Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Роль СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран 9
2.1.1. Разобщающее действие СЖК 9
2.1.2. СЖК как модуляторы перехода проницаемости в митохондриях 11
2.2, Влияние СЖК и Са2+ на состояние и свойства липидного бислоя 20
2.2.1. Фазовое поведение СЖК-липидных смесей 20
2.2.2. Влияние СЖК на проницаемость липидных мембран 21
2.2.3. Катиоп-индуцируемые изменения фазового состояния мембран, содержащих отрицательно-заряженные липиды 25
2.2.4. Изменения проницаемости мембран при фазово-переходных процессах в липидном бислое 28
3. Материалы и методы исследования 30
3.1. Изучение ион-транспортирующих свойств жирных кислот, реконструированных в БЛМ 30
3.2. Приготовление одноламеллярных липосом 31
3.3. Приготовление липосом, загруженных сульфородамином Б 32
3.4. Измерение выхода сульфородамина Б из одноламеллярных липосом 32
3.5. Измерение флуоресценции понил-акридинового оранжевого в липосомальных мембранах 34
3.6. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия липосом, меченых N-родамин-диацилфосфатидилэтаноламином 34
3.7. Выделение митохондрий из печени крыс 35
3.8. Экстракция, разделение и количественный анализ липидов из биологических объектов , 36
3.8.1. Экстракция липидов 36
3.8.2. Выделение фракции СЖК и ее количественный анализ 37
3.8.3. Определение содержания фосфора в фосфолипидных образцах 37
3.9. Расчет процентного содержания СЖК в митохопдриальных мембранах 38
4. Результаты и обсуждение 41
4.1. Ионы Са2+ вызывают неспецифическую пермеабилизацию мембран, содержащих насыщенные длишюцепочечные СЖК 41
4.1.1. Опыты на БЛМ 41
4.1.2. Опыты с липосомами 44
4.2. СЖК/Са2+-индуцируемая пермеабилизация мембран происходит в результате образования липидных пор 49
4.3. Механизм СЖК/Са2+-индуцируемого образования липидных пор ... 51
4.3.1. СЖК/Са2+ -индуцируемый выход сульфородамина из липосом не является следствием осмотических эффектов 51
4.3.2. СЖК/Са2+ -индуцируемая пермеабилизация мембраны сопряжена с фазовой сегрегацией комплексов Са2+ с СЖК 53
4.3.3. СЖК/Са2+ -индуцируемое образование липидных пор происходит по механизму хемотропного фазового перехода в липидном би слое 58
4.3.4. Механизм СЖК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран имеет «кинетическую» природу 60
4.4. Возможно ли образование липидных пор в митохопдриальнои мембране? 63
4.4.1. Состав митохондриальных липидов благоприятствует СЖК/Са2+-индуцируемому образованию липидных пор 63
4.4.2. СЖК/Са2+ -индуцируемая пермеабилизация митохондриальных и модельных мембран: аналогии и параллели 65
4.4.3. Как может работать механизм СЖК/Са -индуцируемой пермеабилизации митохопдриальнои мембраны 68
4.5. Возможная роль ПК/Са2+-индуцируемого МПП при патологиях 70
5. Заключение 74
5. Выводы 79
6. Приложение 80
7. Список литературы 87
- Катиоп-индуцируемые изменения фазового состояния мембран, содержащих отрицательно-заряженные липиды
- Измерение флуоресценции понил-акридинового оранжевого в липосомальных мембранах
- Механизм СЖК/Са2+-индуцируемого образования липидных пор
- Состав митохондриальных липидов благоприятствует СЖК/Са2+-индуцируемому образованию липидных пор
Введение к работе
Свободные жирные кислоты (СЖК), которые присутствуют во всех биологических мембранах, выполняют несколько важных функций в клетке. Они являются строительными блоками для синтеза липидов, субстратами окислительного энергетического метаболизма и, кроме того, влияют на проницаемость мембран (Дятловицкая, 1998). Способность СЖК модулировать проницаемость мембран давно привлекала внимание биоэнергетиков, и в течение уже более полувека ведутся работы по выяснению механизмов СЖК-индуцированного изменения мембранной проницаемости. Традиционно, основные усилия исследователей были направлены на изучение разобщающего действия СЖК (Pressman and Lardy, 1956; Dedukhova et al„ 1991; Skulachev, 1998a; Самарцев, 2000; Мохова и ХаЙлова, 2005), которое связано с их способностью переносить протоны через липидный бислой (Schonfeld and Bohnensack, 1997; Bodrova et al., 2000). Однако в последние годы все больше внимания стало уделяться проблеме неспецифического изменения проницаемости мембран, которое индуцируется связыванием Са2+ с анионами СЖК. Интерес к этой проблеме возрос после того, как в нашей лаборатории было обнаружено, что насыщенные длинноцепочечные СЖК (пальмитиновая (ПК) и стеариновая кислоты) связывают Са2+ со сродством, которое, по крайней мере, на порядок выше, чем сродство к этому иону других СЖК и липидов (Mironova et al., 2001). Было показано также, что процесс образования комплексов Са2+ с анионами ПК лежит, судя по всему, в основе одного из вариантов перехода проницаемости в митохонд-риальной мембране (Sultan and Sokolove, 2001; Agafonov et al., 2003; Mironova et al., 2004) - явления, которое, вероятно, играет важную роль в индукции запрограммированной гибели клетки (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000).
ПК/Са2+-индуцируемый митохондриальный переход проницаемости (МПП) был охарактеризован как отличающийся от ранее известных вариантов МТТП сравнительно недавно (Sultan and Sokolove, 2001). Были полу-
чеиы данные, свидетельствующие о его физиологической значимости (Mi-ronova et а]., 2004). Актуальность данной проблемы связана с тем, что ПК/Са -индуцируемый МПП может играть ключевую роль в ряде физиологических и патологических процессов, когда содержание ПК в тканях возрастает. Есть основания полагать, что ПК/Са2+-индуцируемый МПП ведет к апоптозу (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000; Mironova et al., 2004) - в отличие от ряда других вариантов МПП, ведущих к гибели клеток, в основном, по некротическому пути (Li et al., 2004).
Механизм ПК/Са2+-индуцируемого МПП пока неизвестен - в отличие от механизма циклоспорин-чувствительного классического МПП, при котором, как принято считать, происходит открытие некоего белкового ме-гаканала (Zoratti and Szabo, 1995; Halestrap et al., 1998; Halestrap et al., 2002; Zoratti et al., 2005). Существует множество модуляторов циклоспорин-чувствительного МПП, действие которых опосредовано мембранными ми-тохондриальньши белками. В то же время, каких-либо доказательств участия белков в ПК/Са2+-индуцируемом МПП до сих пор обнаружить не уда-лось. Напротив, есть все основания предполагать, что ПК/Са -индуцируемый МПП - это явление липидной природы, т.е. в основе него лежит процесс, протекающий в липидном бислое внутренней митохондри-альной мембраны (Mironova et al., 2004; Белослудцев и др., 2005).
Целью настоящей работы было изучение механизма Са -индуцируемой пермеабилизации модельных липидных мембран, содержащих насыщенные длинноцепочечиые СЖК, и оценка возможности реализации этого механизма во внутренней мембране митохондрий.
В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:
Исследовать, как влияет образование комплексов Са + с различными СЖК на ионную проводимость планарных бислойных липидных мембран (БЛМ);
Проверить, будет ли Са2+ менять проницаемость СЖК-содержащих мембран для более крупных (по сравнению с неорганическими ионами) молекул; исследовать возможность такой неспецифической пер-
меабилизации на модели одноламеллярных липосом, загруженных гидрофильным флуоресцентным красителем сульфородамином Б;
Изучить изменения в фазовом состоянии липидиого бислоя, которые могут быть индуцированы Са2+ в СЖК-содержащих липосомальных мембранах;
Проанализировать состав фракции СЖК митохондриальпои мембраны и сыворотки крови и выяснить, как меняется жирнокислотный состав в сыворотке крови пациентов, перенесших инфаркт миокарда. Научная новизна работы.
Изучен механизм ПК/Са2+- индуцируемой пермеабилизации искусственных мембран, для чего, в частности, был разработан новый метод детекции фазовой сепарации в липидном бислое, основанный на использовании флуоресцентного мембранного зонда нонил-акридинового оранжевого. Показано, что пермеабилизация мембран происходит за счет образования бы-строзатекающих липидных пор по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое.
Научно-практическое значение работы.
Полученные результаты развивают представления о механизмах пермсабилизации липидных мембран при изменении их фазового состояния и о возможности реализации подобного механизма в митохондриальпои мембране в норме и патологии. Они могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что СЖК и МПП вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений: апоптоза, ишемии и др.
2. Обзор литературы
Работа посвящена выяснению одного из механизмов пермеабилизацни мембран с участием СЖК и Саг+, поэтому в обзоре литературы будет рассмотрено два вопроса:
роль СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран;
влияние СЖК и Са24 на состояние и свойства липидиого бислоя;
Сначала будут рассмотрены вопросы о роли СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран; здесь речь пойдет, прежде всего, о биоэнергетических аспектах, т.е. о разобщающем действии СЖК на процессы энерготрансформации в сопрягающих мембранах. Также будут проанализированы вопросы об участии СЖК в Са2+-индуцируемом МПП1 и связанные с этим данные о проапоптотическом действии ПК. Затем будут рассмотрены вопросы о фазовом поведении СЖК-липидных смесей и влиянии СЖК на проницаемость мембран. В заключение будут описаны эффекты, которые оказывают двухвалентные катионы на фазовое состояние мембран, и связанные с этим изменения проницаемости липидного бислоя.
Катиоп-индуцируемые изменения фазового состояния мембран, содержащих отрицательно-заряженные липиды
Зависимость фазовых превращений от свойств полярной группы ли-пидов в бислое подразумевает возможность изменения этих свойств в результате электростатического взаимодействия полярных групп с ионами раствора. Тройбл и Эйбл (Trauble et al., 1974), на основании проведенного ими теоретического анализа, сделали вывод, что для сильно заряженного бислоя температура фазового перехода должна линейно снижаться с возрастанием поверхностного заряда, то есть со степенью ионизации. Проведенное авторами исследование липидного бислоя, сформированного из фосфатидной кислоты, показало, что, действительно, переход в бислое является функцией рН среды и концентрации одно- и двухвалентных ионов (Blume et al., 1979; Eibl et al., 1979). Было обнаружено, что повышение рН от 7 до 9 сопровождается снижением температуры фазового перехода на 20СС - в полном соответствии с теорией. В этой области рН небольшие изменения кислотности среды были достаточны для индукции фазового перехода при постоянной температуре. Двухвалентные катионы Са2+ и Mg2+ увеличивали температуру фазового перехода за счет нейтрализации зарядов на поверхности мембраны и, таким образом, способствовали фазовому переходу из жидкокристаллического состояния в гель. Как показал Портис с соавторами (Portis et al., 1979), добавление достаточного количества Са2+ (более 1 мМ) в систему фосфатидилсериновых везикул увеличивает температуру перехода более чем на 100С. Кроме того, Mg + и, в особенности, Са + вызывали повышение температуры фазового перехода фосфатидилг-лицерина (Van Dijck et al., 1975; Van Dijck et al., 1978), фосфатиднлеерина (Hauser et al., 1974; Cullis and Verkleij, 1979), фосфатидной кислоты (Van Dijck et al,, 1976; Curland, 1979). Одновалентные ионы K+, Na+, Li+ снижали температуру фазового перехода, то есть способствовали переходу бислоя в жидкое состояние при данной температуре (Trauble et ah, 1974). Ca повышает температуру главного фазового перехода липидов в результате электростатического взаимодействия с заряженной поверхностью мембраны. Экспериментально это явление изучено слабо из-за осложнений, связанных с появлением новых фазовых состояний и с фазовым разделением липидов в среде с Са2+ (Антонов и др., 1992; Jacobson and Рара-hadjopoulos, 1975). Из исследований модельных мембран, изготовленных из анионных липидов и их производных, известно, что в области малых кон її центраций Са (0.1 мМ и ниже) температура перехода растет очень быстро (Антонов и др., 1986; Антонов и др., 1992; Корепанова и др., 2000; Jacobson and Papahadjopoulos, 1975; Maggio and Sturtevant, 1987; Strehlow and Jahnig, 1981). В этих модельных системах поверхностная плотность отрицательных зарядов на порядок выше, чем в реальных биологических мембранах. В клетках в возбужденпом состоянии концентрация Са2+ может достигать в несколько раз более высоких значений (например, в синаптических окончаниях, куда Са2+ поступает из внешней среды через открытые каналы (Llinas et al., 1992; Heidelberger ct ah, 1994; Matthews, 1996). Таким образом, внут-риклеточный Са при определенных условиях способен индуцировать отвердевание липидного монослоя мембран.
Интересные данные были получены при изучении взаимодействия Са2+ с кардиолипином (Cullis et ah, 1979). С помощью разных методов было показано, что Са2+, при наличии в мембране кардиолипина, индуцирует переход ламеллярной фазы в гексагоналыгую. Особый интерес вызывает тот факт, что в смеси фосфолипидов ионы Са2+ вызывают разделение фаз. Это, в частности, было обнаружено при исследовании смеси фосфатидилсе-рин/фосфатидилхолин (Ito et ah, 1975). В этой работе, в которой фазовая сепарация определялась с помощью спиновой метки, под действием Са + наблюдался переход части фосфатидилсерина в гель, тогда как фосфатидил-холин при этом оставался в жидкокристаллическом состоянии.
В общем, можно ожидать, что Са будет индуцировать следующие типы фазово-переходных процессов в мембранах, содержащих СЖК. фазовую сепарацию СЖК в липидном бислое (Ito et al., 1975; Hoekstra, 1982; Garidel et al., 2000; Hauscr et al., 1979; Knoll et al., 1991; Tamura-Lis etal., 1986); образование небислойных липидных фаз; (Cullis et al., 1979; Borovyagin and Sabelnikov, 1989;Геннис, 1997); переход липидного бислоя из жидко-кристаллического в твердо-кристаллическое состояние (Антонов и др., 1992; Антонов и Шевченко, 1995; Антонов, 1998; Харакоз, 2001).
Рассматривая эти типы фазово-переходных процессов с точки зрения их возможной причастности к механизму СЖКУСа -индуцируемого МПП, можно сразу отметить, что, по моему мнению, данный механизм вряд ли будет связан с образованием каких-либо небислойных фаз. Как правило, подобные полиморфные переходы происходят, во-первых, довольно медленно и, во-вторых, при достаточно большой концентрации липида в системе. Что же касается возможной фазовой сепарации и перехода «жидкое-твердое», то и кинетика, и термодинамика этих процессов вполне соответствуют тому, чтобы рассматривать их в качестве возможной основы СЖК/Са -индуцируемого МПП. Следует также отметить, что митохондри-альная мембрана содержит мало холестерина (Daum, 1985), поэтому изменения ее фазового состояния будут более резкими (Антонов и др., 1992) - а значит, более драматическими будут и изменения ее свойств. И в первую очередь, должна меняться проницаемость мембраны: согласно данным литературы, и фазовая сепарация, и температурный фазовый переход, как правило, сопровождаются изменениями проницаемости липидного бислоя. Об этом пойдет речь в следующем разделе.
Измерение флуоресценции понил-акридинового оранжевого в липосомальных мембранах
ОЛ (диаметром 0.1 мкм), приготовленные из азолектина с 5% (моль/моль) N-родамин-диацилфосфатидилэтаноламином, были получены стандартным методом экструзии, как описано выше. Буфер содержал 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 50 мкМ ЭГТА и 40 мМ КС1. Число и размер флуоресцирующих частиц в суспензии липосом определяли с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии на конфокальном флуориметрс Confocor (Zeiss, Jena & Evotec). Для каждого образца, уравновешиваемого при комнатной температуре в течение 4 минут, число частиц, представленных в конфокальном объеме, и время их диффузии через этот объем определялись по усреднению 5-ти 20-секундных измерений. Корреляционная функция вычислялась с помощью специальной программы (FCS Access Fit), исходя из допущения об отсутствии в системе триплетов и в соответствии со следующей формулой: G(t) - автокорреляционная функция; t - время задержки; N- число частиц, присутствующих в конфокальном объеме; т - время диффузии, требуемое для прохождения флуоресцентных частиц через конфокальный объем Vconf = л-иЛ 03 (Schwille, 2001). Конфокальный объем, задаваемый высокосфокусированным световым лазером, определялся расстоянием от центра до границы конфокального объема в радиальном (г0) и осевом (Кг0) направлениях. Параметры К и г0 рассчитывались перед каждым экспериментом с использованием родамина 6G, коэффициент диффузии (D) которого составляет 2.8 10"10 rn s"1 (Madge et al., 1974). Параметр r0 оценивался с использованием уравнения гй = л/4 г (Dorn et al., 1998). Концентрация флуоресцирующих частиц вычислялась N согласно формуле: С = ——, где NA - число Авогадро. Митохондрии выделяли из печени половозрелых самцов белых крыс линии Wistar (вес животных 250-280 г).
Крыс забивали методом декапита-ции без наркоза. Митохондрии печени крыс выделяли стандартным методом дифференциального центрифугирования. После декапитации животного ткань печени быстро помещали в охлажденную до 0С среду выделения, содержащую 300 мМ сахарозы, 20 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 1 мМ ЭДТА и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с неплотно прилегающим пестиком. Соотношение ткани и среды выделения при гомогенизации составляло 1:8. Неразрушенные клетки и ядра осаждали при 500 g и 800 g (соответственно 4 и 6 миігут). Супернатант центрифугировали при 6000 g в течение 20 минут. Осадок митохондрий помещали в среду, содержащую 300 мМ сахарозу, 20 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 0.05 мМ ЭГТА в соотношении 1:8 и центрифугировали в течение 20 минут при 6000 g. Митохондриальный осадок мягко ресуспендировали с помощью стеклянного гомогенизатора с добавлением среды выделения, содержащей 300 мМ сахарозу, 20 мМ Трис-HCl (рН 7.4), из расчета 0.1 мл среды на 1 г печени. Выделение митохондрий проводили при температуре 4С. Во всех экспериментах количество митохондрий пересчитывали на количество белка. Концентрацию белка в суспензии митохондрий определяли методом Лоури (Lowry et ah, 1951). Спектрофотометрию растворов проводили на спектрофотометре «Beckmann-35» при длине волны 750 нм. Для построения калибровочной кривой в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин фирмы "Sigma". В работе анализировался липидпый состав митохондрий и сыворотки крови. Далее описываются методы получения этих объектов и методы экстракции и анализа липидов, которые в обоих случаях были одинаковыми. Липиды из митохондрий выделяли по модифицированной методике Блайя и Дайэра (Bligh et ah, 1959; Кейтс, 1975). В центрифужную пробирку помещали 1 мл митохондрий, разведенных водой до концентрации 50 мг/мл, и прибавляли 3.75 мл смеси хлороформ/метанол (1:2 по объему). Смесь выдерживали на холоду (4С) в течение 1-2 часов, периодически встряхивая, затем центрифугировали в течение 15 минут при 5500 g. Образовавшийся осадок растворяли в 4.75 мл смеси хлороформ/метанол/вода (1:2:0.8 по объему). Объединенные экстракты разбавляли 2,5 мл хлороформа и 2.5 мл воды. Хлороформный и водно-метанольный слои разделяли центрифугированием. Для полного удаления воды к хлороформенному слою добавляли равный объем бензола и упаривали досуха в токе аргона при 30С. Остаток сразу же растворяли в известном объеме свежеперегнан-ных хлороформа и метанола (2:1) и хранили при температуре -20С. Липи-ды использовались в течение 1-3 месяцев
Механизм СЖК/Са2+-индуцируемого образования липидных пор
Как уже говорилось выше, липидные поры могут возникать в результате действия различных факторов: осмотического шока, электрического пробоя, фазовых переходов в мембране. И первый вопрос, который возник при обсуждении возможного механизма СЖК/Са -индуцируемого образования липидных пор в мембране липосом, был вопрос о том, не являются ли наблюдаемые эффекты следствием осмотических повреждений мембран? Действительно, можно было предположить, что после добавления Са к ПК-содержащим липосомам их мембрана становится проницаемой не для сульфородамина, а для КО, который присутствовал во внешней среде . Поток КС1 внутрь липосом при этом повысит в них осмотическое давление, и именно этот осмотический эффект будет являться причиной последующей пермеабилизации липосом и выхода сульфородамина во внешнюю среду. Для того, чтобы проверить это предположение, мы провели две серии опытов: (1) посмотрели, не будет ли наблюдаться выхода сульфорода- мина из липосом после добавления К+-ионофора валиномицина, и (2) исследовали влияние внешнего осмотического давления (создаваемого саха-розой) на ПК/Са -индуцируемый эффект. Результаты этих опытов показаны на рис. 8 и рис. 9. Из рисунков следует, что валиномицин-индуцированный поток К+ внутрь липосом не приводит к выходу из них сульфородамина, а внешнее осмотическое давление, в свою очередь, не подавляет выход сульфородамина, индуцированный образованием комплексов Са2+ с ПК. Таким образом, было показано, что причина образования липидных пор не связана с изменением осмотического давления внутри липосом.
Второе предположение относительно механизма СЖК/Са индуцируемого образования липидных пор состояло в том, что липидные поры образуются при изменении фазового состояния липосомальных мем- бран. Представлялось вполне вероятным, что Са2+ будет вызывать разделение фаз в мембране СЖК-содержащих липосом: способность Са2+ индуцировать фазовую сепарацию в смесях, содержащих отрицательно заряженные липиды, была хорошо известна (Ito et al., 1975; Jacabson and Papahad-jopoulos, 1975; Антонов и др., 1992). Чтобы проверить, сопровождается ли ПК/Са2+ -индуцируемая пер-мсабилизация мембраны фазовой сепарацией в липидном бислое, была проведена серия экспериментов, в которых исследовали, как влияет про-цесс образования комплексов Са с ПК в мембране липосом на интенсивность флуоресценции мембранного зонда нонил-акридинового оранжевого.7 Как показали предварительные опыты (см. Приложение), интенсивность флуоресценции НАО в суспензии липосом определяется его концентрацией в липидной фазе: при увеличении концентрации НАО в мембране флуоресценция тушится. По изменению концентрационпо-зависимого ту- шения флуоресценции НАО можно судить об изменениях объема липидной фазы, в которой растворен НАО. Если после фазовой сепарации НАО вытесняется в одну из образующихся фаз, то его концентрация в этой фазе возрастет - по сравнению с исходной ситуацией (до разделения фаз). Соответственно, будет происходить тушение флуоресценции. Этот принцип был успешно применен для отслеживания фазовой сепарации в липидных смесях с использованием флуоресцентных липидных аналогов (Hoekstra, 1982; 1982а).
Состав митохондриальных липидов благоприятствует СЖК/Са2+-индуцируемому образованию липидных пор
Чтобы оценить возможность образования пор в липидном бислос ми-тохондриальной мембраны, мы провели сравнительный анализ эффекгив пости ПК/Са -индуцируемой пермеабилизации в модельных мембранах, сформированных из митохондриальных липидов и других липидных смесей.
Известно, что митохондриальные мембраны отличаются по липид-ному составу от других клеточных мембран (Broekemeier et al., 1991). В экспериментах на БЛМ было установлено, что, когда мембрану формировали не из общих липидов мозга (раздел 4.1.1., таблица 4), а из митохондриальных липидов (раздел 4.1.1., таблица 5), повышение проводимости наблюдалось при более низком содержании в мембране ПК или стеариновой кислоты, а также при более низкой концентрации Са2+ в среде. Аналогичная картина была обнаружена и в том случае, когда сравнивали ПК/Са2+-индуцированный выход сульфородамина из липосом, сформированных либо из митохоидриальных липидов, либо из азолектина (рис. 16). Анализ зависимости эффекта пермеабилизации от содержания ПК в мембране показал, что при насыщающей концентрации ПК пермеабилизация липосом из митохондриальных липидов примерно в два раза выше, чем пермеабилиза-ция азолектиновых липосом. Таким образом, можно сделать вывод о том, что состав митохондриальных липидов благоприятствует формированию липидных пор при связывании Са2+ с длинноцепочечными насыщенными СЖК в мембране,
Как упоминалось выше, в работах, выполненных в группах Соколове (Sultan and Sokolove, 2001а; Sultan and Sokolove, 2001b) и Мироновой (Mi-ronova et al., 2004; Белослудцев и др., 2005), уже была показана принципиальная возможность пермеабилизации митохондриальной мембраны при добавлении в суспензию митохондрий насыщенных длинноцепочечных СЖК и Са2+. Однако происходит ли пермеабилизация митохондриальной мембраны по тому же самому механизму, что и пермеабилизация модельных мембран в наших экспериментах, - этот вопрос требует более детального обсуждения. Далее я попытаюсь сопоставить наши данные с тем, что известно для ПК/Са2+-индуцируемого МПП в митохондриях.
Пермеабилизация как липосом, так и митохондриальной мембраны происходит примерно при одном и том же содержании СЖК в липидном бислое. Эксперименты на липосомах показали, что выход сульфородамипа наблюдается при содержании ПК от 15 мольных % и выше. Чтобы оценить, каково содержание СЖК в митохондриальной мембране, мы провели количественный анализ липидной фракции митохондриальной мембраны. Результаты этого анализа представлены в таблице 11. Согласно этим данным, основные СЖК в митохондриальной мембране - это ПК, стеариновая и олеиновая кислоты, и их процентное молярное содержание среди общих липидов составляет соответственно 6.61, 6.45 и 5.06 %. В экспериментах по индукции ПК/Са2+-зависимого МПП набухание митохондрий наблюдалось при добавлении в среду 30 нмоль ПК/мг белка (Белослудцев и др., 2005), что соответствует повышению содержания ПК в мембране примерно на 5 % (от общего содержания липидов). Таким образом, суммарное содержание основных длшшоцепочечных насыщенных СЖК (ПК и стеариновой кислоты), при котором индуцируется Са2+-зависимое набухание митохондрий, составляет примерно 17-18 мольных %. Следовательно, увеличение концентрации ПК в митохондриальной мембране (например, при активации фосфолипазы) менее чем в 2 раза приведет к возникновению липидных пор. Концентрация Са2+, при которой наблюдается полумаксимальный эффект на липосомах, составляет примерно 100 мкМ. Для индукции ПК/Са2+ -индуцируемого МПП к митохондриям добавляют гораздо меньше Са (порядка 30 мкМ), что, кстати, значительно меньше того количества Са , которое требуется для циклоспорин-чувствительного МПП (Sultan and Sokolove, 2001а; Sultan and Sokolove, 2001b; Белослудцев и др., 2005). Однако Са2+ накапливается в митохондриальном матриксе, и его связывание с СЖК происходит на матриксной поверхности внутренней митохондриаль-ной мембраны (Sultan and Sokolove, 2001а; Sultan and Sokolove, 2001b). Поэтому действующая концентрация Ca2+ в митохондриях, вероятно, существенно выше, чем концентрация Са2+ во внешней среде.
Как для липосом, так и для митохондрий величина эффекта зависит от соотношения СЖК и Са3+; оба агента могут быть лимитирующими факторами, Оба эффекта (пермеабилизация липосом и митохондрий) индуцируются лишь длинноцепочечными насыщенными СЖК, и это коррелирует со способностью этих СЖК связывать Са с высоким сродством (Mironova et al., 2001).
