Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Ионы кальция - как универсальный регулятор внутриклеточных процессов 10
1.2. Са как вторичный мессенжер в передачи информации 12
1.3. Участие митохондрий в контролировании внутриклеточной концентрации ионов кальция 15
1.4. Системы транспорта кальция в митохондриях 15
1.4.1. Электрогенная система входа кальция в митохондрии 16
1.4.2. Системы выхода кальция из митохондрий 17
1.4.2.1. Электронейтралъный обмен кальция на натрий 18
1.4.2.2. Электронейтралъный обмен кальция на протон 19
1.5. Митохондриальная циклоспорин А-чувствительная пора 20
1.6. Митохондриальная циклоспорин А-нечувствительная пора 24
1.7. Физиологическая значимость свободных жирных кислот 27
1.8. Роль жирных кислот в функционировании митохондрий 28
1.9. Апоптоз и некроз — два варианта гибели клеток 29
1.9.1. Морфологические критерии 30
1.9.2. Молекулярно-биохимические критерии 31
1.10. Участие митохондрий в развитии апоптоза 32
1.11. Пальмитиновая кислота как природный активатор апоптоза 35
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 38
2.1. Метод выделения митохондрий из печени крыс 38
2.2. Метод выделения митопластов из митохондрий печени крыс 39
2.3. Метод получения внутренней мембраны митохондрий и межмембранных контактных участков 39
2.4. Определение концентрации митохондриального белка 40
2.5. Экстракция липидов из мембраны митопластов с помощью этанола 40
2.6. Разделение гидрофобных и гидрофильных компонентов митопластов 41
2.6.1. Модификация метода Фолча 41
2.6.2. Выделение Са2+-связывающего компонента и жирных кислот модифицированным методом Фолча из малых количеств митопластов 41
2.6.3. Выделение жирных кислот по методу Блайя и Дайэра 42
2.6.4. Выделение жирных кислот по методу Боумену и Берозы 42
2.7. Очистка гидрофобного экстракта на колонке с кремниевой
кислотой 43
2.8. Аналитическая и препаративная тонкослойная хроматография 43
2.9. Определение Са2+-связывающих свойств 44
2.10. Разделение митохондриальных липидов на классы на колонке с аминопропилсиликагелем (Sep-PAK, Waters) 45
2.11. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента 46
2.12. Определение химической природы вещества 47
2.12.1. Ультрафиолетовая спектроскопия 47
2.12.2. Инфракрасная спектроскопия 47
2.12.3.ЯМР-спектрометрия 48
2.12.4. Газожидкостная хроматография жирных кислот 48
2.13. Определение содержания пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях 49
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение экспериментов 50
3.1. Очистка митохондриального низкомолекулярного гидрофобного Са2+-
связывающего компонента 50
3.2. Са +-связывающие параметры изучаемого компонента 55
3.3. Влияние различных ионов на способность связывать Са2+изучаемым веществом 58
3.4. Локализация гидрофобного Са2+-связывающего компонента в митохондриях 59
3.5. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента 61
3.6. Определение химической природы Са -связывающего компонента 63
3.6.1. Ультрафиолетовая спектроскопия Са -связывающего компонента...63
3.6.2. Инфракрасная спектроскопия Са2+-связывающего компонента 64
1 9-І-
3.6.3. Спектры Н-ЯМР Са -связывающего гидрофобного компонента 67
3.6.4. Газожидкостная хроматография Са2+-связывающего компонента 68
3.7. Инфракрасная спектроскопия пальмитиновой кислоты, пальмитиновой кислоты в комплексе с кальцием и пальмитата натрия 69
3.8. Сравнение методов выделения свободных жирных кислот 71
3.9. Определение Са -связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот 71
3.10. Влияние различных катионов на Са -связывающие свойства пальмитиновой кислоты 73
3.11. Определение ион-транспортирующих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот 76
3.12. Сравнение Са -связывающих свойств различных липидов 76
3.13. Влияние Са2+ и ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях печени крысы 82
Заключение 84
Выводы 90
Список литературы
- Участие митохондрий в контролировании внутриклеточной концентрации ионов кальция
- Метод получения внутренней мембраны митохондрий и межмембранных контактных участков
- Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента
- Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента
Введение к работе
Биологические мембраны играют ключевую роль в процессах регуляции и, в частности, в регуляции ионного гомеостаза клеток. Поддержание ионного гомеостаза является необходимым условием выживания клеток. В связи с этим, изучение механизма регуляции целостности одного из типов мембран клеток, а именно митохондриальной, является актуальной задачей.
Как известно, ионы Са2+ являются наиболее активными регуляторами биологических процессов в организме. Они выступают в качестве сопрягающего фактора между возбуждением и сокращением в мышцах, участвуют в тромбообразовании, выбросе нейротрансмиттеров, образовании микротрубочек, в гормональных ответах, экзоцитозе, делении клеток, адгезии, росте и апоптозе клеток. Уровень кальция в цитоплазме контролируется работой Са+-транспортирующих систем, локализованных в плазматической мембране и в мембранах клеточных органелл. Митохондрии являются органеллами способными аккумулировать избыточный кальций цитоплазмы, что в свою очередь, активирует Са2+-чувствительные ферменты их матрикса.
В последнее время большое внимание стали уделять изучению Са -зависимой митохондриальной поры, так как она активируется при ряде патологий: ишемия, болезнь Рефсума (Schonfeld, Struy, 1999), ожирение (Shimabukuro et al., 1998; Perez et al., 1997; Zhou et al., 2000), диабет (Shimabukuro et al., 1998; Gremlich et al., 1997) и тиреотоксикозе (Sliepchevich et al., 1973; Turakulov et al., 1973). Эта пора чувствительна к циклоспорину A (Kimberly et al., 1989; Zoratti, Szabo, 1995) и ее появление в мембране связывают с Са -зависимым изменением конформации различных митохондриальных белков (Halestrap et al., 2002). Механизм этой поры
широко изучается, так как показано, что циклоспорин А предупреждает развитие в клетке ряда патологических состояний (Nazareth et al., 1991).
В настоящее время, уже в процессе выполнения работы, появились данные о существовании в митохондриях другой Са2+-активируемой поры, так называемой, циклоспорин - нечувствительной митохондриальной поры (Sultan and Sokolove, 2001а). Предполагается, что ее образование в митохондриях не связано с формированием белковой поры. Однако, механизм образования циклоспорин -нечувствительной поры до сих пор не ясен. Поэтому выяснение природы, обнаруженного в нашей лаборатории низкомолекулярного гидрофобного компонента (Mironova et al., 1997), который связывает Са , увеличивая при этом проницаемость бислойной липидной мембраны, может пролить свет в понимании молекулярного механизма этой Са2+-зависимой поры.
Целью настоящей работы являлась очистка, обнаруженного ранее гидрофобного низкомолекулярного Са +-связывающего и ион-транспортирующего компонента, выяснение его химической природы и локализации в мембране, изучение параметров его Са -связывающих свойств. После выяснения химической природы гидрофобного компонента провести сравнение выше упомянутых свойств с таковыми у коммерческого аналога.
В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:
Очистить низкомолекулярный гидрофобный Са +-связывающий компонент внутренней мембраны митохондрий и исследовать его ион-транспортирующие свойства в бислойной липидной мембране.
Измерить параметры связывания кальция изучаемым компонентом и исследовать влияние различных ионов на способность связывать Са2+ изучаемым веществом.
Определить локализацию гидрофобного Са -связывающего компонента в митохондриях.
Выяснить химическую природу Са2+-связывающего компонента, используя различные физико-химические методы.
Определить Са +-связывающие свойства различных классов липидов.
Измерить параметры Са2+-связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.
Проанализировать влияние Са2+ и ингибитора фосфолипазы Аг -аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в экспериментах на интактных митохондриях, печени крысы.
Научная новизна работы.
Выяснена химическая природа низкомолекулярного гидрофобного Са -связывающего компонента внутренней мембраны митохондрий обладающего ион-транспортирующими свойствами в бислойной липидной мембране, который, главным образом, состоит из пальмитиновой и стеариновой жирных кислот. Определены параметры связывания Са этим компонентом.
Обнаружено уникальное свойство пальмитиновой и стеариновой жирных кислот связывать кальций с высоким сродством. Липиды других классов таким свойством не обладают. Это позволяет по-новому взглянуть на механизмы индуцируемой пальмитиновой кислотой проницаемости митохондриальной мембраны и пальмитат-активируемого апоптоза. Научно-практическое значение работы.
Результаты могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, а также найти применение в медицине при разработке фармакологических препаратов, поскольку показано, что свободные жирные
кислоты вовлечены в развитие ряда таких патологических явлений как ишемия, болезнь Рефсума, ожирение, диабет, тиреотоксикоз и другие.
Участие митохондрий в контролировании внутриклеточной концентрации ионов кальция
В 1962 году впервые было обнаружено, что поглощение Са2+ митохондриями является энергозависимым процессом (Vasington, Murphy, 1962). Движущей силой транспорта ионов кальция через митохондриальную мембрану является трансмембранный электрохимический градиент протонов (Ацн+), генерируемый дыхательной цепью или работой Н+-АТРазы при гидролизе АТР. То, что протонный градиент является движущей силой входа кальция подтверждается тем фактом, что в энергизованных митохондриях вход кальция предотвращается ингибиторами дыхательной цепи, но не олигомицином - ингибитором Нь-АТРазы (Lehninger et al., 1967). С другой стороны, в условиях, когда выброс протонов обусловлен гидролизом АТР, вход Са2+ может быть блокирован ингибиторами Н -АТРазы, но не ингибиторами дыхательной цепи (Lehninger et al., 1967). На основании этих экспериментов был сделан вывод, что вход кальция в митохондрии осуществляется электрофоретически за счет работы унипортера, а не по механизму обменника или симпорта (Scarpa, Azzone, 1970). Установлено, что работа унипортера ингибируется магнием (Jacobus et al., 1975) и активируется спермином (Allshire et al., 1985). Также был обнаружен специфический ингибитор унипортера - поликатион рутениевый красный (Mela, 1969; Puskin et al., 1976). Кальциевый унипортер в митохондриях является, по-видимому, комплексом, состоящим из гликопротеида с молекулярной массой 40 кДа и пептида с молекулярной массой 2 кДа. Этот комплекс ранее был выделен в нашей лаборатории и при реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) обладал кальций-транспортирующими свойствами (Миронова и др., 1980), ингибировался рутениевым красным (Mironova et al., 1982), а также полученными к нему антителами (Saris et al., 1993).
Помимо электрогеной системы входа кальция в митохондриях имеется, так называемая, электронейтральная система выхода ионов кальция. В 70-е годы прошлого столетия значительное внимание стали уделять изучению процесса высвобождения ионов Са из митохондрий. Предполагалось, что в митохондриях 94- 94 существует независимая от системы электрогенного входа Са система выхода Са (Puskin et al., 1976). Такой вывод был сделан на основании результатов, полученных на целых клетках (Rasmussen, 1970), субмитохондриальных частицах (Pedersen, Coty,1972) и митохондриях (Rossi et al.,1973; Greehavalt et al., 1964).
В настоящее время имеются многочисленные данные, указывающие на существование нескольких путей выхода Са2+ из митохондрий (Greehavalt et al., 1964; Caroni et al., 1978). Показано, что выход Са из митохондрий может осуществляться посредством электронейтрального, потенциалнезависимого, нечувствительного к рутениевому красному пути в обмен на Na+ (в митохондриях сердца и мозга) (Crompton et al., 1976; 1978) или Н+(митохондриях печени и почек) (Crompton et al., 1978). Основным признаком, указывающим на существование независимых от системы электрогенного входа системы электронейтрального выхода Са , является сохранение высокого мембранного потенциала в процессе высвобождения Са из митохондрий (Nicholls, 1978). Это обеспечивается наличием электронейтрального обмена Са2+ на Na+ или H+/Na+ индуцирующего выход Са2+, который, как уже упомянуто выше, впервые описан Кромптоном с соавт. (Crompton 2+/TJ+ et al., 1976). Однако, Рэкер предполагает существование раздельных Са /Н и Na+/H+ обменных систем, объединение которых даёт Ca2+/Na+ обмен (Racker, 1980).
Предполагается, что №+-зависимый выход Са2+ может иметь место в процессе мышечного сокращения: Na+ поступает в саркоплазму в момент возбуждения и в ответ на появление в цитоплазме Na+, он входит в митохондрии, а Са2+ выходит из них (Leninger, 1974). В сердечной мышце потоки Са2+, Na+ и Н+, вероятно, могут быть объединены в цикл (Crompton et al., 1976). В этом цикле никогда не может быть достигнуто стационарное состояние, как это имеет место in vitro, так как концентрация Са в цитоплазме колеблется в процессе сокращения и расслабления сердечной мышцы. Полагали, что Са /2Na обмен существует только в митохондриях электровозбудимых тканей и отсутствует в митохондриях печени и почек, где имеет место только Са2+/2Н+ обмен. Однако, ряд авторов полагают, что №+-индуцированный выход Са2+ существует и в митохондриях печени и почек (Haworth et al., 1980). Хэффорд считает, что этот путь не был выявлен ранее из-за высокой скорости основного пути выхода, существующего в митохондриях печени в стационарном состоянии до добавления Na (Hefford, 1985). В специально подобранных условиях (состав среды, присутствие АТР и Mg или ADP) основной путь выхода кальция в обмен на протон, нечувствительный к рутениевому красному, был уменьшен и удалось обнаружить Na -индуцированный выход Са из митохондрий печени, но он значительно слабее и составляет приблизительно 10% от уровня обмена Са + на протон в митохондриях сердца.
Метод получения внутренней мембраны митохондрий и межмембранных контактных участков
Фракцию, содержащую участки контактов между внутренней и наружной мембранами, получали из очищенных на градиенте сахарозы митохондрий, методом набухания (Ardail et al., 1990). Митохондрии инкубировали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.4 в течение 20 минут при 4С с последующим добавлением сахарозы до конечной концентрации 450 мМ. Затем центрифугировали при 10000 g, в течение 20 минут для отделения митопластов (осадок) от внешних мембран (супернатант). Внешние мембраны осаждали из супернатанта центрифугированием при 145000 g, в течение 15 минут. Митопласты подвергали набуханию в 1мМ фосфатном буфере в течение 20 мин при 4С и постоянном перемешивании с последующим добавлением концентрированной сахарозы до конечной ее концентрации 450 мМ и центрифугировали 60 минут при lOOOOOg. Образовавшийся осадок и осадок внешних мембран ресуспендировали и наносили на два отдельных линейных градиента сахарозы. Плотность растворов сахарозы изменялась от 1.29 г/мл до 1.06 г/мл. Далее центрифугировали в течение 20 часов при 27000 об/мин (ротор Spinco SW 27:2). Градиенты разделяли на фракции по 1 мл. Фракции характеризовали по активности маркерных ферментов, используя цитохром с оксидазу (ЕС 1.9.3.1.) в качестве маркера на внутренние мембраны митохондрий и моноаминоксидазу (ЕС 1.4.3.4.) -на внешние мембраны митохондрий (Wharton and Tzagoloff, 1967; Caman et al., 1965). Фракцию, содержащую контактные места, дополнительно очищали на градиенте сахарозы (50; 47.5; 45; 42.5; 40 %). После градиента сахарозы эта фракция распределялась на границе между 45% и 46.5% сахарозы.
Концентрацию белка суспензии митохондрий и митопластов определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Колориметрию растворов проводили на спектрофотометре Backman-35 при длине волны 750 нм. Для калибровочной кривой, в качестве стандарта, использовали бычий сывороточный альбумин (БСА).
Экстракцию липидов из мембраны митопластов проводили на холоду 66%-ным этиловым спиртом (-20С) из расчета 10 мл охлажденного этанола на фракцию митопластов содержащую 44 мг белка в 1 мл при 4С и постоянным перемешиванием в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали в течение 20 мин при 5500 g. Осадок реэкстрагйрЬвали таким1 же объемом 66% этанола с последующим центрифугированием. Полученные супернатанты объединяли и концентрировали под вакуумом на роторном испарителе при температуре не выше 30С до 1/10 исходного объема спиртового экстракта.
Для разделения гидрофобных и гидрофильных компонентов в спиртовом экстракте использовали модифицированный нами метод Фолча (Mironova et al., 1997). Для этого спиртовой экстракт полученный из 200 мг митопластов концентрировали под вакуумом до 1/10 исходного объема, затем разводили бидистиллированной водой до концентрации 40 мг белка/мл и к одной части полученного экстракта добавляли 10 частей смеси хлороформ - метанол (2:1). Разделение проводили в делительной воронке на холоду 4С в течение 3 часов. После разделения нижнюю, гидрофобную фазу упаривали досуха на роторном испарителе при температуре не более 30С.
В центрифужной пробирке митопласты разводили 1.3 мл бидистиллированной водой до концентрации 40 мг белка/мл и 17.6 мл смеси хлороформ - метанол в соотношении (2:1), затем гомогенизировали в течение 1-2 минут. Смесь выдерживали на холоду (4С) 20 минут, периодически встряхивая,
затем центрифугировали в течение 10 минут при 7000 g. Нижний хлороформенный слой упаривали под струей азота. При использовании предложенной модификации тратится меньше растворителей и экстрагируется больше Са +-связывающего компонента и жирных кислот.
Свободные жирные кислоты выделяли из митохондрий по модифицированной методике Блайя и Дайэра (Bligh and Dyer, 1959), которая представляет собой упрощенный вариант "классической" методики Фолча. В центрифужную пробирку содержащую плотный осадок 40 мг митохондрий, добавили 2.7 мл бидистиллированной воды, 10 мл смеси хлороформ - метанол в соотношении (1:2) и гомогенизировали в течение 1-2 минут. Далее к полученному гомогенату добавили 3.3 мл хлороформа и 3.3 мл воды последовательно гомогенизируя в течение 30 секунд. Смесь выдерживали на холоду (4С) в течение 20 минут, периодически встряхивая, а затем центрифугировали в течение 10 минут при 7000 g. В хлороформенном слое определяли количество свободных жирных кислот. Анализ проводили на автоматическом газовом хроматографе (Perkin Ermler), используя в качестве стандарта 30 мкг маргариновой кислоты (С17:0), которую добавляли на первом этапе экстракции.
Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента
Ион-транспортирующая активность изучалась путем измерения электрических характеристик бислойной липидной мембраны (БЛМ), модифицированной исследуемым соединением. Бислойные липидные мембраны формировали методом Мюллера (Mueller et al., 1964). Для этого использовали тефлоновую кювету, в которой две ячейки разделены перегородкой, имеющей отверстие площадью 0.9 х 10" см . Мембраны формировали из смеси 90% общих липидов мозга и 10% кардиолипина, растворенных в н-декане. Суммарная концентрация липидов в н-декане составляла 20 мг/мл. Наблюдение за формированием БЛМ вели в отраженном свете с помощью микроскопа МБС-1. Электропроводимость БЛМ определяли по величине тока в условиях фиксации потенциала на мембране. Проводимость мембраны в без катионной среде составляла 1 - 3 пСм. Ион - селективные свойства модифицированных мембран оценивали по потенциалу, возникающему при создании градиента ионов. Величина тока и потенциал измерялись с использованием операционного усилителя МАХ 406. Регистрация тока на выходе усилителя осуществлялась с помощью компьютера IBM PC/AT 486, соединенного с экспериментальной установкой через аналого-цифровой преобразователь. Опыты проводили при температуре 20С - 22С. Экспериментальная кювета содержала по 3 мл 20 мМ трис-HCl буфера, рН 7.4, как в одном (цис), так и в другом (транс) отсеке кюветы. Пересчет регистрируемого тока в проводимость осуществлялся по оригинальной программе, разработанной в лаборатории.
Изучение химической природы выделенного из митохондрий гидрофобного компонента проводили методами УФ-, ИК-, Н-ЯМР- спектроскопии и методом газожидкостной хроматографии.
При проведении УФ-спектроскопии использовали УФ-спектрометр Perkin-Ermler, исследуемое вещество растворяли в 1 мл хлороформа и снимали спектр в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Для ИК-спектроскопии применяли свежеперегнанные органические растворители и дегидратированный СаСЬ- ИК-спектры снимали на Фурье-преобразующем ИК-спектрофотометре Nicolet Magna OR-750. Твердые образцы отливали из хлороформеного раствора на поверхности кристаллов, которые были устойчивы к растворителям и прозрачны для ИК-из лучения. Для регистрации спектра низкомолекулярного гидрофобного Са -связывающего компонента и пальмитиновой кислоты использовали кристаллы бромида калия. Для пальмитата натрия применяли пластинки KRS-5 (Karl Zeiss, Jena). Спектры комплекса с Са получали, используя следующую смесь: одну часть 0.12М СаСЬ в метаноле и шесть частей 0.12 М пальмитиновой кислоты в хлороформе. Эту смесь наносили на поверхность кристалла бромида калия, высушивали, растворяли в хлороформе и снова высушивали, чтобы удалить остатки метанола.
Для Н+-ЯМР-спектрометрии использовали прибор Bruker АМХ-400, при этом препарат несколько раз упаривали досуха из хлороформа и растворяли в дейтерохлороформе.
Для анализа свободных жирных кислот методом газовой хроматографии липидные фракции метилировали, добавляя один объем 5% серной кислоты в метаноле с последующей инкубацией при 100С в течение трех часов. Реакцию останавливали добавлением трех объемов 5% К2СО3. Метиловые эфиры экстрагировали четырьмя объемами изооктана, а затем выпаривали досуха под током азота. Далее образцы снова растворяли в изооктане и вводили в капиллярную колонку SP 2380 (0.32 мм х 30 мм, Supelco). Анализ проводили на автоматическом газовом хроматографе, снабженном пламенным ионизационным детектором, соединенным с интегратором РЕ Nelson 1020. Термостат разогревали от 50 до 150С (32С/мин.), затем его температура выдерживалась при 150С в течение одной минуты и поднималась до 215С со скоростью 2С/мин. Температуру инъекции и детекции фиксировали при 220С и 250С соответственно. Для идентификации свободных жирных кислот использовали известные стандарты. Для коррекции процедурных потерь в образцах площади пиков нормализовали по площади внутреннего стандартного пика метилгептадеканоата (маргариновая кислота). Инъекцию каждого образца повторяли три раза. Результаты представляли в микрограммах свободных жирных кислот.
Определение содержания пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях.
Митохондрии (6 мг белка/мл) инкубировали 10 минут при 28 С в среде, содержащей 150 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 3 мМ КН2РО4, 10 мМ Трис-HCl рН 7.4. Этанольный экстракт митохондриальных проб фракционировали на колонке с аминопропилсиликагелем (Sep-PAK, Waters), фракции метилированных свободных жирных кислот определяли с помощью газовой хроматографии.
Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента
Изучение влияния основных физиологически значимых катионов на связывание кальция пальмитиновой кислотой показало, что добавление MgCb в концентрации 0.1-1 мМ приводит к ингибированию связывания кальция (рис. 19). 120 г
Подобные результаты были получены и в исследованиях со стеариновой кислотой. Поскольку используемые концентрации Mg являются физиологическими, ингибирующий эффект магния может иметь функциональную значимость в митохондриях. С другой стороны, основной катион цитозоля и матрикса К+, в концентрации 50-500 мМ не оказывает влияния на связывание Са + пальмитиновой или стеариновой жирными кислотами (данные не приведены).
Необходимо отметить, что способность кальция образовывать в мембране комплексы молекул имеющих координационные связи значительно выше, чем магния (Williams, 1975). Это объясняется тем, что магний способен связываться только с двумя центрами лиганда, поддерживая при этом правильную октаэдрическую структуру комплекса другие его связи заняты водой, тогда как ионы кальция при образовании комплексов с мембранными лигандами могут быть легко лишены гидратной оболочки и способны связывать 6-8 лигандов, образуя координационные комплексы (Williams, 1975). Структура координационного комплекса с кальцием не предусматривает какой-то определенной пространственной организации лигандов, и внутри координационной среды разрешены значительные колебания длины связей, в отличие от магния, с которым при образовании комплекса с лигандаом все связи должны быть одной длины (Williams, 1975). Известно, что соли кальция с липидами более гидрофобны, чем соли одновалентных катионов и магния (Renkonen, 1968; Shimojo and Ohno, 1966). Поэтому кальций, проявляя сродство к гидрофобной фазе, переходит из водной фазы в глубокие слои мембраны, тогда как магний прочно удерживает воду в своем комплексе и поэтому не способен погружаться в бислой. Повышенное сродство кальция к гидрофобной фазе было показано в работе Шиможо и Охно (Shimojo and Ohno, 1966), где кальций переходил в хлороформенный слой из водного в 2 раза больше, чем магний и в 30 раз больше, чем калий и натрий. Такой селективный переход в органический растворитель усиливается присутствием в растворе липидов (Shimojo and Ohno, 1966). Факт снижения Са -связывающей способности только в 4 раза в присутствии 10000 кратного избыта ионов Na+ (рис. 7), также объясняется различием в гидрофобности этих катионов. При хроматографии на кремниевой кислоте, целюлозе и тонкослойной хроматографии было показано, что комплексы с кальцием проявляли себя более гидрофобными, чем таковые с натрием (Renkonen, 1968). Прочность связывания катионов отрицательно заряженными поверхностями изменяется в ряду Са + Mg + Na+ К+. Таким образом, в связывании ионов металлов зависит от их концентрации, распределения между фазами и условиями конкуренции (избытка одного по сравнению с другим) (Williams, 1975). 3.11. Определение ион-транспортирующих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.
В нашей лаборатории проведена работа по изучению влияния пальмитиновой и стеариновой кислот на проницаемость бислойной липидной мембраны (БЛМ). В работе получены результаты показывающие, что помимо Са2+-связывающих свойств пальмитиновая и стеариновая кислоты обладают ион-транспортирующими свойствами при их встраивании в искусственные мембраны, сформированные из различных липидов. Было обнаружено, что добавление 0.5% (вес/весу) пальмитиновой или стеариновой кислот к смеси общих липидов мозга (90%) и кардиолипина (10%), используемой для формирования бислойной липидной мембраны, увеличивает ионную проводимость мембраны, только в присутствии СаСІг- Добавление в среду содержащей: 20мМ Трис-HCl, рН 8.5, омывающую БЛМ, ионов калия в отсутствии кальция не приводит к увеличению проводимости мембраны, модифицированной этими свободными жирными кислотами (Mironova et.al., 2001).
Для изучения Са2+-связывающих свойств различных индивидуальных липидов и их сравнения с теми же свойствами пальмитиновой и стеариновой жирными кислотами было проведено исследование на комерческих препаратах фирмы Sigma. Данные исследования этой серии экспериментов представлены в таблице 4. Результаты демонстрируют, что способностью связывать Са2+ с высоким сродством обладают, только длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая, арахиновая), в то время как ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды и лизофосфолипиды такой способности не имеют.
