Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 7
1. Са2+-Транспортирующие системы клетки 7
1.1. Механизмы входа Са в клетки 8
1.1.2. Истинные рецептор-управляемые каналы. 8
1.1.3. Со2" -каналы, активируемые вторичными посредниками. 10
1.1.4. G-белок-управляемые Со2* - каналы. 12
1.1.5. Потенциал-управляемые кальциевые каналы. 13
2. Са2+-каналы плазматической мембраны регулируемые кальмодулином . 14
2.1. Депо-управляемый вход Са2*. 14
2.2. Со2' -каналы регулируемые арахидоновой кислотой . 23
2.3. Каналы регулруемы циклическими нуклеотидами. 28
2.4. NMDAрецепторы. 29
3. Внутриклеточные СА2+ каналы регулируемые кальмодулином. 29
3.1. Рианодиновые рецепторы. 30
3.2.1РЗ рецепторы. 31
4. Са2+- независимая фосфолипаза А2. 32
4.1. Ингибиторы IPLA2 33
4.2. Механизмы регуляции активности iPLA2. 34
4.3. Функции iPLA2 во внутриклеточной сигнализации . 35
4.3.1. Вход кальция. 35
4.3.2.Секреция и ишемия сердца. 36
4.3.3. Апоптоз. 37
5. Вход Са2+ в клетки под действием ингибиторов кальмодулина. 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования . 41
2.1. Получение клеток. 41
2.2. Измерение [Са2*]^ 41
2.3. Измерение Са2+ во внутриклеточных структурах. 42
2.4. Измерение скорости транспорта Мп2+. 42
2.5. Описание экспериментальной установки. 42
2.6. Измерение цитозольного кальция ([Са2*]!) при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. 43
2.7. Измерение А ТФ с использованием люциферин-люциферазной реакции. 44
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 45
3.1. R24571 вызывает секрецию АТФ и транзитное повышение Са в клетках АКЭ. 45
3.3. Со2' -каналы, индуцируемые R24571, проницаемы для Мп +. 55
3.4. Ингибиторы Со2*-канала, индуцированного R24571. 56
3.5. Ингибиторы Са*-независимых фосфолипаз А2 PACOCF3 и BEL подавляют вход Со2' ', активированный R24571. 64
3.6. Температурная зависимость Са -каналов, индуцированных R24571. 66
3.7. Взаимодействие R24571 и ингибиторов входа Са2* с калъмодулином. 67
Заключение. 72
Список цитированной литературы 77
Список работ по теме диссертации
- Механизмы входа Са в клетки
- Со2' -каналы регулируемые арахидоновой кислотой
- Функции iPLA2 во внутриклеточной сигнализации
- Измерение скорости транспорта Мп2+.
Введение к работе
Каждая клетка использует ионы Са + как ключевой мессенджер для регуляции широкого спектра физиологических процессов. Поддержание кальциевого гомеостаза -тонкий, сложный, хорошо отрегулированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са2+-транспортирующие системы клетки. Увеличение концентрации цитозолыюго Са ([Са ]i) является одним из важнейших сигналов в системе внутриклеточной передачи информации и может происходить как за счет выхода Са из регулируется степенью опустошения Са -депо клетки (Berridge, 1997, 1998). Депо внутриклеточных депо, так и за счет входа Са из внешней среды. В электро-возбудимых клетках вход Са2+ осуществляется по потенциал-зависимым Са2+-каналам и достаточно хорошо изучен. Механизмы, связанные со входом Са2+ в электро-невозбудимых клетках изучены значительно меньше. Са2+-каналы невозбудимых клеток до настоящего времени не выделены в чистом виде, и лишь частично охарактеризованы. Не идентифицированы также природные химические соединения, открывающие эти каналы. До настоящего времени предполагалось, что одним из основных путей входа Са2+ в электроневозбудимые клетки является депо-управляемый или "емкостной" вход Са2+, который управляемый вход Са2+ осуществляется по SOC-каналам (store-operated channels) и является, по-видимому, универсальным, но не единственным, механизмом входа Са + во всех невозбудимых и в ряде возбудимых клеток. Совсем недавно открыты несколько новых типов Са -каналов в электро-невозбудимых клетках, отличных от SOC и управляемых кальмодулином (Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1996). Кроме того, появляется все больше сведений об участии кальмодулина в регуляции уже изученных ионных каналов.
Участвуя в регуляции активности более 100 белков, кальмодулин выполняет важную функцию усиления и синхронизации Са2+-зависимых процессов в клетке.
9+ 9+
Кальмодулин регулирует ключевые Са транспортирующие системы, такие, как Са -АТФ-аза плазматической мембраны (Carafoli Е. 1987, McConnell E.J.,et al., 2000) и Са2+-каналы плазматической мембраны (Zhang S., et al., 1998; Saimi Y., and Kung С 2002), сарко- и эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Sunagawa М, et al., 1999, Watanabe Н., et al., 1999, . Balshaw D.M., et al., 2001). Кроме того, кальмодулин регулирует активность ферментов, связанных с обменом Са2+: фосфодиэстеразу типа I (Cheung W.Y. 1970), кальмодулин-зависимую протеинкиназу II, фосфолипазу D (Parmentier J.H., et al., 2001), NO синтетазу (Huang P.L., et al., 1995), фосфолипазу A2 (Wolf M.J., Gross R.W. 1996) и контролирует проводимость каналов одновалентных HonoB(Sanderson J., et al., 1994). Таким образом, кальмодулин представляет собой переключатель, который синхронно меняет активность большого числа белков в клетке. Применение ингибиторов кальмодулина позволяет выяснить роль и участие этих белков в регуляции той или иной функции клетки. Одной из важнейших функций кальмодулина является его участие в контроле Са -зависимого экзоцитоза и секреции (Баумуратов А.С., и др. 2003,).
Ингибиторы кальмодулина, кроме найденной нами активации секреции АТФ в клетках асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), стимулируют секрецию АТФ тромбоцитами человека (Luckhoff A., et al., 1991), секрецию инсулина и АТФ из Р- клеток поджелудочной железы (Kindmark Н., et al., 1995) и секрецию ренина из клеток почки (Park C.S., et al., 1986). Роль кальмодулина в регуляции цитозольного Са , а также молекулярный механизм участия кальмодулина в регуляции секреции остаются в большой степени не известными. Ингибиторы кальмодулина повышают уровень внутриклеточного Са2+, подавляя Са2+-АТФ-азу плазматической мембраны (Carafoli Е. 1987) и активируя мобилизацию из внутриклеточных структур и вход Са в клетки (Watanabe Н., et al., 1999). По крайней мере один из Са -каналов, индуцированных ингибиторами кальмодулина в плазматической мембране клеток, является проницаемым для Mn2+ (Lo Y.K., et al., 2001, Jan C.R., et al., 2001). Активацию входа Ca2+ и Mn2+ под действием R24571 наблюдали в нейронах гиппокампа (Mironov S.L., Lux H.D. 1991), в гладкой мышце сосудов (Sunagawa М., et al., 1998), в культуре клеток гладкой мышцы А10 (Lo Y.K., et al., 2001), в опухолевых клетках простаты человека (Jan C.R., et al., 2001) и в клетках почки собаки (Jan C.R., et al., 2000). В нейронах гиппокампа и в гладкой мышце сосудов ингибиторы кальмодулина вызывают вход Са2+ через потенциал-зависимые каналы L-типа. Аналог R24571, фенделин, также вызывает вход внешнего Са'т и Мп'т через каналы L-типа в клетках почки собаки и в раковых клетках простаты человека РСЗ (Jan C.R.,etal., 2001).
На ряде клеток R24571 вызывает мобилизацию Са , сопоставимую с мобилизацией под действием Са2+ ионофора иономицина (Lucchesi P. A., Scheid C.R. 1988). Однако эта мобилизация либо не зависит от инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3), либо опосредована вызванной секрецией АТФ или лейкотриена D4, которые взаимодействуют со своими рецепторами, сопряженными с IP3-зависимым механизмом мобилизации Са .
Опосредованное действие ингибиторов кальмодулина на Са2+-транспортирующие системы может быть обусловлено продуктами активации NO-синтетазы и Са -независимой фосфолипазы А2 (iPLA2) (Smani Т., et al., 2003). Таким образом, литературные данные указывают на участие ингибиторов кальмодулина в активации iPLA2 и Мп -проводящих Са -каналов в ряде клеток.
Предполагается, что эта iPLA2 является индуктором активации Са -каналов, регулируемых запасом Са в ЭР (store-operated channels, SOC). Поскольку ингибиторы iPLA2 подавляют вход Са2+, то индуктором канала может быть лизофосфолипид, образующийся при активации iPLA2. Подавление активности этой изоформы PLA2 приводит к ингибированию неселективных SOC и Са -селективных (CRAC) каналов в гладкой мышце сосудов, тромбоцитах человека и Т-лимфоцитах (Smani Т., et al., 2003). Активация iPLA2 приводит к открытию каналов двух типов — Са2+-селективного и неселективного катионного канала (Trepakova E.S., et al., 2001). Природный активатор iPLA2 не известен. Одним из претендентов на роль активатора является фактор входа Са2+ (calcium influx factor, CIF) (Smani Т., et al., 2003).
Ранее было показано, что арахидоновая кислота и ингибиторы ее окисления подавляют активированный вход Са'т в клетки (Gukovskaya A.S., et al., 1989). Действие R24571 на клетки приводит к усилению продукции арахидоповой кислоты (Wolf M.J., Gross R.W. 1996). Таким образом, арахидоновая кислота может выступать в качестве ингибитора входа Са , особенно при высоких концентрациях, которые достигаются в присутствии ингибитора ее окисления (NDGA). Возможно также, что арахидоновая кислота в больших концентрациях угнетает активность самой PLA2 (ингибирование продуктом). Эти два ингибируїощих эффекта арахидоповой кислоты могли бы отвечать за подавление R24571-индуцированного входа
Однако, несмотря на многочисленность литературных данных, механизм, посредством которого ингибитор кальмодулина R24571 вызывает кратковременный вход Са2+ в клетки асцитной карциномы Эрлиха оставался неизвестным..
Исходя из вышесказанного цель настоящей работы заключалась в исследовании свойств нового Са2+ канала индуцированного ингибиторами кальмодулина в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Изучение механизмов активации и инактивации этого Са -канала, индуцированного ингибиторами кальмодулина в плазматической мембране невозбудимых клеток. Поиск механизмов регуляции канала ионами Са , кальмодулином, продуктами Са -независимой фосфолипазы А2 и арахидоповой кислотой. Поиск специфических ингибиторов этого канала.
Механизмы входа Са в клетки
В эту подгруппу входят Са2+ каналы, сопряжение которых с рецепторами происходит при участии вторичных посредников (second messenger-operated channels-SMOC). В качестве активаторов Са -транспортирующих каналов плазматической мембраны могут выступать инозитол-1,4,5-трисфосфат, инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфат, ионы Са2+ и циклические нуклеотиды (cGMP и сАМР).
Данные о влиянии продуктов фосфоинозитидного метаболизма на ионную проницаемость плазматической мембраны очень фрагментарны. Первое сообщение о регистрации проницаемых для Са2+ каналов плазмалеммы, активируемых 1Рз, появились лишь в 1987 году в публикации Куно и Гарднера (Kuno & Gardner, 1987). С тех пор единственное подтверждение было получено в работах Г.Н.Можаевой и соавт. (Mozhaeva et al., 1990) в экспериментах с клетками карциномы человека А431. В недавней работе СБ. Семеновой и Г.Н. Можаевой, используя inside-out конфигурацию метода patch-clamp, впервые были зарегистрированы в мембране перитонеальных макрофагов мыши каналы с проводимостью около 1 pS с половинным подуровнем, дозозависимым образом отвечающие на приложение к внутренней поверхности фрагмента мембраны ІРз в диапазоне концентраций от 0,2 до 10 мкМ. Высокий положительный потенциал реверсии токов ( 60mV) при использовании в качестве носителя тока 105 мМ Ва указывает на их высокую селективность для двухвалентных катионов по отношению к К+. Вероятность открытого состояния каналов резко уменьшалась при деполяризации мембраны. Видимая константа связывания рецептора была близка к 1мкМ, а при высоких концентрациях (более 10 мкМ) наблюдался процесс инактивации рецептора. Таким образом, были получены прямые доказательства существования рецепторов ІРз в мембране макрофагов, активация которых вызывает открывание высокоселективных низкопроводящих Са2+ каналов. Кроме того, было показано, что активность этих каналов находится под негативным контролем арахидоновой кислоты (или ее метаболитов) (Семенова СБ., Киселев К.И., МожаеваГ.Н., 1997).
Косвенно существование активируемых ІРз кальциевых каналов подтверждают исследования Пэннера (Penner et al., 1988), в которых показано, что введение в цитоплазму тучных клеток ІРз активирует вход наружного Са2+. Зависимость входа Са от потенциала (усиление при гиперполяризации и уменьшение при деполяризации) свидетельствует, что ионы Са2+ идут через каналы.
В пользу того, что в активации агонистами входа Са участвует ІР4, свидетельствует много косвенных данных (Irvine & Moor, 1986; Morris et al., 1987; Peterson, 1989). Пока что 1Р4-активируемые каналы обнаружены только в эндотелиальных клетках (Luckhoff & Clapham, 1992).
В опытах с нейтрофилами (Von Tscharner et al., 1986) были получены данные о возможном участии Са +-активируемых, транспортирующих кальций каналов в стимулзависимом токе этого иона через плазматическую мембрану. В плазматической мембране нейтрофилов выявлены два типа неселективных катионных каналов, имеющих примерно одинаковую проводимость для Са и К . На фрагменте мембраны эти каналы активируются при повышении концентрации Са2+ с цитоплазматической стороны.
Из активируемых вторичными посредниками проводящих Са каналов лучше всего исследованы cGMP/cAMP-чувствительные каналы. Они представляют собой низкоселективные катионные каналы, активируемые циклическими нуклеотидами с внутренней стороны мембраны. Впервые эти каналы были обнаружены в палочках сетчатки (Fesenko et al., 1985), а затем их существование было показано в колбочках сетчатки (Nakamura & Gold, 1987). В фоторецепторных клетках эти каналы активируются под действием cGMP (Kaia=10-50 мкМ, Какг для сАМР более 1мМ), а в обонятельных нейронах сродство к обоим циклическим нуклеотидам примерно одинаково (Какт для сАМР и cGMP равны соответственно 1,6 мкМ и 2,3 мкМ) (Nakanura & Gold, 1987; Yau & Baylor, 1989). По данным Колесникова и соавт. (Kolesnikov et al., 1990), полученных в опытах на обонятельных нейронах, каналы данного типа имеют слабовыраженную селективность в ряду одновалентных катионов (Li+,Na+, K+ Rb+ Cs+) и несколько более селективны в отношении к Са2+ (Ca2+ Na+ Mg2+ Ba2+).
Чувствительные к циклическим нуклеотидам каналы относятся к типу лиганд-активируемых каналов. Они открываются при непосредственном связывании с ними циклических нуклеотидов-cGMP (фоторецепторы) и cAMP/cGMP (обонятельные нейроны), без участия протеинкиназ (Stryer, 1986; Lancet & Расе, 1987). Каналы образованы одним полипептидом с молекулярной массой около 75 кДа (Cook et al., 1987; Ludwig et al., 1990). Анализ аминокислотных последовательностей показывает, что в молекуле чувствительных к циклическим нуклеотидам каналов имеется шесть трансмембранных доменов и по крайней мере один участок гликозилирования с наружней стороны мембраны. В функционально активном состоянии cAMP/cGMP-чувствительные каналы представляют собой гомоолигомер, образованный четырьмя или пятью 75 кДа-полипептидами.
Существует третий тип независимых от потенциала кальций-транспортирующих каналов, открываемых под действием агонистов. Это так называемые G-белок-управляемые каналы (Pietrobon et al., 1990). Активация Са2+-проводящих каналов данной группы может происходить в результате прямого сопряжения с ними рецепторов через G-белок. Убедительные данные в пользу непосредственного взаимодействия G-белка с кальциевым каналом получены в опытах на фибробластах линии BALB/сЗТЗ (Nishimoto et al., 1987) и клетках карциномы человека А 431 (Mozhaeva et al, 1990b). В этих работах активация каналов наблюдалась при добавке негидролизуемых аналогов GTP с цитоплазматической стороны изолированного фрагмента мембраны. В случае фибробластов BALB/сЗТЗ эти же каналы активировались при действии инсулинподобного фактора роста II (ИФР-И), причем для их стимуляции было необходимо, чтобы ИФР-Н находился в пипетке с наружней стороны фрагмента мембраны (Matsumara et al., 1988). В том случае, когда фактор роста добавляли к поверхности клетки вне исследуемого фрагмента мембраны, активации каналов не наблюдалось. Последнее свидетельствует против участия растворимых вторичных посредников в передаче воздействия от рецепторов ИФР-Н на каналы, хотя полностью исключить такую возможность нельзя.
Со2' -каналы регулируемые арахидоновой кислотой
Регулируемые арахидоновой кислотой каналы (ARC каналы) недавно обнаруженные Са2+ селективные каналы отличные от SOC каналов. ARC каналы играют 9+ ключевую роль в Са т сигнализации в невозбудимых клетках в которых они обеспечивают основной рецептор- активируемый вход Са при низких, физиологических концентрациях 9+ агониста. При этих условиях Са сигнал приобретает форму повторяющихся осцилляции, и рецептор- активируемый вход Са2+ модулирует частоту этих осцилляции (Rooney, Т.А., et. al.,1989, Berridge, MJ. 1990, Girard, S. and Clapham, D. 1993, Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1996). При это внутриклеточные Ca2+ депо кратковременно или частично опустошаются и возникает вопрос не появляется ли при этом сигнал для SOCE.
Последние результаты показывают, что вход Са при этих концентрациях агониста не соответствует модели SOCE (Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1996, Shuttleworth, T.J. 1999), и вход Са управляется не SOCE механизмом. В результате нескольких 9-4 исследований было показано, что в различных типах клеток такой вход Са зависит от рецептор- опосредованной генерации арахидоновой кислоты (Shuttleworth, T.J. 1996, Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1998, Munaron, L., et. al. 1997, Broad L.M.,et. al., 1999). Так, активация генерации арахидоновой кислоты вызывается низкими концентрациями агонистов вызывающих не SOCE, и ингабирование генерации арахидоновой кислоты специфично и быстро блокирует вход Са2+. Более того, прямая аппликация Аарахидоновой кислоты активирует вход Са2+ (измеряемый помимо прочего по тушению флуоресценции зондов ионами Мп2+) который не зависит от опустошения Са2+ депо клетки. Использование блокаторов метаболизма арахидоновой кислоты и ее неметаболизируемых аналогов (ETYA) показывает, что непосредственно арахидоновая 9+ кислота вызывает активацию Са каналов, а не ее метаболиты (Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1998).
Свойства входа Ca2+ при низких концентрациях агониста отличаются от известных свойств депо- зависимого входа Са2+ и вынуждают искать альтернативные механизмы агонист- активируемого входа Са2+. Результатом таких поисков явилась модель входа Са2+ не зависящая от опустошения депо и зависящая от агонист- индуцированной генерации арахидоновой кислоты (Shuttleworth Т.J., 1996, Shuttleworth, T.J. and Thompson, J.L. 1998). Этот зависимый от арахидоновой кислоты, неемкостной вход Са2+ был показан на многих типах клеток (Broad, L.M.,et. al., 1999, Guibert С, et. al. 2004, Munaron L., et. al., 1997). 9+ 9+ Каналы обеспечивающие вход Са при этих условия названы Са каналы регулируемые 9+ Каналы обеспечивающие вход Са при этих условия названы арахидоновой кислотой (Mignen О. and Shuttleworth Т.J., 1997).
Характеристика свойств этих новых каналов с использованием patch-clamp техники показала, что они внешне схожи с SOC каналами и такие каналы имеются на многих типах клеток. Эти каналы показывают высокую селективность для Са2+, ингибируются лантаном, потенциал реверсии более +40 mV. Несмотря на эти сходства, ARC каналы демонстрируют уникальные биофизические и фармакологические свойства, которые четко отличают их как от классических CRAC каналов, так и от SOC каналов обнаруженных в этих же клетках. ARC каналы активируются в летках с полностью опустошенными Са депо (обработка такпсигаргином) и ARC токи регистрируемые на целой клетке и эндогенный SOC ток регистрируются одновременно на одних и тех же клетках (Mignen О. and Shuttleworth T.J., 2000). В отличие от CRAC каналов и эндогенных SOC каналов, ARC не имеют быстрой инактивации и они не ингибируются понижением внутриклеточного рН. Их чувствительность к Gd схожа с таковой для различных SOC каналов, но они не чувствительны к 2-АРВ (Mignen О., et. al., 2003). Как CRAC каналы и потенциал- зависимые Са2+ каналы, ARC каналы пропускают одновалентные катионы в отсутствие двухвалентных катионов в экстраклеточной среде. Однако отношение тока Na+: Са2+ в 4 раза больше чем в случае CRAC каналов (Mignen О. and Shuttleworth T.J., 2001). ARC каналы в 50 раз более селективны для Са2+ чем CRAC каналы (Mignen О., et. al., 2003). Конечно, основным отличием является то, активация ARC каналов полностью не зависит от опустошения депо и специфически зависит от арахидоновой кислоты. Активация происходит при добавлении низких концентраций арахидоновой кислоты (2-8 мкМ), что является важной точкой, т.к. при высоких концентрациях арахидоновой кислоты ( 20 мкМ) наблюдается неспецифическая проницаемость мембраны, результат детергент-подобного действия арахидоновой кислоты при этих концентрациях. Другие полиненасыщенные жирные кислоты являются очень слабыми активаторами этих каналов, и насыщенные жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты также неэффективны (Mignen О., et. al., 2003). Следует отметить, что активация ARC каналов арахидоновой кислотой не ингибируется ингибиторам липоксигеназ, циклооксигеназ или путей метаболизма цитохрома р450, а значит, активация является результатом непосредственного действия арахидоновой кислоты. Более того, эксперименты с использованием непроникающего аналога арахидоновой кислоты, арахидонилкоэнзима А, демонстрируют, что активация ARC каналов происходит на внутренней стороне плазматической мембраны (Mignen О., et. al., 2003). Остается неясным действует ли арахидоновая кислота непосредственно на белки канала или активация происходит при участии неких молекул-посредников.
Функции iPLA2 во внутриклеточной сигнализации
Агонист- индуцированное опустошение Са2+ депо активирует SOC каналы и емкостной вход Са в клетки (А.Р. Albert, W.A. Large, 2003). Как состояние Са депо сообщается с плазматической мембраной остается неизвестным. Одна из гипотез предполагает наличие растворимого мессенджера генерируемого в при опустошении Са2+ депо и взаимодействующего с мишенями на плазматической мембране. На роль такого растворимого мессенджера претендует CIF (А.Р. Albert, W.A. Large, 2003). Первыми на связь между iPLA2- VIA и кальциевой сигнализацией указали Гросс (M.J. Wolf et al., 1997) и Турк (W. Nowatzke et al., 1998), которые сообщили, что опустошение внутриклеточных Са2+ депо вызывает увеличение активности iPLA2 и гидролиза фосфолипидов, аккумуляцию свободных жирных кислот, включая арахидоновую кислоту в гладкомышечных клетках крысы и панкреатических клетках. Однако, эти результаты основаны только на применении BEL, и биологическая роль этих процессов остается неясной. Используя различные техники блокирования клеточной iPLA2-VIA, Болотина и др. показали необходимость этого фермента для активации SOC каналов и емкостного входа Са в различных типах клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов, Т-лимфоциты, тромбоциты, и клетки базофильной лейкемии крысы (Т. Smani et al., 2003). В последующей работе был предложен новый механизм для депо- управляемой Са сигнализации в которой iPLA2-VIA играет центральную роль (Т. Smani, et al., 2004). Согласно авторам, CIF, продуцирующийся в ответ на опустошение Са2+ депо, смещает кальмодулин с iPLA2-VIA, что ведет к ее активации и продукции лизофосфолипида, который активирует SOC каналы и емкостной вход Са2+. При заполнении опустошенных Са2+ депо продукция CIF прекращается и кальмодулин связывается с iPLA2-VIA ингибируя ее. Это прекращает активность SOC каналов и останавливает емкостной вход Са2+ (Т. Smani, et al., 2004).
PLA2 может помешать перераспределению мембранных компонентов в двух случаях. В первом, она действует не напрямую, а активирую или ингибируя пути передачи сигнала путем генерации сигнальных молекул. Во втором случае, PLA2 может напрямую деформировать мембранные структуры и функции активизируя аккумуляцию лизофосфолипидов и свободных жирных кислот, которые могут стимулировать слияние биологических мембран увеличивая подвижность мембран или активируя не- бислойные структуры. В последние годы возрастает количество исследований указывающих на участие iPLA2-VIA в активации секреции множества протеинов по обоим механизмам (Z. Ma et al, 2001, Z. Ma et al., 2002). Глюкоза- индуцированная секреция инсулина панкреатическими клетками сопровождается увеличением гидролиза фосфолипидов (S. Ramanadham et al., 1999, S. Ramanadham et al., 1993). В этом случае BEL полностью ингибирует как секрецию инсулина так и гидролиз фосфолипидов (S. Ramanadham et al., 1993).
Усиленный катаболизм фосфолипидов наблюдается сразу после ишемии миокарда. Гипоксия увеличивает активность iPLA2 в изолированных миоцитах желудочков сердца, что выражается в активации выхода арахидоновой кислоты и аккумуляции лизофосфолипидов, что может вносить вклад в ишемические болезни сердца (J. McHowat et al., 1998). Показано, что острая ишемия сердца активирует iPLA2-VIA в интактном миокарде, и последующий гидролиз фосфолипидов приводит к летальной вентрикулярной тахиаритмии (D.J. Mancuso et al., 2003). Эти эффекты предотвращаются добавлением BEL непосредственно перед ишемией (D.J. Mancuso et al., 2003). Роль iPLA2-VIA в апоптозе впервые была показана Атсуми и др. (G. Atsumi, et al., 1998, 2000) на клетках промоноцитов обработанных индукторами апоптоза. В этих условиях, клетки подвержены апоптозу и выход свободных жирных кислот регулируется iPLA2-VIA (G. Atsumi, et al, 1998, 2000). В клетках U937 апопотоз сопровождается расщеплением фермента каспазой-3, центральным ферментом различных типов апоптоза. Результатом такого расщепления является увеличение активности iPLA2-VIA и разрушение фосфолипидов клеточной мембраны (G. Atsumi, et al., 2000). Более того, ингибирование iPLA2- VIA уменьшает апоптоз на ранних стадиях, но не влияет на поздние стадии апоптоза (G. Atsumi, et al., 2000). Сходные данные получены при Н202 индуцированном апоптозе (R. Perez et al., 2004). Сверхэкспрессия iPLA2-VIA увеличивает гидролиз мембранных фосфолипидов и уровень апоптоза (R. Pe rez et al., 2006). Однако, ингибирование iPLA2-VIA не предотвращает апоптоз, и хотя iPLA2-VIA участвует в гидролизе фосфолипидов при апоптозе, ее активность не требуется при полном развитие апоптоза (R. Pe rez et al., 2004). Предположительно, iPLA2-VIA вовлечена в дополнительные сигналы для апоптоза, названные привлекающими сигналами (К. Lauber et al., 2004).
Кальмодулин играет критическую роль в передаче эффектов цитозольного Са на клеточные процессы. Он также вовлечен в регуляцию многих каналов генерирующих Са2+ сигнал. Например, два наиболее известных механизма выброса Са через IP3R и RyR регулируются кальмодулином (Missiaen, L. et al., 1999, Michikawa, Т. et al., 1999). Для IP3R это ингибирующий механизм, а для RyR как ингибирующий, так и активирующий (Nadif Kasri, N. et al, 2002, Taylor, С. W. et al., 2002). Было показано ингибирующее действие кальмодулина на вход Са через SOC и TRP каналы (Singh, В. В. et al., 2002, Vaca, L. and Sampieri, A. 2002, Boulay, G. 2002, Zhang, Z. et al., 2001).
Самым распространенным способом исследования действия кальмодулина является использование его ингибиторов, таких как R24571 (calmidazolium), W7, TFP 9+ (trifluoperazine). Однако, эти агенты способны вызывать сильный CaiT сигнал по неизвестному механизму. R24571 (кальмидазолиум), например, вызывает выброс Са из внутриклеточных депо и вход Са снаружи в Диктиостелиуме (Schlatterer, С. and Schaloske, R. 1996), тромбоцитах (Luckhoff, A. et al., 1991), тиреоидных клетках FRTL-5 (Tornquist, К. and Ekokoski, E. 1996), клетках MDCK (Jan, C. R. and Tseng, C. J. 2000) и клетках HL-60 (Harper, J. L. and Daly, J. W. 2000). Эти ответы могут быть связаны с ингибированием кальмодулином Са каналов которое снимается добавкой ингибиторов кальмодулина.
Измерение скорости транспорта Мп2+.
Характер зависимости скорости трансмембранного переноса Са от температуры является важной характеристикой, несущей информацию о механизме этого переноса и ферментативных реакциях, регулирующих транспорт. Если процесс переноса Са запускается цепью последовательных ферментативных реакций, то он будет иметь сильную зависимость от температуры (Зинченко В.П., и др. 2003), если перенос осуществляется обменником, то проявится сильная зависимость от температуры в области фазового перехода мембраны (кривая 2, рис. 28). Если канал имеет большую проводимость и малую специфичность и, по сути, представляет собой пору, то транспорт Са через такой канал будет слабо зависеть от температуры (1).
Чтобы исследовать температурную зависимость активности R24571-индуцированного Са2+-канала, мы измеряли амплитуду и скорость нарастания Са2+-сигнала и входа Мп при разных температурах. Аналогичные измерения были проведены для Са -сигналов, индуцированных АТФ и низкими дозами иономицина. Характер зависимости амплитуды сигналов от температуры оказался различным. На рисунке 17 приведены зависимости амплитуды и скоростей этих сигналов от температуры. Показано, что R24571-индуцированный Са -сигнал мало меняется при понижении температуры (1). Скорость откачки Са из клеток и вход Мп в покое имеют сильную зависимость от температуры в области 27 - 37С. Иономицин-зависимый сигнал сильно подавляется в области 18 - 20С, что соответствует фазовому переходу липидов в клеточных мембранах (Krasne S.,et al. 1971). Таким образом, R24571-зависимая активация канала не включает цепь зависящих от температуры ферментативных реакций и не зависит от фазовых переходов липидов в мембране. Транспорт Са2+ в данном случае представляет собой перенос через канал высокой проводимости.
ВзаимодействиеR24571 и ингибиторов входа Са2+ с калъмодулином. Поскольку R24571 является специфичным ингибитором кальмодулина, возникает вопрос, не обусловлено ли действие изучаемых ингибиторов входа Са их взаимодействием с кальмодулином или с кальмодулин-связывающим участком белка-мишени. Известно, что при координировании Са в «EF-hand» доменах кальмодулин его структура меняется, открывая гидрофобную поверхность (Krasne S., et al., 1971; Babu Y.S., et al., 1985), которая обеспечивает его взаимодействие с пептидами-мишенями. Взаимодействие R24571 с кальмодулином приводит к изменению его конформации и потере способности связываться с эффекторными молекулами (Veigl М. L., et al., 1989).
Реакцию взаимодействия R24571 с кальмодулин можно наблюдать в растворе белка в присутствии Са и флуоресцентного индикатора, связывающегося с гидрофобной областью кальмодулина (в данном случае комплекс хлортетрациклина с Са2+) (Никитин В.П., Самойлов МО. 1990).
На рис. 29 показано, что добавление ионов Са2+ к раствору ХТЦ+ кальмодулин приводит к увеличению флуоресценции ХТЦ, по-видимому, за счет взаимодействия комплекса ХТЦ Са2+ с гидрофобной областью кальмодулина. ХТЦ а Время (сек) Сначала связывание Са происходит без сильного изменения флуоресценции, вероятно, поскольку сродство Са2+ к кальмодулину гораздо выше сродства к ХТЦ (Jurado L.A.,etal., 1999).
Затем при увеличении концентрации Ca2t флуоресценция возрастает, обнаруживая взаимодействие образующегося комплекса Са2+ ХТЦ с гидрофобным участком кальмодулина.
Добавление Mg тоже приводит к увеличению флуоресценции ХТЦ. Зависимости флуоресценции от концентрации Са2+ и Mg2+ приведены на рис. 30. Для ионов Са2+ наблюдается положительная кажущаяся кооперативность. ЕС50 процесса для ионов Са 238 ± 3 мкМ, коэффициент Хилла 2.3 ±0.1. Ионы Mg2+ тоже индуцируют гидрофобную конформацию, но кооперативности связывания при этом не наблюдается. Добавление R24571 вызывает тушение флуоресценции ХТЦ до уровня флуоресценции комплекса R24571 XTLJ Ca2+ в воде при любых концентрациях Са2+ в диапазоне 10"5-10"3 М, что указывает на исчезновение гидрофобной конформации. R24571 тушит М2+-зависимую флуоресценцию ХТЦ в гораздо меньшей степени. Следовательно, R24571 не вызывает конформационный переход и исчезновение гидрофобной Mg -зависимой конформации кальмодулина.
