной активности локализовано во фракции мембран эритроцитов человека ( Rubin et al. , 1972).

Было очищено и охарактеризовано две основных формы сАМР-за-висимых протеинкиназ: протеинкиназы I и П типов, согласно порядку их элюции с ДЭАЭ-целлюяозы (Corbin et аЦ 1975). С-субъедини-цы протеинкиназ I и П типа функционально и структурно схожи и имеют одинаковый молекулярный вес - 40000 (Doskeland, Ogreid , 1981). Регуляторные субъединицы аАМР-зависимых протеинкиназ (И и Ш) отличаются иммунологически (Fleischer et al., 1976) и имеют различные молекулярные веса - 47000 и 55000, соответственно ( Zoiier et al. _t 1979). При этом предполагается, что KI не является протеолитическим фрагментом Ш ( Zoller et al. , 1979).

Относительное содержание протеинкиназ I и П типов в тканях гормон аденилат цикпаза (росфоди эстераза * _sm?

5єаои npomuHKunasa, ₅_еш__Р0(росратаза . ч метаболический от 3 em

Рис. І. Ферменты системы cAMP ( Greengard , 1978). и клетках существенно варьирует. Так, например, в скелетной мышце быка обнаружена только протеинкиназа I типа ( Hofmann et al» , 1975), в то время как в сердце преобладает протеинкиназа П ( Corbin et al, , 1975). Кроме того, относительное содержание протеинкиназ меняется в ходе клеточного цикла ( Costa et al., 1976). В настоящее время биологическая значимость существования двух типов оАМР-зависимых протеинкиназ неясна. Опыты с мутантними фибробластами (СНО клетки), в цитозоле которых отсутствует протеинкиназа I или протеишшназа. II, или даже обе сЖР-зависимые протеинкиназы показывают, что все такие мутанты обладают способностью к нормальной пролиферации, однако, при этом наблюдаются значительные изменения в спектрах фосфорилированных клеточных белков ( Gottesman et al., 1981).

Кинетические свойства двух типов протеинкиназ близки. Так, сЖР-зависимые протеинкиназы I и П типа из цитоплазмы клеток СНО элюируются с ДЭАЭ-целлюлозы 50 и 150 мМ NaCl , соответственно. Код дар составляют для них 0,76 х Ю^-4 М и 0,88 х 10"^ М, К_а _сЖР - 5,5 х Ю"⁸ М и 6,0 х Ю"⁸ М, К_д _оДМр - 1,3 х Ю"⁸ М и 1,3 х 10 М. Однако, если протеинкиназа I активируется сМІР в 10 раз, то протеинкиназа П лишь в два раза. Кроме того, наблюдаются определенные различия в субстратной специфичности этих ферментов; протеинкиназа I проявляет высокую специфичность по отношению к суммарному гистону, тогда как протеишшназа П предпочтительно фосфорилирует фосфитин (Li, Hsie, 1978). сАМР-зависимая протешікшіаза І типа характеризуется по отношению к протеинкиназе П типа более быстрой диссоциацией холофермента и медленной ассоциацией Е и С субъединиц в отсутствие сАМР, наличием высокоафинного связывающего сайта для MgATP (К_д = 50-I00mJ повышенной чувствительностью к диссощшрующему влиянию .NaCl. ( Kuo, 1980). Показано также, что MgATP уменьшает сродство про-теинкиназы I к сАМР в 10 раз и шестикратно увеличивает сродство к сАМР изо зима П типа ( Hofmann 1975 ). Є"С 8.x * ,

При этом MgATP связывается как с холоферментом, так и со свободной каталитической субъединицей в эквимолярном соотношении ( Нор-ре, Wagner, 1979). Связывание АТР с холоферментом приводит к тому, что для диссоциации и активации протеинкиназы I необходимы более высокие концентрации oAMP и, таким образом, активация протеинкиназы І в клетке может протекать только при микромолярных концентрациях циклонуклеотида, тогда как in vitro в от-суствие АТР ианомолярные концентрации сАМР достаточны для того, чтобы вызвать диссоциацию холофермента. В отсутствие циклонуклеотида АТР вызывает реассоциацию протеинкиназы I ( Норре et al*, 1977).

Необходимо также отметить существенные различия констант взаимодействия регуляторной и каталитической субъединицы сАМР-зависимых протеинкиназ I и П типа, которые составляют 0,15 нМ и 0,01 нМ, соответственно ( Hofmann, 1980). Как следует из значений констант взаимодействия, протеинкиназа П, субъединицы которой имеют большее сродство друг к другу, должна диссоциировать при большей концентрации сАМР, чем изофермент I типа, что наблюдалось в ряде случаев ( Schwoch, 1978 ). Это может объяснить также более быструю реассоциацию протеинкиназы П и менее прочное связывание циклонуклеотида с данным ферментом.

Каталитические свойства сАМР-зависимых протеинкиназ определяются их С-субъединицей. Как уже говорилось, С-субъединицы двух типов протеинкиназ не отличаются друг от друга, однако, имеются сообщения о микрогетерогенности каталитической субъединицы и о существовании нескольких изоформ, имеющих различные изоэлектри-ческие точки ( Sugden et al,, 1976," Bechtel et al., 1977). Однако, и молекулярные веса и субстратная специфичность были строго одинаковы для этих изоферментов. Аїлинокислотная последовательность С-субъединицы, состоящая из 349 аминокислотных остатков, определена полностью, за исключением неидентифицированной блокирующей группировки на аминотерминальном конце цепи. Обнаружено, что молекула содержит два фосфорилированных остатка: треонин (196) и серии (337) ( Titani et al., 1981).

Большой интерес представляет изучение кинетического механизма фосфотрансферазной реаіщии и фермент-субстратного взаимодействия. Было показано, что в ходе бисубстратной ферментативной реакции фоЪоршшрования реализуется механизм двухтактного замещения (типа "пинг-понг") (Кочетков и др., 1978). Инкубация С-субъединицы с ^~^Р АТР приводит к включению 0,8-1 моля фосфата на моль фермента, который при последующей инкубации с пистоном в условиях протекания фосфотрансферазной реакции переносится на субстрат (Kochetkov et al» , 1976). При этом, активным сайтом каталитической группы, акцептирующим ^ - концевой фосфат АТР является имидазолышй остаток гистидииа. Была установлена также важная роль остатков ^Lys и ^^s в каталитическом локусе. Описанные наблюдения позволили авторам предложить модель катализа (рис. 2а) ^ochetkov et al.,1977), согласно которой на первом этэле реакции происходит связывание комплекса MgATP в активном центре фермента. Остатки Iiys и Arg формируют катионный ло-кус, играющий важную роль в стабилизации полианионной цепочки АТР в активном центре. Электростатическое взаимодействие этих остатков с АТР приводит к смещению электронной плотности от терминального фосфата, что создает возможность нуклеофильной атаки

Рис. 2. A - схема активного центра каталитической субъедиыицы сАМР-зависимой протешкиназы (Kochetkov et al.,I977), Б - схема реакции автофосфорилирования протешкиназы П типа (Улыласов и др., 1980 ). электронной пары имидазольного кольца гистидина. После разрушения связи между *$ и Р фосфатными остатками формируется фосфо-гйстидиновая форма фермента. На второй стадии реакции фосфатный остаток переносится на белок-субстрат.

С-субъединица не является высокоспецифичной по отношению к белковому субстрату, хотя, как правило, обнаруживает более высокое сродство к лизин-богатым гистонам. Показано, что оптимальная для фосфорилирования аминокислотная последовательность в белковом субстрате должна включать - Arg - Arg - Х - Ser - Y -(Krebs, Beavo, 1979), где остаток ^x в активно фосфорилируемых субстратах может быть Ala, Pro, Туг , a y обычно Leu . Опыты с ' синтетическим субстратом Leu - Arg - Arg - Ala - Ser - Leu - Gly показали, что при замене Ser на другие аминокислоты %= 16 мкМ падает в среднем на два порядка (Feramisco, Krebs, 1978). Для сравнения, К для гистона составляет 10 мкМ (straifors, Вelfrage, 1982).

В связи с приведенными выше данными, большой интерес представляет существование высокоспецифичного термостабильного белкового ингибитора ( Walsh et al., 1971), действующего как конкурентный ингибитор протеинкиназы по отношению к белковому субстрату. Ингибитор связывается только со свободной каталитической субъединицей, действуя независимо от сАМР. К^ для него составляет 2 нМ, что намного ниже "величин К_;і , наблюдаемых для лучших синтетических аналогов субстратов ( Demaille et al.,

1977). Причины столь высокого сродства ингибитора к С-субъедини- це неизвестны. Возможно, решающую роль играют особенности вторичной структуры молекулы ингибитора, однако обнаружено, что даже небольшой пептидный фрагмент молекулы, включающий Arg и гидрофобные остатки, способен ингибировать С-субъединину с высо- кой эффективностью (Demaille et al., 1977). Так или ішаче, термостабильный ингибитор протеинкиназ является единственным соединением, которое в наномолярных количествах ингибирует фермент.

Количество и активность ингибитора изменяются в зависимости от физиологического состояния организма (Skala et al., 1974), что очевидно, является дополнительным регуляторним механизмом, позволяющим модулировать активность сШР-зависимых протеинкиназ в клетке. Ниже перечислены основные физико-химические свойства ингибитора протеинкиназ из скелетной мышцы кролика: молекулярный вес - ІІ300, количество аминокислотных остатков в молекуле - 98, изоэлектрическая точка - 4,24, К_и = 2,1 х 10 М, концентрация в организме - 53 нМ, ( д_емаль _и _др., 1977).

Ванным механизмом регуляции протеинкиназной активности является автофосфорилирование в присутствии АТР холофермента кина-зы П типа. Было обнаружено, что добавление Vi^p АТР к гомогенному ферменту из сердца быка ведет к включению 2 молей фосфата на моль холофермента, при этом, фосфат переносится на сериновый остаток регуляторної! субъединицы ( Erlichman et al.,I974; Rosen et al .,1975). Исследуя роль процесса автофосформирования в механизме активации протеинкиназы, Розен и сотр. нашли, что фосфо- и дефосфохолофермент обладают одинаковой способностью к активации под действием сАМР и связывают /³Н/сАМР. Однако, скорость реас-социациации фосфорилированной 5-субъединицы с С в 5 раз ниже, чем дефосфорилированной Р-субъединицы ( Rangel-Aldao,Rosen, 1976). Наряду с этим в литературе представлены данные, свидетельствующие о различной чувствительности фосфо- и дефосфоформ холофермента к активации под действием сАМР и связыванию /³Н/аАМР (Hofmann et al.,1975; Ульмасов и др., 1980 ). Так, в работе (Ульмасов и др., 1980 ) для протеинкиназы из мозга свиньи показано, что

К„_кт для фосфохолофермента (2 х 10 М) меньше, чем К_акт для дефосфохолофермента (8 х 10 М), что, очевидно, отражает большую чувствительность фосфоформы к &А1ЛР. Линейная зависимость скорости реакции автофосфорилирования от концентрации холофермен-та в инкубационной среде, а также ингибирущее влияние сШР на автофосфорилирование позволило авторам сделать вывод о том, что реакция протекает по внутримолекулярному механизму в составе комплекса SgC2 и предложить схему реакции автофосфорилирования (Ульмасов и др., 1980 ). Схема предполагает, что фосфотрансфе-разная реакция и реакция автофосфорилирования проходят с участием одного и того же активного центра каталитической субъединицы , причем перенос фосфатного остатка осуществляется через фосфофор- му каталитической субъединицы, согласно механизму описанному вы- р ше для фосфотрансферазной реакции (см.стр.14 ) (рис. 2 ).

Осуществляя фосшорилирование белков-субстратов протеинкина-зы тем самым обладают способностью регулировать многочисленные клеточные процессы. Однако, обнаружение феномена ядерной трансло-кацпи сАМР-зависимых протеинкиназ позволяет говорить о регуляции непосредственно на уровне транскрипции матричной активности хроматина. Ядерная локализация сАМР-зависимых протеинкиназ четко установлена: и С- и S-субъединицы фермента идентифицированы в ядрах (Jungman et al_r, I974;Kallos, 1977). Показано, что для транслокации протеинкиназы в ядро необходимо наличие сЖР (Kallos, Lea, 197S\ Cho-Chung etaL,¹³⁷⁹)» ^в клетках же, содержащих пониженный уровень сАМР (трансформированные SY403T3 фибро-бласты) транспорт в ядро регуляторной субъединицы нарушен (Нестерова и др., 1980). По поводу механизма транслокации существуют две различные точки зрения. Согласно одной из них (Нестерова и др., 1980', Jungmann, Kranias, 1977) (рис. 3 ), субъединицы сАМР- зависимой протеинкиназы проникают в ядро независимо друг от друга после диссоциации холофермента. При этом, R-субъединица находится в фосфорилированной форме и переносит в ядро сШР. Соглас-но второй точке зрения, ( Cho-Cbung , 1980) (рис. 3 ), в ядро проникает комплекс сАМР + С-субъединица + R-субъединица, которая также содержит фосфорилированный серии, расположенный около арги-ниновых остатков. Формирование комплекса и его транслокация в ядро зависят от концентрации сШР; при концентрациях ниже физиологической (менее I нМ) комплекс образуется в незначительных количествах, при концентрациях сЖР выше физиологического уровня (более I мкМ) транслокация комплекса в ядро ингибируетея ввиду его диссоциации на субъединицы. В настоящее время не представляется возможным указать какой механизм транслокации реализуется на самом деле. После транслокации в ядро сШР-зависимая протеинкиназа может регулировать генетическую активность клетки непосредственно влияя на процесс транскрипции. Показано, что фосфорилирование ядер С-субъединицей протеинкиназы из мозга свиньи на 10$ стимулирует матричную активность хроматина, а также приводит к интенсивному фосфоршшрованию - фактора РНК-полимеразы. Регуляторная субъединица, добавленная в среду РНК-полимеразной реакции, в четыре раза увеличивает матричную активность хроматина за счет увеличения количества мест посадки РБК-полимеразы на ДНК (Нестерова и др., 1980).

Итак, приведенные в обзоре факты свидетельствуют о существовании сложной многоступенчатой системы регуляции активности и субстратной направленности сШР-зависимых протеинкиназ в клетке, которая, видимо, способна обеспечить избирательность действия ферментов. Указанная регуляция осуществляется на различных этапах: на уровне диссоциирующего влияния сАМР на ферменты, которое

цитоплазма гормон с AMP c=>

Ядро РИК полимера fa хроматин

/I \ ATP, Mf* ^Л2⁵ с AMP сАИР v A A S' _[С

_{і \}

Й (~)САМР с-)Р~ D А A S А А \" _С—-

Рис. 3. Схема ядерной транслокаїщи сАМР-зависимых протеин-киназ.

А - модель, включающая диссоциацию холосрермента (Нестерова и др., 1980),

Б - модель, предполагающая транслокацию в составе холосрермента ( Clio-Chung, 1980). зависит от таких факторов как состояние .фосфорилирования К-субъ-единицы, концентрация в среде MgATP, концентрация белковых субстратов; на уровне модулирующего действия белков-ингибиторов каталитической активности С-субъединицы; наконец, на уровне доступности белкового субстрата фосфорилирования, которая определяется как свойствами самого субстрата (первичной аминокислотной последовательностью вблизи сайта фосфорилирования, вторичной структурой его молекулы), так и внутриклеточной локализацией самих сАМР-зависимых протеинкиназ и их субъединиц.

2. сАМР-СШШВАЩИЕ ЕЕЛКИ

Равенство концентраций К и С субъединиц в большом числе исследованных тканей ( Hofmann et al,1977), а также существование корреляции между количеством связанного сЖР и уровнем активности сАМР-зависимых протеинкиназ ( Schwoch., Hilz, 1977), привело к предположению о том, что сАМР-сшзывающие белки эукариоти-ческой клетки представляют собой К-субъединицы сАМР-зависимых протеинкиназ и что основная функция К-субъедшшц - контроль про-теинкиназной активности.

Вместе с тем, в литературе представлены данные о том, что значительное увеличение содержания R-субъединиц в клетке может происходить в отсутствие какого-либо увеличения активности аЛМР-зависимых протеишшназ, как это, например, шлеет место при индукции дифференцировки клеток нейробластомы (Liu Alice et al., 1981). При этом происходит накопление К-субъединицы в форме свободного сАМР-связывающего белка.

Ядерная локализация К-субъединицы и ее способность непосредственно воздействовать на уровень матричной активности хрома- тина (Нестерова, 1980; eho-Chung et al., 1979 и др.) также свидетельствуют о возможной самостоятельной регуляторної функции S-субъ единицы. Высказанное предположение подтверждается тем, что в бактериальной клетке, где, как известно, протеинкиназная активность отсутствует, сАМР, взаимодействуя с рецепторним белком (САР), способен регулировать процесс транскрипции Lac оперона (Anderson et al., 1971).

В ряде работ сообщалось о существовании в эукариотических клетках сАМР-связыващих белков, не являвшихся S-субъединицаш сАМР-зависимых протеинкиназ (Chambaut et al., 1971; Yuh, Шао, 1974). Однако, такие белки не являются спещіфическими рецепторами сАМР, а способны также связывать и аденозин. Один из этих белков был идентифицирован как S - аденозилгомоцистеиназа ( Hershfield, 1978). Показано, что фосфофруктокиназа также обладает способностью связывать сАМР ( Kemp, Krebs, 1967). Так как и в том и в другом случае связывание сАМР и аденозина не приводит непосредственно к модуляции активности ферментов, то речь идет, по-видимому, о неспецифическом взаимодействии связывающих сайтов с адениновым ядром нуклеотида, и, значит, при относительно низком сродстве сАМР к этим сайтам ( = 0,2 мкМ) лишь небольшая доля общего клеточного циклонуклеотида связана с указанными ферментами.

Гораздо больший интерес представляет недавнее сообщение об іїндукпяи свободного сАМР-связывающего белка (КО при обработке клеток нейробластомы дибутирил-сАМР ( Prashad, 1981). Синтез de novo приводит к многократному увеличению количества этого белка, в результате чего он становится основным рецептором сАМР в цитоплазме. Показано, что В-субъединица сАМР-зависимых протеинкиназ и белок В' отличаются по своим физико-химическим свойствам и кодируются различными матричными НЖ. Природа белка В* в настоящее время невыяснена.

Таким образом, на современном уровне исследований нельзя исключить возможность существования в эукариотических клетках сШР-связывающих белков, которые не являются Е-субъединицами СШР-зависимых протеиикиназ, однако могут модулировать внутриклеточный пул сАМР, а также опосредовать некоторые эффекты циклонуклеотида.

Относительно взаимодействия сШР и К-субъединиц известно следующее. Свободная регуляторная субъединица сШР-зависимой про-теинкиназы типа I (SI) имеет два высокоаффинных связыващих сайта на молекулу (А и В), К для которых составляет около I нм ( Schwe-cheimer, Hoffman, 1977). Эти сайты отличаются по скорости диссоциации связанного нуклеотида, как это следует из кинетического анализа ( Doskeland, 1978). Процесс связывания обнаруживает положительную кооперативность ( Норре et al_nI978).

Ш взаимодействует с сАМР при рН 7,2 - 7,4 с аффинностью, соответствующей К_д = 6 нМ. Хотя Ш также включает две молекулы схАІЛР на мономер, кинетический анализ указывает на однородность популяции связывающих сайтов (Buss et al._t 1979).

Так как одновременное взаимодействие четырех молекул сАМР с холоферментом сШР-зависимой протеинкиназы термодинамически невозможно, то диссоциация холоюермента должна проходить через некоторые промежуточные состояния. Так, сообщалось о существовании стабильного интермедиата структуры SgC при реассоциации С и комплекса ЕИ-сАМР ( Rangel-Aldao, Rosen, 1977). Отмечалось также, что при диссоциации холофермента должны высвободиться одна или обе каталитических субъединицы прежде чем сАМР сможет занять все четыре связывающих сайта ( Ogez, Segei, 1976). Эти наблюдения наряду с данными о том, что в свободной ЕС сАМР занимает в первую очередь сайт А, тогда как в холоферменте - сайт Б, позволили предложить следующую модель активации сАМР-зависимой протеинкиназы I типа (рис. 4) (Doskeland, Ogreid, 1981): взаимодействие щіклонуклеотида с открытым сайтом В холофермента формирует короткоживущий интермедиат, в котором доступ сАМР к сайту А также открыт. При связывании сАМР с этим сайтом промежуточный комплекс диссоциирует на свободные субъединицы. При реассо-цпации одна С-субъединица связывается с дилером 5 в непосредственной близости от сайта А, высвобождая связанный вдклонуклеотид из этого сайта и вызывая конформационные изменения 51, которые приводят к быстрой потере сАМР в сайте Б той же субъединицы KL^ димера и более медленному высвобождению нуклеотида из сайтов А и В другой субъединицы.

Интересно отметить, что циклонуклеотид в связанном состоянии практически не гидролизуется Са"*"¹* - кальмодулин-зависимой фосфо-диэстеразой сАІЛР ( Builder et al., 1981)..

Изучение функциональных доменов К-субъединиц путем их ограниченного протеолиза в присутствии трипсина обнаруживает следующие особенности белковой структуры. Протеолиз ЕС (48000) в присутствии низких концентраций трипсина приводит к образованию двух пептидных фрагментов - 35000 и 12000. При этом фрагмент, представляющий собой карбоксильный участок молекулы BI (35000), обладает способностью к связыванию сАМР (2 моля сАМР на моль мономера). При его дальнейшем протеолизе образуются фрагменты (16000), связывающие cAIvIP в эквимолярном соотношении. N Е^-концевой фрагмент молекулы представляет собой димер, расщепляющийся в присутствии высоких концентраций трипсина на более мелкие фрагменты (6000). Модель, поясняющая описанные выше особенности структуры И-субъединицы представлена на рис.5 (Rannels, Corbin, 1980). Holoenzyme >о.і/*М cAMP n с AMP eassociation Dissociation

Рис. 4. Модель диссоциавди - реассовдации протеинкиназы I ( Doskeland» Ogreid, 1981).

Сообщалось о наличии виї^-концевой последовательности мономера И-субъединицы двух остатков цистеина, которые участвуют в образовании двух дисульфидиых связей при формировании димера 51₂ (Tailor et al., 1981).

Ограниченный протеолиз Ш (56000) приводит к образованию сходных протеолитических фрагментов (39000 и 17000), при этом сайт автофосфорилирования локализован в СООН-концевом фрагменте молекулы в непосредственной близости от сайта протеолитического расщепления ( ^Ta^il01, et al., 1981). Таким образом, отмечается определенная структурная гомология между молекулами И и ЇЇІ.

Определение первичной аминокислотной последовательности HI показало, что белковая молекула состоит из 514 аминокислотных остатков, при этом НЕ^-конец молекулы блокирован неидентифици-рованной группировкой ( Titani et al,, 1981). Молекула содержит два фосфорилированных остатка (исключая сайт автофосфорилирования) . Первичная аминокислотная последовательность Ш определена не полностью, а лишь в области функционально важных сайтов: протеолитического расщепления, автофосфорилирования, связывания сАМР, что составляет около 30% всей последовательности.

Относительно регуляции уровня сШР-связывающих белков в клетке известно мало. Однако, показано, что В- и С-субъединицы кодируются различными матричными ГНК, что, очевидно, может объяснить независимую экспрессию регуляториой субъединицы, наблюдавшую ся в ряде случаев

Время полужизни ЕЕ в клетках мышиной лимфомы составляет 8,4 часа, тогда как в мутантних клетках, не способных синтезировать С-субъединицу, наблюдается ускоренный турновер Е-субъедини-цы (Steinberg, Agard, 1981). сАМР вызывает индукцию синтеза рецепторних белков (Prashad et al., 1979), и, возможно, являет-

_ноос _соон

Рис. 5. Структурная модель димера регуляторнои субъединицы сМР-зависимой протеинкиназы I типа ( Rannels, Corbin, 1980). ся основным фактором, регулирующим их уровень в клетке по механизму обратной связи.

3. сМР-Ь1ЕЗАВИС1Ж ПРОШЖЙНАЗЫ

Описанные к настоящему времени протеиыкиназы различаются по субстратной специфичности, внутриклеточной локализации, способности к активации различными низкомолекулярными эффекторами и т.д. По последнему признаку, кроме описанных выше сАМР-зависимых протеинкиназ, мошю выделить следующие группы ферментов: cSMP-за-висимые протеинкиназы, Са - кальмодулин - зависимые, модулятор-стимулируемые, dsRNA ~ стимулируемые, а также протеинкиназы, для которых не обнаружены какие-либо модуляторы ферментативной активности. cGMP-зависимые протеинкиназы являются главными рецепторними белками сбМР в клетках млекопитающих. В максимальных количествах фермент обнаружен в тканях легких, мозжечка, сердца ( Kuo, 1974; Lincoln et al., 1976), отмечена его цитоплазматическая локализация. В указанных органах отношение связанного /³Н/ сбМР к связанному /³Н/ сАМР составляет 0,3 - 0,5, тогда как в других тканях это отношение гораздо ниже. Очищенная сбМР-зависимая проте-инкиназа из легких быка представляет собой димер с молекулярным весом около 160000, распадающийся в присутствии дитиотреитола на два мономера (80000), каждый из которых обладает каталитической активностью и способностью связывать циклонуклеотид (Gill et al., 1976; Lincoln et al., 1977). Диссоциирующее влияние дитиотреитола свидетельствует об участии дисульфидных связей в формировании холофермента. Связывание циклонуклеотида (2 моля сбМР на моль фермента) приводит к активации протеинкиназы, которая, однако, не сопровождается диссоциацией холофермента на субъединицы (Kuo, 1980). Такім образом, активация cGMP-зависимой протеинки-назы протекает по следующей схеме: S₂C₂ + 2 cGMP ^= I?2^C2 ' ^сЄМР2 неактивный активный

Инкубация фермента в присутствии высоких концентраций сСЫР и гистона приводит к диссоциации комплекса с образованием свободной каталитической субъединицы ( Miyamoto et al., 1973). cSIvIP обладает высоким сродством к cQMP-зависимой протеинки-назе, соответствующим К_д 10-50 нМ ( Sold, Hofmann, 1974; Gill, Kanstein, 1975). При этом, процесс связывания обнаруживает положительную кооперативность (коэффициент Хилла составляет 1,59) ( Mac Cune, Gill, 1979). Сродство cGMP-зависимой протеинкиназы к сАМР в 20-100 раз ниже, чем к cGMP ( Mac Cune, Gill, 1979). Присутствие ATP снижает сродство фермента к cGMP, однако, инги-бирование носит неконкуретный характер и затрагивает взаимодействие АТР с каталитическим сайтом киназы, которое ведет к конфор-мациондым изменениям молекулы в области сайта связывания цикло-нуклеотида ( Gill, Mac Cune, 1979).

Каталитический процесс характеризуется следуїодишкинетичес-кими константами: К^ _АТр 30 мкМ, К_а ., ^ = 2-5 мМ, рН _opt -- 5,7-7,0, Кр₅ ддщ _{гистона} - сильно зависит-от природы субстрата и колеблется от нескольких десятков до нескольких сотен мкМ ( Gill et al., 1977). сШР-зависимая протеинкиназа способна автофосфорилировать-ся, включая один моль фосфата на моль мономера (de Jonge, Rosen, 1977; Lincoln et al., 1978). Автофосфорилирование может протекать как по внутримолекулярному механизму, так и по межмолеку- лярноіяу, с участием С-субъединицы сЖР-зависимой протешшиназы. И в том и в другом случае фосборилируется один и тот же серино-вый остаток молекулы. Интересно отметить, что автофосфорилирова-ние не приводит к каким-либо изменениям каталитической активности фермента (Lincoln et al., 1978).

Выделен и охарактеризован термостабильный модулятор активности cGMP-зависимой протеинкиназы. Модулятор, полученный из сердца собаки, представляет собой кислый белок с изоэлектричес-кой точкой при рН = 4,0, имеющий молекулярный вес 34000 ( Sho-ji et al.,1978). Модулятор увеличивает активность cGMP-зависимой протеинкиназы по отношению к гистонам Н2в и ИЗ, но не изменяет активность фермента по отношению к анионным белкам казеину и фосвитину (Gill, Mac Cune, 1979;Mackenzie,Donnelly, 1980). Найдено, что модулятор не связывается с протеинкиназой (Shoji et al., 1978), и, видимо, взаимодействует непосредственно с тис-тонами, образуя комплексы с увеличенным сродством к ферменту.

Показано, что обМР-зависимая протеинкиназа способна фосфори-лировать те же белковые субстраты, что и сАМР-зависимая протеинкиназа, однако, с гораздо меньшей эффективностью. Так, киназа фосфорилазы, активность которой возрастает при фосфорилировании сМР-зависимой протеинкиназой, активируется такке и при фосфорилировании cGMP-зависимой киназои, однако при значительно больших концентрациях фермента ( Knoo et al,, 1977). Аналогично, найдено, что обе никлонуклеотид-зависнмые протеинкиназы способны максимально активировать гормончувствительную липазу (Khoo et al., 1977). Гистон Н2в аістивно фосфорилируется и сАМР- и сбМР-зависи-мой протеинкиназой, причем оба фермента катализируют фосфорили-рование Ser - 32 и Ser - 36 гистона, однако, сАМР-зависимая киназа обнаруншвает большую специфичность в отношении Ser - 36, тогда как cSMP-зависимая - в отношении Ser - 32 (Hashimoto et al., I976;Hashimoto, 1979).

Таким образом, несмотря на возможность существования специфических субстратов cGMP-зависимой протеинкиназы, видимо, большинство субстратов в клетке являются общими для обоих типов циклонуклеотидзависимых протеинкиназ.

Са - калъмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют различные субстраты: белки микротрубочек и нейрофнламентов, легкие цепи миозина скелетных, гладких и сердечных мышц, цитозольнне белки мозга, белки синаптических мембран мозга и т.д. (Глебов, 1981). Их активация протекает по схеме, общей для ряда Са-зави-симых ферментов (в частности фосйодиэстеразы и аденилатциклазы .мозга):

СаМ + 4 Са⁺² :: СаМ Са₄

Ф + СаМ ' Са₄"^=^ Ф СаІУЇ Са₄ апофермент активный холофермент На первой стадии образуется комплекс кальмодулина с Са, который затем служит активатором Са-зависимых ферментов (Глебов, 1981). Кальмодулин представляет собой кислый, термостабильный, низкомолекулярный белок, имеющий молекулярный вес 16800, изоэлек-трическую точку 3,9 ( Brostrom, wolf, 1981). Физико-химические свойства и аминокислотнші состав кальмодулина, выделенного из различных источников практически одинаковы. Максимальное содержание кальмодулина отмечено в ткани мозга, где Са-кальмодулин-зави-симое фосфорилирование играет важную роль. Показано, что высвобождение пейротрансмиттеров, регуляция мембранной проницаемости может контролироваться уровнем фосфорилирования специфических мембранных белков ( Greengard, 1978). Уровень фосфорили- рования белков Іа, їв, П, являющихся главными фосфопротеинами синаптических мембран мозга, находится под контролем как сДГЛР— таїс и Са-калшодулин-зависимых протеинкиназ ( sieghart et al., 1979). Однако, найдено, что белки 1а и 1в фосфорилируются этими киназами по различит! аминокислотным остаткам ( Huttner et al., 1981), что, вероятно, позволяет осуществлять координированную регуляцию мембранной проницаемости обоими эффекторами. (Са*¹⁴" и сAMP).

Очищенная Са-кальмодулин-зависимая киназа легких цепей миозина из сердца быка обладает следующими физико-химическими и кинетическими свойствами (Walsh et al., 1979): молекулярный вес - 85000, Код дар = 175 мкМ, ^ для легкой цепи миозина - -Т -Т - 21 мкМ, специфическая активность - 0,03 мкМ мин мг . Фермент активируется в присутствии микромолярных концентраций Са"¹⁴" и наномолярных концентраций кальмодулина.

Важная роль Са⁴⁴" в регуляции многих клеточных процессов стимулирует в настоящее время интенсивные исследования Са-кальмоду-лин-зависимых ферментов.

Недавно в литературе была описана протеинкиназа, которая стимулируется в присутствии модулятора активности cGMP-зависимой протеинкиназы, однако, нечувствительна к влиянию сЖР, cGMP, Са"Ч (Kuo et al., 1979*, shoji et al., 1980). Сообщалось также о существовании двух форм этого фермента в ткани легких мышей (Kuo, 1981). Было выдвинуто предположение о том, что обнаруженный фермент является каталитической субъединицей cGMP-зависимой протеинкиназы. Несмотря на то, что активация киназы при связывании циклонугслеотида протекает без диссоциации холофермента, при определенных условиях in vitro (высокая концентрация с(МР и гис-тона) ( Miyamoto et al., 1973) удается вызвать его диссоциацию с образованием каталитической субъединицы, похожей по свойствам на описанную протеинкиназу. Видимо, этот процесс реализуется in vivo в присутствии определенных клеточных компонентов, что открывает дополнительный механизм регуляции активности сАМР-за-висимой протеинкиназы.

Большой интерес представляет собой описанная недавно интер-ферон-индуцируемая циклонуклеотиднезависимая протеинкиназа, активируемая двухнитчатой РНК ( dsRNA ). Добавление dsRNA к экстрактам обработанных интерфероном клеток в несколько раз увеличивает ассоциированную с рибосомами протеинкиназную активность, как было найдено для клеток асцитной карциномы Эрлиха ( Sen et al., 1978) и мышиных l - клеток (OhtsiifcL, Baron, 1978). При этом происходит фосфорилирование малой субъединицы (37000) фактора инициации трансляции - if - 2, приводящее к ингибирова-нию синтеза белка, ввиду невозможности образования комплекса eIF-2-Met-tRNA-GTP ( Lenz, Baglioni, 1978). Процесс фосфори-лирования elF-2 сильно стимулируется в присутствии низких концентраций dsRNA (50-100 нг/мл), как вирусной, так и синтетической, содержащей не менее 50 нуклеотидных пар.

Как известно, обработка интерфероном делает клетки невосприимчивыми к вирусной инфекции. Очевидно, что описанная выше система фосфорилирования способна блокировать экспрессию вирусного генома в клетке на уровне инициации синтеза белка.

Ввиду уникальности некоторых свойств в особую группу следует выделить протеинкиназы, являющиеся продуктами онкогенов опухоле-родных вирусов. Так, продукт онкогена вируса саркомы Рауса pp60^src представляет собой фосфопротеин, имеющий молекулярный вес 60000. Он способен фосфорилировать Н - цепь иммуноглобулина, казеин, а также некоторые другие субстраты (Erikson et al.,

1979), однако, интересно, что акцептором фосфата является тирозин, аминокислота, не фосфорилируемая клеточными протеинкиназа-ми ( Hunter, Sefton, 1980). Кроме того, один из двух сайтов, Оюсфорилированньк в молекуле ррбО , также представляет собой тирозин. Фермент не стимулируется сАг/ЕР и использует в качестве донора фосфата как АТР, так и GTP, (Presek et al., 1980).

Сообщалось также о наличии протеинкиназной активности, связанной со средним Т-антигеном вируса полиомы ( Smith et al.,

1979) и активности, ассоциированной с аденовирусом (Akusjarvi et al., 1978). *

В составе ядерных протеинкиназ наряду с сАМР-зависимыми и

Са-кальмодулин-зависимыми протеинкиназами ( Sikorska et al.,

1980) обнаружена также группа ферментов, обладающих выраженной субстратной специфичностью по отношению к кислым белками хрома тина, а также к таким модельным субстратам как казеин и фосвитин ( Rikans, Ruddon, 1976; stahl, Knippers,I980). їїроте- иыкиыазы кислых белісов были найдены в цитоплазме и мембранах эукариотических клеток ( Itarte et al., 1981), однако, если в ядре их функцией является, по-видимому, фосфорилирование кислых белков хроматина, имеющее своим результатом регуляцию процесса транскрипции, то роль ферментов и их субстраты в цитоплазме не ясны.

Протеинкиназы кислых белісов, или казеинкиназы, были раздарены на две группы - I и П, согласно порядку их элгоции с ДЭАЭ-цел-лкшозы ( Rikans, Ruddon, 1976). Ввиду широкой распространенности и важности этих ферментов представляется интересным привести их характеристики. Так, показано, что казеиикшіаза I из тимуса теленка имеет молекулярный вес 37000, тогда как казеинкиназа П -138000 и состоит из субъединиц 44000, 40000, 26000. Оба фермента способны автофосфорилироваться, при этом в казеишшназе П включение фосфата происходит в субъединицу 26000. Казеинкиназа I использует в качестве донора фосфата АТР (К л- дтр = 22 мкМ), тогда как казеинкиназа її способна утилизировать и АТР и GTP (соответ-ствутощие Код составляют 14 мкМ и 30 мкТЛ) (Dahmus, 1981).

Казеинкиназы, выделенные из лейкоцитов свиньи, также имеют разные молекулярные веса (38000 и 185000), кроме того К_я для казеина = 0,46 мг/мл и Кдщ ++ = 0,3 мМ казеинкиназы I ниже соответствующих констант, наблюдаемых для казеинкиназы її (0,30 мг/мл и 1,7 мМ) ( Репа et al., 1981). Ни один из ферментов не стимулируется сАМР и Са"¹"* и не ингибируется термостабильным ингибитором каталитической субъединицы сМР-зависимых протеинкиназ.

Сообщалось, что биогенные амины: спермін, спермидин, путрес-цин стимулируют активность казеинкиназ ( Cochet et al., 1980; Plana et al., 1982). Казеинкиназа I из тромбоцитов человека обладает способностью фосфорилировать остаток серина в молекуле казеина, а казеинкиназа її фосфорилирует как остаток серина, так и треонина ( Kikuchi et al., 1982). Используя синтетические белковые субстраты удалось установить, что казеинкиназа її из печени крысы фосфорилирует, в основном, структуры следующего состава: Ser/Thr - х - Glu/Asp, где аминокислота X может быть либо нейтральной, либо кислой, но не основной (Flavio et al., 1980}

В настоящем обзоре представлены лишь основные группы протеинкиназ, описанные в литературе. Установление механизмов действия этих ферментов, а такие точная идентификация их клеточных субстратов несомненно позволят приблизиться к пониманию регуляции многих биохимических процессов.

4. АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНКИНАЗ В КЛЕТОЧНОМ

ЦИКЛЕ

Характерные изменения состояния фосфорилирования гистонов в процессе пролиферации клеток с очевидностью свидетельствуют о различной экспрессии протеинкиназ в митотическом цикле. Основные закономерности фосфорилирования гистонов в клеточном цикле, наиболее полно прослеженные на клетках СИО, сводятся к следующему: существенному фосфоршшрованию подвергаются гистоны Н2а, НЗ и III, однако, наиболее характерным является изменение состояния фосфорилирования гистона III в клеточном цикле, тогда как гистон НЗ фосфорилируется только в митозе, а фосфорилирование гистона Н2а практически не зависит от периода клеточного цикла (рис. 6) ( Gurley et al., 1974^а).

Гистон НІ не фосфорилируется в клетках, блокированных в периоде GI при отсутствии в среде изолейцина ( Gurley et al., 1974^ъ), что согласуется с данными других авторов, полученными при исследовании клеток асцитнои карциноїш Эрлиха, находящихся в стационарной фазе (Thomas, Hempel, IS76), непролиферируїацих гепатоцитов печени" ( Balhom et al., 1972), клеток гепатомы НТО, находящихся в состоянии конфлуэнтности (Oliver et al., 1972).

При стимуляции клеток ОНО к пролиферации, гистон HI фосфорилируется в позднем периоде 61, за два часа до начала синтеза ДНК, включая фосфат в эквимолярном соотношении (Gurley et al., 1974 ). В периоде S в гистон HI включается дополнительно два остатка фосфата, однако, следует отметить, что такому фосфоршшрованию подвергаются далеко не все молекулы HI и в хроматине велика доля гистона, фосфорилированного по типу GI-фосфорилирования ( Gurley et a3,IS78). Наконец, в самом конце периода G2 и на начальных Q-їілок

Рис. 6. Фосфорилирование гистонов в клетках CHQ на разных стадиях клеточного цикла (Gurley et al., 1978-). фазах митоза наблюдается митотическое фосфоршшрование гистона HI. Содержание фосфата в гистоне доходит до шести молекул фосфата на молекулу белка и затрагивает около 70$ общего числа молекул HI ( Garley et аі., 1978). После прохождения метафази митоза происходит быстрое дефосфорилирование гистона, в результате чего содержание фосфата в нем падает до 1-2 остатков на молекулу белка. Митотическое фосфорилирование гистона НІ было обнаружено во всех исследованных клетках гдлекопитающих, причем этот тип фос-форилирования строго координирован с митотической конденсацией хроматина. Последнее обстоятельство позволило Бредбери и сотр. выдвинуть предположение о "триггерной" роли процесса митотичес-кого фосфорилирования гистона НІ в конденсации хромосом ( Bradbury et al., I974;Inglis et al.,I976). Однако, данная точка зрения не является в настоящее время общепринятой.

Существование мощного митотического фосфорилирования гистона HI стимулировало поиски фермента, осуществляющего эту реакцию. Так называемые, "ассорциированные с ростом гистоикиназы" (HKG -- киназы) были экстрагированы из ядер миксомицета Physarum Polycepbalum ( Bardie et al.,1976), а также из клеток асцит-ной карциномы Эрлиха ( Langan , 1977). Показано, что эти два белка обладают сходными иммунологическими детерминантами ( Zanker et al», 1977). Активность НК0 - киназы в ядрах Ви Polycepbalum пятнадцатикратно возрастает во время митоза ( Bradbury et al., 1974 ).

Подробное исследование активности протеинкиназ, фосфорили-руїощих гистон НІ в клетках РЬ. Polycepbalum по стадиям клеточного цикла,обнаружило наличие трех типов протеинкиназ,максимальная активность которых проявлялась на определенных стадиях клеточного цикла.Наибольшей активностью обладали циклонуклеотиднезависи- мне протеинкиназы, обнаруживаемые в конце стадии G2; на стадии s обнаруживаются протеинкиназы, активность которых стимулируется в два раза в присутствии 10 мкМ оАМР; в начале стадии G2 в клетках Ph.Poiycephalum проявляется активность протеинкиназ, которые эффективнее фосфоршшруш гистон НІ в присутствии сАМР (рис. 7) (Трахт и др., 1979; Трахт и др., 1980).

Дифференциальная активность протеинкиназ в клеточном цикле находит свое отражение в изменении сайтов фосфорилирования белков. Так, при изучении протеинкиназ из икры морского ежа было установлено, что в 01-фазе фосфорилируется серин-37 гистона HI, в s - фазе - серин-114, а в митозе - серин-180 и треонин-153 (Ки~ rocbkin 1977). Фосфорилирование по двум последним сайтам соп-ряжено с конденсацией хроматина.

В связи с описанной выше дифференциальной активностью протеинкиназ в клеточном цикле большой интерес представляют опыты по исследованию влияния препаратов протеинкиназ на время наступления митоза. Обработка поверхности Eh.Poiycephalum , находившегося на первом часу стадии G2 после второго синхронного митоза, частично очищенными препаратами протеинкиназ из PluPoiycephalum взятого на стадии поздней G2, и протеинкиназы из гепатомы крыс із 27, фосфорилируїсщей гистон НІ в С-концевой части молекулы (ми-тотическое фосфорилирование), ускоряла наступление митоза. Каталитическая субъединица сЖР-зависимой протеинкиназы из мозга свиньи, фосфорилирущей серин-37 в молекуле гистона НІ (GI-фос- ив форилирование), задерМяа наступление митоза. Аналогичным эффектом обладала регуляторная субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы из мозга свиньи (Трахт и др., 1979). Приведенные данные полностью согласуются с результатами экспериментов, в которых удавалось индуцировать ускорение наступления митоза при обработке

Рис. 7. Активность протеинкжназ на разных стадиях клеточного цикла Eh#Polycephalum (Трахт и др., 1980). - циклонушеотид-независжмые протеинкиназы, - сШР-завжсимые протеинкиназн, - cGMP-зависише протеинкиназы. клеток ii vivo препаратом частично очищенной HKG - киназы из клеток аецитной карциномы Эрлиха ( laglis et al., 1976).

Синтез ДНК в клетках Т 51 В печени крысы, пролиферация которых была блокирована низким внеклеточным содержанием Са"*⁴", стимулировался как при повышении в среде концентрации Са⁴**, так и при обработке клеток препаратом сШР-зависимой протеинкиназы П типа из мышцы кролика ( Boynton, Whitfield, 1980). При этом, стшлулирущее действие' Са** и протеинкиназы П ингибировалось термостабильным ингибитором активности каталитической субъединицы сШР-зависимых протеинкиназ. Препарат протеинкиназы I не обладал стимулирующей активностью. Приведенные факты свидетельствуют о возможном участии протеинкиназы П в стимуляции синтеза ДНК.

В литературе приводятся сведения о закономерном изменении активностей сАМР-зависимых протеинкиназ I и П типа в клеточном цикле. Так, в синхронизированных клетках СТО протеинкиназная активность достигает максимума в митозе и на границе GI/ s . При этом в митозе преобладает протеинкиназа I, тогда как на границе GI/s резко увеличивается активность протеинкиназы П. (рис. 8). ( Costa et al., 1976). Таким образом, и в этом случае инициация синтеза ДНК связана с увеличением активности протеинкиназы П. Аналогичный характер распределения активностей изоферментов сАМР-зависимой протеинкиназы наблюдался в клеточном цикле¹*⁸^ фиб-робластов, а также Rat-1 клеток, трансформированных вирусом саркомы Рауса (Haddox et al., 1980). Сообщалось, что отношение активностей протеинкиназы I и протеинкиназы П в пролиферируїощих клетках ОНО составляет 0,37, тогда как в клетках, пролиферация которых блокирована в присутствии дибутирил-сАМР - 3,96, что является следствием увеличеішои активности протеїшкиназн I и уменьшенной активности протеинкиназы П в GI-фазе клеточного вдкла;'^;0.7/ (Haddox et ai., 1980). Обработка клеток нейробластомы дибу-тирил-сіШР индуцирует дифференцировку и таїте приводит к увеличению содержания К-субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы I типа, которое, однако, не сопровождается увеличением активности С-субъединицы ( Prashad et al., 1979; Liu et al., 1980). Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют в пользу того, что протеинкиназа I вовлечена в процесс клеточной дифферен-цировки, тогда как протеинкиназа П контролирует процесс пролиферации. Однако, наряду с этим в литературе представлены данные подтверждающие обратное. Так, преобладание протеинкиназы I по отношению к протеинкиназе П было отмечено в питозоле клеток некоторых активно растущих тканей, таких как карцинома почки (Foss-berg et ai,I978), опухоль молочной железы (^Handschin, ЕррепЪег-ger, 1979), ткань сердца, в период неонатального развития ( Haddox et al., 1979). В то же время активность протеинкиназы П увеличена при регрессии опухоли молочной железы ( Cho~ Chung et al.,I978). Эти факты позволили Расселл выдвинуть гипотезу о том, что сАМР-зависимая протеинкиназа I типа является положительным эффектором роста, тогда как протеинкиназа П типа ин-гибирует рост ( Russell, 1978). По-видимому, в настоящее время не представляется возможным однозначно определить функцию каждой из сАМР-зависимых протеинкиназ в регуляции клеточного роста. Большой интерес представляют данные об изменении в клеточном цикле активности ядерных негистоновых протеинкиназ. Используя клетки HeLa S3 удалось показать, что общая активность протеинкиназ в ядре увеличена в поздней s - фазе и 62-фазе, что выражается в повышенном уровне фосфорилирования негистоновых белков хроматина (Phillips et al., 1979). Периоды максимальной активности ядерных протеинкиназ не совпадают ни с синтезом ДНК,

_С.

Рис. 8. Активность сАМР-зависимых протеинкииаз в клетках

СІЮ на протяжении клеточного пдаа ( gosta et al., 1976). - активность сЖР-зависимой протеинкиназы I типа, - активность еАМР-зависимой протеинкиназы П типа. ни с митозом, однако существует корреляция между активностью ядерных протеинкиназ и скоростью синтеза РБК, что свидетельствует о возможной роли фосфорилирования ядерных белков в регуляции экспрессии генома. При хроматографии на фосфоцеллюлозе ядерные протеинкиназы разделяются на пять фракций, активность каждой из которых в клеточном цикле меняется параллельно изменениям общей активности. К сожалению, недостаточно полная характеристика свойств ферментов из данных фракций не позволяет произвести их идентификацию с уже описанными ядерными протеинкиназами.

Исследование ядерных протеинкиназ из клеток ОНО обнаружило сходные вариации общей активности ферментов в клеточном цикле ( Costa et al., 1977), которые, однако, сопровождаются параллельным изменением количества белковых субстратов.

Дальнейшие исследования ядерных протеинкиназ, а также определение влияния фосфорилированных ядерных белков на процесс функционирования хроматина позволят приблизиться к пониманию регуляции клеточного роста и дифференциальной экспрессии генома в клеточном цикле.

5. АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИВКИНАЗ В ТРАНСФОРМИРОВАННОЙ ТКАНИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Многочисленные данные свидетельствуют об изменении характера фосфорилирования белков при опухолевом росте. Однако, сведения относительно тенденций изменений протеинкиназной активности при злокачественной трансформации, полученные для различных объектов, достаточно противоречивы. Одной из наиболее хорошо изученных моделей канцерогенеза являются опухоли молочной железы. Представляется важным рассмотреть на примере последних основные аспекты изменений протеинкиназной активности в опухолях ., особен- но шлея ввиду их гистогенетическое родство с объектом настоящего исследования - клетками асцитной карциноьш Эрлиха, также представляющими собой трансформированные клетки молочной железы.

Прошло уже несколько десятков лет с тех пор, как Эрлих перевил от мыши спонтанную опухоль молочной железы, и в лабораториях мира продолжают перевивать карциному Эрлиха. Однако, при последовательных трансплантациях злокачественность опухолей обычно нарастает, происходит как бы их прогрессия (Шабад, 1979) и в классической перевиваемой опухоли Эрлиха в настоящее время уже невозможно узнать рак молочной железы мыши. Повышение злокачественности опухолей, а главное, нарастание их автономности в ходе прогрессии выражается в том, что ряд опухолей на ранней стадии их развития является гормон-зависимыми, а на дальнейших стадиях -гордон-независимыми. Многими авторами показано, что введение естрогенних гормонов индуцирует рак молочной железы у мышей, в то время как овариэктомия животных снижает частоту возникновения рака и вызывает регрессию гормон-зависимых опухолей ( Гарднер, I955;Huggins,Bergenstal, 1952). Определение наличия или отсутствия рецепторов эстрогенов (РЭ) играет важную роль в клинической диагностике опухолей молочной железы человека, и больные с РЭ-от-рицательными опухолями имеют обычно плохой прогноз рецидива и выживаемости ( Knight et al., 1980; Leake et al., 1981). Вместе с тем, одного присутствия в ткани рецепторов эстрогенов недостаточно для установления факта гордон-зависимости опухоли.

Недавние сообщения о том, что введение крысам дибутирилаАМР имитирует овариэктомшо и вызывает регрессию ДМБА-индудированных опухолей молочной железы (Cho-Cnung et al., 1978), поднимают вопрос о роли ферментов системы сАМР и, в частности, протеинкиназ в регуляции опухолевого роста.

Биохимический анализ активности аденилатпиклазы, протеинки-назы, фосфодиэстеразы сАМР и содержания сАМР в препаратах молочной железы человека показал, что содержание сЖР в первичных карциномах в 2-3 раза выше, чем в дисплазиях, ввиду увеличенной в 2-3 раза активности аденилатпиклазы в раковой ткани. Активность фосфодиэстеразы сАШ? во всех исследованных препаратах примерно одинакова ( Eppengerger et al*, 1978). Активность сАМР-зависи-мых и независимых протеинкиназ и cAIvIP-связывающая способность в раковой ткани также повышена в 2-3 раза по сравнению с нормой при расчете на единицу веса клеточного белка, при этом степень активации сАМР-зависимых протеинкиназ в нормальной и опухолевой тканях примерно одинакова (Eppengerger et al,, 1977; Epperiber-ger et al., 1978). Интересно, что при расчете активности протеинкиназ и сАМР-связывающей способности на единицу веса ДНК получаются сходные значения этих величин для нормальной и раковой тканей, что объясняется различной относительной клеточной плотностью последних ( Majumder, 1971;Eppenberger et al., 1977).

Изучение активности сАМР-зависимых протеинкиназ I и П типа в нормальных и трансформированных клетках молочной железы человека показало, что в нормальных клетках преобладает киназа П типа (более 70% общей активности). При злокачественной трансформации происходит двухкратное увеличение активности протеинкиназы I, в результате чего отношение активностей протеинкиназ I и П меняется от 0,3 в норме до 0,63 в раковых клетках ( Handscbin, Epperiberger, 1979).

Большой цикл работ, выполненных в недавнее время в лаборатории Чо - Чанг, позволил выявить интересные закономерности изменения протеинкиназной активности в ходе прогрессии и регрессии Д.'ША-индуцированной опухоли молочной железы крысы, а также уста- новить важную взаимосвязь между системой гормональной регуляции роста опухоли стероидами и системой сЖР. Было показано, что рост большинства ДМБА-индундрованных карцином молочной железы (более 70$) гормон-зависим и регрессия опухолей, вызванная овариэ-ктомией или обработкой животных дибутирил-сАМР, сопровождается значительным ростом как сАМР-связывающей способности, так и протеинкиназнои активности (Cbo-Chung et al., 1978^а; Bodwin et al., 1978). При этом, сАМР-зависимая протеинкиназа I типа' не обнаруживается в регрессирующей опухоли и рост протеинкиназнои активности происходит целиком за счет увеличения активности про-теинкиназы її ( Cho-Clraiig et al», 1978^ъ ). Описанные биохимические события предшествуют видимой регрессии опухоли и регистрируются уже через 6 часов после ее индукции. Индукция диабета у экспериментальных животных также приводит к регрессии гормонзависимой опухоли и сопровождается сходными биохимическими изменениями, что, очевидно, можно объяснить, учитывая механизм действия инсулина. Инсулин, являясь нестероидншл гормоном,ингибирует активность мемб-ранно-связанной аденилатциклазы. Его отсутствие в крови животных-диабетиков приводит непосредственно к увеличению внутриклеточного содержания сАМР и имитирует действие экзогенного дибутирил--cAMP ( Shafie et al,, 1979). При регрессии гормон-зависимой опухоли после овариэктомии наблюдается характерные ренипрокные изменения в специфическом связывании сАМР и экстрогена: через 6 дней после операции связывание сАМР в ядрах возрастает в 5 раз и в два раза в цитозоле, тогда как связывание эстрогена уменьшается на 80$ и 50$, соответственно ( Cho-Chung et al*, 1978^а). Эти изменения сопровождаются параллельным увеличением содержания сАМР, активностей зденилатцдклазы, фосфодиэстреразы, сАМР-зави-симой протеинкиназы и могут быть обращены при повторной стимуля- ции роста опухоли, вызванной индукцией 17Р-эстрадиола. Дальнейшие исследования в этом направлении показали, что одновременное присутствие в цитозоле 17р -эстрадиола и сШР взаимно ингибиру-ет транслокацию в ядро обоих эффекторов ( Bodwin et al._f 1981). При этом отмечено отсутствие конкуренции между эстрогеном и сАМР как за цитоилазматические связывающие белки, так и за сайты акцепции в ядре.

На основании результатов приведенных исследований Чо-чанг была выдвинута гипотеза о роли сАМР в регуляции роста опухоли,в основе которой лежит представление о том, что для запуска регрессии гормон-зависимых опухолей молочной железы необходимы образование и транслокация в ядра клеток комплекса, включающего в себя сАМР, его рецепторный белок и каталитическую субъединипу протеинкиназы. Возможность существования и трапслокации указанного комплекса была обсуждена выше (см.стр. 19). Остановка роста опухоли зависит от целостности рецепторного белка для сШР и оптимальной концентрации сЖР в клетках ( Cho-Chung, 1980). Исследования состава сШР-связывающих белков в гормон-зависимой и независимой опухолях молочной железы показали, что оба типа опухолей содержат одинаковые рецепторные белки, 51 (48000), RII (56000) и протеолити-ческий фрагмент Щ (39000), одншсо, сШР-связывающие белки гормон--зависимой опухоли элюируются с ДЭАЭ-целлюлозы вместе с протеин-киназной активностью, тогда как гормон-независимой опухоли - при более высокой ионной силе (Cho-Chung et al., 1981). Эти результаты предполагают, что зарядовые модификации сЖР-связывающих белков, препятствующие образованию комплекса (холофермента), могут определять гормон-зависимый рост опухоли.

Из представленного обзора видно, что несмотря на значительные успехи в области изучения одного из важнейших клеточных про- цессов - фосфорилирования белков, протекающего при участии специфических ферментов фосфорилирования - протеинкиназ, общая картина регуляции не представляется окончательно ясной. Несомненная важность процесса фосфорилирования в регуляции клеточного роста и злокачественной трансформации, с одной стороны, и незначительное количество работ, посвященных исследованию активности протеинкиназ в ходе пролиферативного процесса, наряду с очень ограниченным крутом изучаемых объектов, с другой, стимулировали нас к проведению настоящего исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ

В работе использовали: ДЭАЭ-32 целлюлозу, Ватман 2Ш - фирмы " Whatman " (АНГЛИЯ), фильтры Сынлор В 6 - фирмы " Chema-pol " (ЧССР), сефадекс 6-150 - фирмы " Pharmacia " (Швеция), ATP, каталазу, альбумин, шоглобин, декстран голубой, Кумасси G-250 - фирмы " Serva " (ФРГ), сАІЛР, дитиотреитол - фирмы "Calbiochem " (США), МЕС буфер, теофиллин, изобутилметилксан-ТИН - фирмы " Sigma " (США), /³Н/сАМР '- фирмы " Amersham " (Англия), STP, ЭДТА, ЭГТА - фирмы "Reanal " (Венгрия).

Изотопы / Y -³³Р/АТР и /³Н/ тимидин с удельной радиоактивностью 10 Ки/ммоль, соответственно, получены в объединении "ИЗОТОП".

Остальные реактивы были отечественного производства марок х.ч. и ос.ч.

М Е Т О Д Ы

1. Культивирование клеток асштной карциномы Эшиха.

В опытах использовали клетки аспитной карциномы Эрлиха, полученные из отдела цитологии опухолевого роста Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (Киев). Клетки пассировали в белых беспородных мышах 2-3-х месячного возраста, которых содержали на стандартной кормовой диете, соблюдая световой и тепловой режимы. Перевивку основной клеточной линии опухоли осуществляли на 10 день ее развития. Опухоль перевивали внутриперитонально, вводя животному 10 млн. клеток в объеме 0,2 мл. Асцит отбирали при помощи шприца. Клетки собирали центрифугированием (5 мин, 500 g) промывали дважды физиологическим раствором и ресуспендиро-вали в нем же. Концентрация клеток в суспензии составляла около 50 млн/мл (суммарное количество клеток опухоли на 10 день развития - около 500 млн). Подсчет клеток осуществляли в камере Горяе-ва. Все описанные операции проводили в полустерильных условиях при комнатной температуре.

2. Фракционирование клеток аспитной карциномы Эшиха методом седиментации в градиенте плотности сахарозы.

Множественные формы протеинкиназ из клеток асцитной карциномы Эрлиха Токмаков Александр Александрович

Похожие диссертации на Множественные формы протеинкиназ из клеток асцитной карциномы Эрлиха