Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы формирования длинноволновой спектральной настройки беспозвоночных ракообразных животных 9
1.1. Обзор литературы (световая фильтрация в глазах членистоногих беспозвоночных животных) 9
1.1.1. Световая фильтрация в оптических средах глаза 9
1.1.2. Световая фильтрация на уровне сетчатки 12
1.1.3. Пострецепторные фильтры 18
1.2. Экспериментальная часть 19
1.2.1. Исследование зрительных и экранирующих пигментовприбрежного краба Н. sanguineus 20
1.2.2. Исследование зрительных и экранирующих пигментов креветок
отряда Мизиды 24
Рисунки Гл 1 38
Глава 2. Исследование длинноволновых хлорид-содержащих зрительных пигментов позвоночных животных 50
2.1. Обзор литературы (хлоридные монохромные свойства зрительных пигментов длинноволновых колбочек позвоночных животных) 50
2.2. Экспериментальная часть. 54
2.2.1. Исследование фоторецепторов каспийского геккона Gimnodactilus caspius 54
2.2.2. Исследование фоторецепторов лягушки Rana temporaria 59
2.2.3. Исследование фоторецепторов золотой рыбки Carasius auratus 64
Рисунки к гл.2 74
Глава 3. Модуляция яркостной настройки зрительных клеток основными физико-химическими факторами среды окружения (кислородУ/внеклеточная ионная среда) 79
3.1. Обзор литературы (потенциал-зависимые проводимости палочек сетчатки, роль оксигенации в поддержании [К]0) 79
3.1.1. Потенциал-зависимые проводимости палочек сетчатки 79
3.1.2. Роль оксигенации в жизнедеятельности фоторецепторных клеток... 82
3.1.3. Светойндуцированные изменения внеклеточной концентрации калия 90
3.2. Экспериментальная часть 91
3.2.1. Анализ информативности суммарного фоторецепторного потенциала палочковой сетчатки белой крысы 93
3.2.2. Зависимость СПИ от изменения концентрации внеклеточного калия 104
3.2.3. Действие гипоксии и гипероксии на функциональную активность палочек сетчатки 104
3.2.4. Биохимическое исследование анаэробных систем ресинтеза АТФ в палочках сетчатки 112
Рисунки к гл.3 125
Глава 4. Исследование функциональной роли светофильтрующих свойств хрусталика человека и разработка искусственных хрусталиков - спектральных аналогов естественного хрусталика 130
4.1. Обзор литературы (повреждающее действие света и
фотопротекторные светофильтрующие свойства хрусталика глаза)..130
4.1.1. Сетчатка и пигментный эпителий - свет как разрущающий агент 131
4.1.2. Роль ретиналь-траспортных белков в норме и патологии 141
4.1.3. Естественные системы защиты структур глаза от фотоповреждения.. 143
4.2. Экспериментальная часть 147
4.2.1. Фотопротекторная роль естественных хрусталиков в защите сетчатки от светового повреждения 149
4.2.2. Техническая сторона разработки фотопротекторных искусственных хрусталиков с естественной спектральной характеристикой 150
4.2.3. Медико-биологические доклинические исследования 153.
4.2.4. Клинические исследования 159
Рисунки к гл.4 172
Глава 5. Исследование функциональной роли светофильтрующих структур человеческого глаза - хрусталика и желтого пятна в формировании разрешающей способности глаза и разработка на этой основе светофильтрующих очков для пациентов с ослабленным зрением 179
5.1. Обзор литературы (Теоретические основы спектральной коррекции зрения) 179
5.1.1. Световые повреждения глаз и современные требования к светозащитной оптике 180
5.1.2. Спектральные механизмы различительной способности глаза 182
5.1.3. Условия освещения 185
5.1.4. Виды светофильтров и наиболее распространенные зрительные задачи 188
5.2. Экспериментальная часть 195
5.2.1. Влияние желтых светофильтров на контрастную чувствительность при помутнении оптических сред глаза 195
5.2.2. Улучшение остроты зрения и контрастной чувствительности больных ретинальными дистрофиями сетчатки при использовании светофильтрующих очков с коротковолновым поглощением 198
5.2.3. Разработка и аппробация Пробного набора офтальмолога для спектральной коррекции зрения .201
Рисунки к гл.5 221
Заключение 225
Выводы 226
Список литературы 228
- Световая фильтрация на уровне сетчатки
- Исследование фоторецепторов каспийского геккона Gimnodactilus caspius
- Потенциал-зависимые проводимости палочек сетчатки
- Сетчатка и пигментный эпителий - свет как разрущающий агент
Введение к работе
Актуальность проблемы. В глазах живых организмов в процессе
эволюции сформировался целый ряд адаптационных механизмов к
различным световой среды обитания. Изучение этих механизмов
представляет естественно-научный интерес и имеет практическую
важность для понимания нормы и патологии процессов зрительного
восприятия. На молекулярно-квантовом уровне свет осуществляет
запуск процессов фототрансдукции в фоторецепторных клетках, но,
кроме этого, при определенных условиях свет может выступать и
фотоповреждающим агентом, являясь инициатором патологических
процессов в тканях глаза. В рамках классической оптики роль света в
зрении заключается в формировании качественного изображения на
сетчатке. В обоих случаях зрительные функции и поддержание их
жизнедеятельности зависят от спектрального распределения энергии
падающего света. Спектральные характеристики освещения
значительно отличаются в разных экологических нишах проживания.
Соответственно спектральному распределению освещения среды
обитания каждый вид живых организмов иашел свой путь
спектральной зрительной настройки (visual tuning). Механизмы
фоторецепторной настройки формируются различными зрительными
белками и свето фильтрующими пигментами, которые корректируют
спектральный состав света падающего на сетчатку. Наиболее
жизненно важной функцией глазных светофильтров является
избирательное ослабление света в фототоксическом коротковолновом
диапазоне. При этом замечательным является то, что наиболее
распространенные светофильтрующие вещества (каротиноиды,
меланины и оммохромы) одновременно являются
высокоэффективными ингибиторами фототоксических свободно-радикальных процессов. Второй очевидной функцией глазных светофильтров является оптимизация зрительного восприятия. Так, ослабление синего света приводит к повышению контраста и четкости изображения на сетчатке. У животных с цветовым зрением световая фильтрация способна повышать цветоразличительную способность. В целом, светофильтрующие пигменты формируют внутри глаза световую спектральную среду, необходимую для
5 нормальной работы глаза. Выход за пределы этой спектральной нормы сопровождается нарушениями зрительных функций. Так, у больных катарактой замена естественного светофильтрующего хрусталика на бесцветный искусственный хрусталик может приводить к фотоповреждению макулярной области сетчатки. При ретинальных дистрофиях естественные фотопротекторные механизмы глаза оказываются недостаточно эффективными и обычный повсдневный свет становится фотоповреждающим. Поэтому, сейчас одним из очевидных направлений профилактики дистрофий сетчатки является использование свето фильтрующих очков - усиленных аналогов хрусталика глаза. Помимо спектральной настройки зрительная система обладает яркостной настройкой к уровню освещения. При этом яркостная настройка может зависеть не только от светового раздражителя, но и от самых разных факторов. Наряду со светом, важным физическим фактором окружающей среды для органа зрения является кислород. С одной стороны, кислород необходим для биоэнергетики сетчатки в процессах окислительного фосфор штир ования, а с другой - кислород является составным звеном в патологических свободио-радикальных процессах, происходящих в глазу под действием коротковолнового света. Поэтому изучение зависимости фоторецепторной яркостной настройки от уровня оксигенации, также входит в круг рассматриваемых проблем.
В целом, выбранное направление исследований является постоянно востребованным как с научной, так и с практической стороны и непрерывно развивается по мере совершенствования экспериментальной техники и накопления знаний. Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в экспериментальной оценке конкретных физико-химических и биологических механизмов зрительной адаптации человека и животных к различным условиям световой среды обитания. Были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать механизмы длинноволновой фоторецепторной
настройки ракообразных беспозвоночных животных.
2. Исследовать роль анионов хлора в функциональных свойствах
длинноволновых зрительных клеток позвоночных животных.
3. Оценить степень участия кислорода в поддержании
функциональной жизнедеятельности зрительных клеток позвоночных
животных.
Провести экспериментальную оценинку фотопротекторной эффективности человеческого хрусталика.
Оценить роль глазных светофильтров в формировании разрешающей способности человеческого глаза.
6. Разработать свето фильтрующие оптические изделия
(искусственные хрусталики, свето фильтрующие очки) для
компенсации зрительных функций глазных пациентов.
Научная новизна работы.
Прямыми микроспектрофотометрическими измерениями были
определены спектры зрительных пигментов и экранирующих
субклеточных структур глаза ракообразных, позволившие выделить
основные звенья длинноволновой фотореценторной настройки.
Показано, что анион хлора является специфическим, необходимым
звеном в поддержании основных функциональных свойств
длинноволновых колбочек позвоночных - в формировании
длинноволнового положения спектра зрительного пигмента и в
обеспечении биоэлектрической активности этих клеток.
Установлено, что функциональная биоэлектрическая активность
палочек приспособлена к анаэробным условиям, и, что эти
фоторецепторные клетки обладают анаэробными системами
ресинтеза АТФ.
Показано, что яркостный потолок фоторецепторного потенциала
модулируется уровнем оксигенации сетчатки.
Экспериментально показано, что острота зрения и контрастная
чувствительность человеческого глаза имеют 30% вариации в
зависимости от степени пигментации хрусталика и желтого пятна
сетчатки.
Научно-практическая значимость работы.
В результате проведенных фундаментальных исследований в области биофизики зрительного восприятия были созданы теоретические основы спектральной коррекции зрения с помощью светофильтров, аналогичных хрусталику и желтому пятну
7 человеческого глаза. Эти положения изложены в монографии «Теоретические основы спектральной коррекции и ее возможные практические приложения» (П.П.. Зак, Т.С, Егорова, Ю,3. Розенблюм, М.А. Островский, 2005 г.). На этой теоретической основе были созданы и внедрены в офтальмологическую практику, совместно с МНТК Микрохирургии глаза им. С.Н. Федорова, фотопротекторные искусственные хрусталики «Спектр». За период 1985-2005 г.г. в СССР/России/СНГ было произведено и имплантировано более 1 миллиона этих хрусталиков. Данная разработка на протяжении 20 лет сдерживала импорт менее совершенных зарубежных хрусталиков. В последние годы, совместно с МЫИИ глазных болезней им. Гельмгольца, был создан и апробирован (1200 глазных пациентов, 16 видов глазных заболеваний) опытный «Набор спектральных фильтров» для пациентов с ослабленным зрением. Апробация "Набора" позволила выявить 4-х сорта спектральных светофильтров с разной степенью блокирования синего света, которые на 25% - 30% повышают остроту зрения и контрастную чувствительность. В настоящее время, на этой основе, подготовлена экспериментальная партия светоконтрастирующих полимерных очков для лиц с ослабленным зрением, которые получили положительную оценку основных офтальмологических клиник Российской Федерации. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на: 9th International Congress of Eye Research, 1990, Helsinki; 18-м Учредительном съезде Российского физиологического общества, 1993, Пущино; 11 International Biophysics Congress, 1993, Budapest; 6Lh European Regional Conference of Rehabilitation, 1994, Budapest; International conference Ophtalmometry and Ophtometry. 12-16 May 1997, Kazimerz Dolny, Poland; ХХХШ Internatiolal Congress of Phisiological Sciences, 1997, St.Petersburg; Всероссийском съезде физиологов, 1998, Ростов; The Conference of Optometry and Vision Science Academy "98", San-Francisco, USA; 5th IBRO World Congress of Neuroscience, 1999, Jerusalem; 2-м Съезде Биофизиков России, 1999, Москва; XXXV Nordic Congress of Ophthalmology, 2002, Tampere, Finland; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, 2004, Екатеринбург; Международных симпозиумах VISIONARIUM
8 (2004, 2005 г.г.), Hanko, Finland; Конференциях ARVO (2004, 2005 r.r,); 8-м Съезде офтальмологов России, 2005, Москва; Юбилейной конференции «Научные идеи академика Н.М. Эмануэля и современная наука», 2005, Москва-Черноголовка, Отдельные разделы работы трижды входили в годичные списки важнейших достижений АН СССР и РАН. Работа «Разработка, научное обоснование и внедрение в офтальмологическуго практику фотопротекторных искусственных хрусталиков с естественной спектральной характеристикой» отмечена премией Правительства РФ в области науки и техники за 2005 г..
Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации отражены в 46 научных публикациях. Практические разработки оформлены 5 отечественными и зарубежными патентами. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5-ти тематических глав (каждая с собственными разделами обзора литературы и методов), заключения и выводов. Текст диссертации изложен на 251 странице машинописного текста, иллюстрирован 22 таблицами и 35 рисунками. Библиография включает 387 наименований. Положения, выносимые на защиту.
Механизмы длинноволновой фоторецепторной настройки у беспозвоночных ракообразных животных.
Специфическая роль аниона хлора (хлорида) в поддержании функциональных свойств длинноволновых колбочек позвоночных животных.
Резистентность функциональной биоэлектрической активности фоторецепторов к предельным уровням оксигенации (от гипоксии с уровнем оксигенации в 30 раз ниже нормы до гипероксии с уровнем в 15 раз выше нормы).
Светофильтрующие структуры человеческого глаза - хрусталик и желтое пятно как значимые факторы в формировании разрешающей способности человеческого глаза.
Создание светофильтрующей офтальмооптики (искусственные хрусталики и очки для реабилитации зрительных функций).
Световая фильтрация на уровне сетчатки
Фоторецепторы беспозвоночных (рабдомы) животных обычно состоят из относительно длинных палочковидных микровилл и нескольких ретинулярных клеток. Они могут быть соединены в единую структуру (ракообразные, головоногие и насекомые, такие как пчелы, бабочки и стрекозы) или существовать как отдельные структуры (двукрылые насекомые и равноногие ракообразные Ligia). Благодаря световодным свойствам свет, попавший в рабдом, не выходит за его пределы. При этом происходит многократное внутреннее отражение от трубчатого оммохромного чехла окружающего рабдом. Таким образом, этот свет не попадает на соседние рабдомы, что способствует качеству изображения на сетчатке. Трубчатый чехол способен сдвигаться относительно рабдома в зависимости от уровня освещенности и регулировать количество света на сетчатке в пределах 5 лог.ед. (100 000 тыс.раз.). Оммохромные гранулы трубчатого чехла действуют как цветное зеркало, которое избирательно поглощает коротковолновый свет и отражает обратно в рабдом более длинноволновый свет меняя спектральную чувствительность рабдома. (Snyder et al., 1973; Snyder, 1975). При многократном отражении света внутри длинного и тонкого рабдома эффекты боковой фильтрации в формировании спектральной чувствительности могут быть весьма значимыми (Snyder et al., 1973, Snyder 1975).
Боковая филътрагщя. У целого ряда насекомых (Vogt et а/.,1982; Ribi,1978; Ribi 1979; Lall et а/.,1982,1987), и многих ракообразных (Legget.,1979; Stowe,1980; Lall & Cronin 1987) поблизости от рабдомов содержаться цветные пигменты, которые могут участвовать в формировании спектральной чувствительности фоторецепторов. У различных видов насекомых-светлячков цвета экранирующих пигментов различны (от желтого до красного) и соответствуют спектрам излучения светлячков своего вида. Желтый пигмент, судя по спектру поглощения, имеет каротиноидную природу, химическая природа красного пигмента остается неизвестной (Lai] et al., 1982, 1987). Раки-богомолы Mantis shrimp содержат большой набор цветных боковых фильтров, которые состоят из пигментов ретинулярных клеток и масляных капель желтой и красной окраски. Эти фильтры в сочетании с более, чем с 10 зрительными пигментами, образуют совершенную систему цветового зрения с высокой цветоразличительной способностью (Marshall 1988; Cronin and Marshall 1.989a&b; Marshall et al, 1991, Marshal, 1994). Зрительные клетки Mantis shrimp обладают еще одним механизмом световой фильтрации, позволяющим обострить спектральную чувствительность их фоторецепторов. Это достигается тем, что фоторецепторы Mantis shrimp слиты в «трубчатую» структуру, внутри которой разные длины волн селективно многократно отражаются и поглощаются разными зрительными пигментами. Аналогичная система обострения спектральной чувствительности за счет фильтрации света на зрительных пигментах соседнего рабдома известна для пчел и бабочек (Menzel, 1981). Их фоторецепторы прилегают друг к другу по всей длине и оптически сливаются. Рабдомы содержат зрительные пигменты разной спектральной чувствительности (у пчел, например, присутствуют ультрафиолетовый (340nm), голубой (440nm) и зеленый (540nm) рецепторы), которые служат латеральными светофильтрами по отношению друг к другу. Если бы рабдомы были отдельно расположены, то их спектральные чувствительности были бы слишком широкими (из-за само фильтрации), а при их слиянии (за счет фильтрации света соседними рабдомами «другого цвета») образуется три остро-настроенных цветовых канала с гораздо меньшим спектральным перекрытием. В целом, применение цветных экранирующих чехликов позволяет фоторецепторам иметь высокую чувствительность при сохранении спектральной специфичности в сочетании острой спектральной чувствительностью и хорошим цветоразличением (Snyder et ah, 1973).
Горизонтальные светофильтры. Горизонтальными светофильтрами обозначают светофильтры, расположенные поперек продольной оси рабдома и экранирующие фоторецепторную клетку на прямом оптическом пути. Такие светофильтры по мере наращивания толщины сужают или сдвигают спектральное распределение света, и соответственно, могут, как сузить диапазон спектральной чувствительности фоторецептора, так и сдвинуть его в коротковолновую либо длинноволновую часть спектра. В глазах беспозвоночных животных эти светофильтры чаще используются для подстройки к спектру освещения и для повышения контраста, нежели для создания системы цветового зрения.
Исследование фоторецепторов каспийского геккона Gimnodactilus caspius
На начальной стадии исследования нашей задачей было определить, являются ли хлоридные ионохромные свойства зрительного пигмента геккона его нативными свойствами в живой фоторецепторной мембране или же эти свойства являются экспериментальным артефактом дигитонинового экстракта. В микроспектрофотометрических экспериментах на одиночных зрительных клетках геккона мы убедились, что и в нативной фоторецепторной мембране живой клетки спектр зрительного пигмента геккона сдвигается в коротковолновую сторну при замене хлорида на другие анионы. Затем мы провели сравнительные исследования хлоридных зависимостей длинноволновых клеток разных классов позвоночных, чтобы убедится в том, что хлоридный механизм длинноволнов. И, наконец, в своих поздних исследованиях мы рассмотрели специфическую роль хлорида в поддержании нормальной функциональной активности длинноволновых колбочек
Исследование фоторепепторов каспийского геккона Gimnodactilus caspius. По результатам проведенных нами микроспектрофотометрических измерений сетчатка данной ящерицы содержит два вида зрительных клеток - коротковолновые клетки с пигментом Р452 и более длинноволновые с пигментом Р534. Во всех использованных ионных средах оба вида фоторецепторов сохраняли нормальную способность к обесцвечиванию, а также обладали способностью к фоторегенерации при коротковолновом освещении. Мы установили, что в растворах, где хлорид был заменен на другие анионы, спектр клеток Р534 сдвигался в коротковолновую сторону. В то же время, спектры коротковолновых клеток Р542 были устойчивы к действию бесхлоридных растворов. В клетках Р534 замена хлорида на цитрат или же сульфат приводила к небольшому - 5 нм, но достоверному коротковолновому сдвигу спектра поглощения. При замене хлорида на нитрат коротковолновый сдвиг спектра составлял около 25 нм (от исходных 535 нм до 510 нм). При этом, компонентный графический анализ показал, что спектр зрительной клетки в нитратной среде легко разложить на сумму спектров исходного С1-пигмента Р534 и новой спектральной формы с максимумом около 490 нм. Форму Р534 оказалось возможным селективно обесцвечивать длинноволновым светом так, что спектр поглощения зрительной клетки сдвигался к 500 нм, который, в свою очередь, мог быть обесцвечен светом с X 500 нм. Т.о., как графический анализ, так и селективное обесцвечивание показали, что нитратная форма пигмента имеет максимум в пределах 490-500 нм, и, т.о., разница спектров хлоридной и нитратной форм составляет около 35 нм. На Рис.2.1. показаны спектры длинноволновых зрительных клеток геккона в хлоридной и нитратной среде. При этом сравнительно небольшая примесь хлорида (10% от нормы) была достаточна, чтобы на 15 нм ослабить коротковолновый сдвиг, вызываемый нитратом.
Ниже приводится более подробное описание этого исследования. Методика. Работа проведена на изолированных сетчатках каспийского геккона Gymnodactilus caspius. Извлеченные из глаза темноадаптированные сетчатки инкубировали от 30 мин до 2 ч в физиологическом растворе, содержавшем (в мМ) NaCl - 140, КС1 - 2, MgSC 4 - 2, СаС12 - 1, глюкоза -5, сахароза - 20, Na-фосфатный буфер рН 7,3-7,5 - 10, а также в том же растворе с частичной или полной заменой СГ на один из анионов - SO4 , NCV , цитрат. После инкубации кусочки сетчатки мягко встряхивались в капле раствора того же состава на предметном стекле, затем препарат накрывался покровным стеклом и обмазывался по краям вазелином от высыхания. В таких препаратах находилось большое количество отделенных от фоторецепторов наружных сегментов (НС); на краю кусочка сетчатки были видны интактные клетки, которые также могли быть использованы для регистрации спектров поглощения. Поглощение одиночных наружных сегментов регистрировалось на микроцитофотометре МЦФ-1 производства ЛОМО, специально модифицированном нами применительно к задачам микроспектрофотометрии зрительных пигментов. Фотометрический луч был направлен перпендикулярно продольной оси сегмента и имел размеры 2x20 мкм, при диаметре НС 4-8 и длине 30-50 мкм. Луч был линейно поляризован в плоскости мембран дисков НС. Последовательные записи от одних и тех же сегментов не показывали значительного обесцвечивания зрительного пигмента фотометрическим лучом.
Монохромный эффект того или иного аниона оценивали по сопоставлению спектров поглощения НС в растворах с различными анионами со спектрами НС сетчаток в среде с нормальным (144 мМ) содержанием СУ. Серия измерений, проводимых для каждого аниона, включала от 9 до 56 спектров. Достоверность эффекта оценивалась по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение. В общей сложности были зарегистрированы спектры поглощения 159 НС. Из них 149 НС содержали пигмент Р534 и 10 - пигмент Р452. пигмент Р534 обладал ионохромными свойствами, а пигмент Р452 не проявлял их. Поэтому в дальнейшем описываются только спектры НС, содержащих Р534.
В нормальных ионных условиях спектры изолированных НС и НС целых фоторецепторных клеток имели стандартную форму, хорошо согласующуюся с соответствующей номограммой для Р534 (Рис.2.1., таблица 2.1.).
Потенциал-зависимые проводимости палочек сетчатки
Наиболее тщательный экспериментальный анализ потенциал-зависимой проводимости клеточной мембраны одиночных ВС палочек саламандры был сделан Бэйдером с соавторами (Bader е.а., 1982). Разделение мембранных токов проводилось с помощью набора специфических блокаторов в условиях фиксации напряжения на мембране. Авторами было описано 5 компонентов тока. При этом наиболее весомыми являются Na/K ток - блокируемый ионами цезия, калиевый ток - блокируемый ионами тетраэтиламмония и кальциевый ток - блокируемый ионами кобальта. Специфика этих потенциал зависимых проводимостей имеет следующий характер:
1) I "cs: - ток, блокируемый добавлением во внешнюю среду ионов цезия (5 мМ). Этот ток активировался гиперполяризацией от -30 мВ; его потенциал реверсии (-32 мВ) менялся с изменением концентраций как Na+, так и К+, следовательно, ток переносится ионами натрия и калия. (Потенциал реверсии находится между ENA и Ек, то есть Е "Cs" = ( Емл+Ек)/2, следовательно, можно предположить, что проницаемость цезий —блокируемых каналов для ионов натрия и калия одинакова, то естьРмд/Рк-1)- Этот ток медленно развивается во времени и достигает максимального значения через 400—600 мсек после ступенчатой фиксации потенциала фоторецепторной клетки (Bader e.al.,1982). По мнению большинства авторов, кинетика развития L Cs» дает возможность предположить, что именно этот ток в основном отвечает за спад от пика фоторецепторного ответа к последующему плато (т.н. "sag" при ответах на яркие вспышки света, и за уровень этого плато (Fain е.а.,1978).
2) Тк - калиевый ток, блокируемый добавлением во внешнюю среду тетраэтил аммония (ТЭА) в концентрации 30 мМ, Этот ток активировался деполяризацией от -70 мВ; его потенциал реверсии -72 мВ. Этот ток также медленно развивается и достигает своего максимального значения через 250-300 мсек после после ступенчатой фиксации потенциала фоторецепторной клетки (Bader е.а.,1982). Как было показано и в других работах, после блокирования этого тока палочка начинает генерировать потенциалы действия - т.н. кальциевые спайки. Предполагают, что в норме этот ТЭА-блокируемый калиевый ток предотвращает генерацию этих спаек (Fain е.а., 1977).
3)1»са" - кальциевый ток, блокируемый добавлением во внешнюю среду Со (3 мМ). Этот ток активируется деполяризацией от -45 мВ. Кальциевый ток достигает максимально возможного значения практически мгновенно.
4) 1к (Са) - калиевый Са -зависимый ток с потенциалом реверсии -72 мВ. Активируется увеличением внутриклеточной концентрации кальция. Блокируется этот ток внешним Со (3 мМ) и внутри клего чно вводимыми Cs И ЭГТА (Tiollotson, Нот, 1978). Своего максимального значения ток достигает спустя 400-500 мсек.
5) Ici (Са) - Сат2-активируемый анионный ток с потенциалом реверсии -17 мВ. На существование в мембране внутреннего сегмента палочки жабы хлорной проводимости указывалось в работе Каповилла с соавторами (Capovilla е.а.,1980). Кинетика развития этого тока сходна с кинетикой калиевого Са -зависимого тока. Блокируется экстраклеточным Со " (3 мМ ) и внутриклеточной инъекцией ЭГТА. Вольт-амперные характеристики этих токов представлены на Рис. 3.1.
Еще в начале 30-х годов XX века были получены результаты по изменению чувствительности зрительной системы в зависимости от парциального содержания кислорода в дыхательной смеси. В основном это были психофизиологические эксперименты на людях, чья профессиональная деятельность была которых связана с использованием для дыхания газовых смесей (летчики и подводники).
При уменьшении во вдыхаемом воздухе парциального давления кислорода (гипоксии) наблюдалось понижение световой чувствительности, нарушение адаптации к темноте, нарушение цве товосприятия. Напротив, увеличение содержания кислорода в воздухе (гипероксия), при нормальном атмосферном давлении, заметно повышало световую чувствительность зрительного анализатора. В начале 60-х годов XX века появился целый ряд публикаций о токсическом действии длительной (порядка суток) гипероксии на сетчатку позвоночных (Noell, 1962; 1963). Наиболее уязвимыми оказались фоторецепторные клетки. Позже появились работы, в которых было показано, что повышение парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе повышает чувствительность к фотоповреждению (Нага е.а.,1984; Ruffolo е.а., 1984; Капуста, Зак, Федоровичи др., 1987).
Сетчатка и пигментный эпителий - свет как разрущающий агент
Мы не могли использовать микроэлектродную технику регистрации активности одиночных клеток, так как препарат сетчатки располагался в барокамере, причем в условиях перфузии. Поэтому мы регистрировали т.н. аспартат-выделенный фоторецепторный потенциал (Sillman, Ito, Tomita, 1967), где асиартат используется для подавления постсинаптической активности нейронов. Такой метод позволяет выделять из суммарной электроретинограммы активность фоторецепторных клеток, сочетанную с медленным ответом глиальных клеток на изменение [К+]0. Согласно данным Быкова и соавт (Быков, Дмитриев, Скачков, 1981) активность глиальных клеток может быть подавлена Ва+; Поэтому для выделения суммарного фоторецепторного ответа из электроретинограммы мы добавляли в перфузируюнгую среду 20 мМ аспаратата и 1,5 мМ Ва+. Получаемые при такой перфузии фоторецепторные потенциалы имели характерную форму, известную по микроэлектродным отведениям. Регистрируемый нами потенциал отражал активность палочек Р500 поскольку в качестве объекта была использована чисто палочковая сетчатка белой крысы. Мы сочли необходимым и важным провести анализ природы использованного нами суммарного «аспартат-Ва выделенного» фоторецепторного потенциала. Во-первых, это было необходимо для ясной интерпретации результатов наших экспериментов, во-вторых, представлялось привлекательным создать методически простую модель фоторецепторного потенциала для использования в технически сложных экспериментах. В настоящем экспериментальном разделе описана наша методическая работа по анализу соответствия суммарного фоторецепторного потенциала палочковой сетчатки белой крысы (суммарный палочковый потенциал - СПП) известным ионным механизмам работы палочек (Baylor et al., 1986, Bader et al, 1982). Основой фоторецепторного потенциала является механизм фототран едущий (свет- родопсин- фотоактиеируемые внутриклеточные трансмиттеры — хемочувствителъная Na-проводимость наружного сегмента — изменение уровня электрического трансмембранного потенциала фоторег епторной клетки). Эти первичные фототоки изменяют уровень мембранного потенциала клетки, который в свою очередь управляет рабочим состоянием ионных потенциал-зависимых проводимостей (ПЗП) внутреннего сегмента фоторецептора. ПЗП определяют конечную форму палочковых фоторецепторных потенциалов и их яркостную зависимость (Baylor et al. 1982, Bader et al. 1982). По этим данным, в палочках сетчатки имеются натриевая (Cs-блокируемая), калиевая (TEA-блокируемая) и кальциевая (Со-блокируемая) ПЗП. Чтобы оценить вклад этих проводимостей в используемый нами СПП, мы сопоставили СПП в норме и при воздействии выше упомянутых известных ионных блокаторов (Cs , TEA \ Со +). Основной спецификой действия Cs+ было значительное увеличение амплитуды СПП в ответ на яркие вспышки, которое сопровождалось специфическим изменением формы СПП -частичным подавлением обратной реполяризации (т.н. Sag), возникающей вслед за пиком ответа. ТЕА+ обладал сходным, но менее выраженным действием. Для действия Со характерным являлось некоторое уменьшение амплитуды ответов на средние и слабые вспышки, в то время как ответы к ярким вспышкам практически не менялись. Эта специфика действия кобальта соответствует известным данным о том, что Co-блокируемая кальциевая проводимость не работает при трансмембранном потенциале свыше - 45 мв (Bader et al. 1982), и т.о. не может участвовать в формировании фоторецепторных ответов на яркие вспышки. Результаты действия блокаторов ионных токов на СПП приведены на Рис.3.2. Чтобы получить представление о возможной временной кинетике процессов, дезактивированных в СПП действием блокаторов, мы рассчитали математические разности между СПП в норме и СПП на фоне действия блокаторов. Как оказалось, форма полученных нами разностных потенциалов (Рис.3,ЗА) качественно совпала с формой соответствующих потенциал зависимых токов (Bader et al. 1982), возникающих при разных уровнях фиксации мембранного потенциала палочки через внутриклеточный токовый электрод (Рис.З.ЗБ). В целом, проведенный методический анализ показал, что Ва-аспартат-СПП в достаточной мере отражает основные ионные механизмы генерации биоэлектрической активности палочек. Наиболее мощной ПЗП, по нашим и по известным данным (Bader et al. 1982), оказалась натриевая С s+-6локируемая ПЗП, которая ограничивает ответы на яркие световые стимулы и определяет форму (Sag) переходного процесса между пиком ответа и последующим плато. В целом, проведенный анализ показал, что методически простой для регистрации СПП крысы является информативным способом оценки функциональной активности палочек сетчатки.
Ниже представлено подробное описание этого методического исследования. Методика. В экспериментах были использованы изолированные темноадаптированиые сетчатки белой крысы, перфузируемые с рецепторной стороны. Сетчатки препарировались при слабом красном свете после 2-х часовой темновой адаптации животных и далее адаптировались к темноте еще 30 мин в протоке раствора Рингера в специальной перфузионной камере. Использовались неполяризующиеся Рингер-хлорсеребряные электроды, погруженные в раствор по обе стороны сетчатки. Раствор Рингера для теплокровных имел следующий ионный состав: 100 мМ NaCl, 20 мМ
Na-аспартат, 5мМКСІ, 5MMNaHC03, 1,8мМСаС12, lMMMgCl2, 1,5 мМ ВаС12, 22 мМ глюкоза; рН раствора - 7,45-7,5; температура 20С. В качестве световых стимулов использовали вспышки от пороговых до насыщенных с шагом 0,5 логарифмических единицы. Интервал между вспышками ними составлял 1,25 мин. Препарат оставался жизнеспособным на протяжении многих часов перфузии. Регистрацию СПП проводили с усилением по постоянному току в полосе 0-30 Гц. Для блокирования известных потенциал-зависимых проводимостей (Bader et al. 1982) использовали: 15 мМ Cs - Na 7K проводимость, 30 мМ тетраэтиламмония (ТЭА) - калиевая проводимость, 3 мМ Со2+ - кальциевая проводимость и вторичные кальций-зависимые калиевая и хлорная проводимость. Добавление в перфузирующий раствор L-аспарагиновой кислоты в концентрации 20 мМ приводило к известному феномену выделения из ЭРГ суммарного «аспартат-выделенного» потенциала.
