Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1. Рецепторы лектинов поверхности плазматических мембран 7
2. Физико-химические состояния рецепторов митогенов в плазматических мембранах 9
3. Взаимодействие митогенов с компонентами плазматической мембраны 13
4. Распределение ионов кальция в лимфоцитах 15
5. Роль трансмембранного переноса ионов в активации лимфоцитов 17
6. Роль ионов кальция в образовании кэпов 26
7. Определение трансмембранного потенциала клеток с помощью флуоресцентных красителей 30
2. Материалы и методы 32
3. Полученные результаты и их обсуждение 39
1. Описание феномена образования кэпов рецепторов КонА-ШИТЦ 39
2. Температурная зависимость процесса перераспределения рецепторов 43
3. Влияние метаболических ингибиторов на образование кэпов 46
4. Влияние концентрации лектина на процесс образования кэпов 48
5. Ограничение подвижности рецепторов плазматической мембраны 51
6. Динамика митоген-рецепторных взаимодействий 55
7. Суммирование сигналов от разных рецепторов во времени 71
8. Особая роль клеток, рецепторы которых длительно не исчезают с клеточной поверхности в трансмембранной активации лимфоцитов 77
9. Количественные характеристики процесса взаимодействия рецепторов плазматической мембраны лимфоцитов меченным радиоактивным тритием КонА 84
10. Количественное определение связывания меченно го КонА 88
11. Влияние преинкубации клеток с митогенными кон центрациями КонА на последующие связывание ме ченного лектина обработанными клетками 94
12. Различия в зависимости эффекта стимуляции лимфоцитов от количества рецепторов, оккупированных с самого начала инкубации и от количества рецепторов, оставшихся связанными после взаимодействия с гаптенными углеводами 98
13. Биохимические параметры активации лимфоцитов. Роль ионов кальция в активации лимфоцитов 102
14. Трансмембранный потенциал лимфоцитов 129
Выводы 135
- Физико-химические состояния рецепторов митогенов в плазматических мембранах
- Роль ионов кальция в образовании кэпов
- Температурная зависимость процесса перераспределения рецепторов
- Количественное определение связывания меченно го КонА
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из наиболее актуальных проблем современной биологии являются исследования механизмов передачи сигнала от рецепторов плазматической мембраны в клетку. Наиболее удачной и хорошо изученной моделью для подобного рода исследований являются плазматические мембраны лимфоцитов. Рецепторы лимфоцитов способны при взаимодействии с лектинами перестраиваться и передавать ядру сигнал о клеточном делении.
Изучение этих процессов имеет не только теоретический интерес, так как позволяет понять механизмы трансмембранной передачи сигнала внутрь клетки, но имеет и практическое значение, поскольку ответ иммунной системы организма при взаимодействии с антигеном, моделью которого являются лектины, позволяет судить об иммунном состоянии данной клеточной популяции. Известно, что именно иммунная система участвует в развитии практически всех патологических процессов, в том числе и злокачественного роста. Клеточный иммунитет играет ведущую роль в процессе трансплантации тканей.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось изучение физико-химических механизмов взаимодействия некоторых лекти-нов (конканавалина А - КонА, фитогемагглютинина - ФГА) с рецепторами плазматической мембраны лимфоцитов. Выяснение этих механизмов может пролить свет на проблему передачи сигнала с поверхности плазматической мембраны к ядру. По состоянию иммунной системы можно судить о тех патологических процессах, которые происходят в организме. Расшифровка механизмов активации лимфоцитов лектинами позволяет создать диагностические модели для изучения иммунного статуса организма.
Основные задачи работы:
I. Исследование динамики взаимодействия лектинов с рецептора- ми плазматической мембраны лимфоцитов; определение скорости перераспределения рецепторов плазматической мембраны лимфоидных клеток, выделенных из различных тканей;
2. Изучение соотношения между сигналами активации от КонА и ШГА и выяснение возможности суммирования этих сигналов во времени;
Исследование роли клеток, рецепторы которых различаются по подвижности в суммарном процессе активации лимфоцитов;
Исследование роли кальция как посредника в активации лимфоцитов при взаимодействии рецепторов плазматической мембраны с лектинами;
Изучение изменений трансмембранного потенциала лимфоцитов при взаимодействии с конканавалином А; изучение влияния кальция на величину трансмембранного потенциала лимфоцитов.
Научная новизна. Впервые установлено, что процесс активации лимфоцитов представляет собой ряд циклически повторяющихся стадий связывания, взаимодействия лектинов с рецепторами с последующим исчезновением комплекса митоген-рецептор с поверхности плазматической мембраны.
Изучение влияния лектинов на лимфоциты в условиях, позволяющих определить взаимозаменяемость рецепторов КонА и ФГА, показало, что сигнал активации поддерживается свободными молекулами лектина в среде, которые связываются со вновь синтезируемыми рецепторами на мембране. Получены доказательства в пользу того, что комплексы молекул лектина и рецептора на значительной части популяции лимфоцитов длительное время не исчезают с клеточной поверхности в ходе реакции бластной трансформации, и именно они важны для развития митогенеза.
Следствием взаимодействия лектина с мембраной лимфоцитов является резкое увеличение проницаемости мембран для ионов кальция; существенное количество кальция связывается с клеточной поверх ностью, не проникая внутрь клетки» .'. -:
Практическое значение. Результаты исследований могут быть использованы для создания новых и модификации уже применяемых в клинической иммунологии тестов для оценки системы клеточного Иммунитета, а также для разработки методов усиления или подавления (трансплантация тканей) реакций клеточного иммунитета.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Основные положения диссертационной работы доложены на Объединенном пленуме Научных советов АН СССР и АМН СССР "Рецепторы лимфоцитов и клиническая иммунология", Москва, 1980 г., III Всесоюзном симпозиуме "Ранние проявления тканевой несовместимости",,Москва, 1979 г., на заседании Московского отделения Всесоюзного Биохимического общества, Москва, 1979 г.
Физико-химические состояния рецепторов митогенов в плазматических мембранах
Состояние белковых компонентов плазматической мембраны лимфоцитов характеризуется взаимодействием их с липидами бислоя, белок-липидными, белок-белковыми, а также, по-видимому, взаимодействиями со структурами цитоскелета. Известно, что мембрана представляет собой двумерный вязкий раствор, компоненты которого "плавают" в плоскости плазматической мембраны. Поэтому понятно, что подвижность компонентов биомембран, феномен который обнаружен сравнительно недавно, - это перемещение белковых и липидных компонентов в мембране и зависит от механических ограничений - вязкости мембраны и характера взаимодействия компонентов мембран с другими мембранными структурами. В современных моделях структуры мембран учитывается существование одновременно как гидрофобных, так и гидрофильных взаимодействий (Singer, 1972). Результатом этих взаимодействий является максимальное разделение в пространстве неполярных остатков жирных кислот, аминокислотных остатков мембранных белков и воды, тогда как ионные и полярные группы белков и липидов, углеводные остатки гликолипидов и гликопротеинов соприкасаются с водным окружением. Под подвижностью компонентов подразумевается изменение во времени положения пространственной организации белок-липидных компонентов, как бы вкрапленных в липидный матрикс мембраны, перемещение белков и липидов в плоскости мембраны, которые являются одновременно и подтверждением жидкостной структуры биологических мембран. Этот характер подвижности был доказан экспериментальным обнаружением латеральной подвижности молекулы родопсина, которая сопровождается быстрым вращением вокруг оси, перпендикулярной поверхности мембраны диска (Braun, Fujiwara, Pollard, Unanue, 1978). Применение цитоспектрофотометрии позволило зарегистрировать диффузию родопсина в латеральном направлении в пределах одного диска (Роо, Cone, 1974). В дальнейшем латеральная диффузия белок-липидных компонентов мембраны была продемонстрирована на целом ряде объектов. Состояние белковых компонентов плазматической мембраны во многом определяется жидкостностью липидов мембраны. Жидкостность липидного бислоя ПМ определяют в основном три основные фактора: температура, степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов, меаду соотношенйё молекулами холестерина и фосфолипидов.
Показано, что при физиологических условиях, постоянной температуре увеличение отношения холестерин-фосфолипид уменьшает жидкостность мембранных липидов ("ужесточает") ПМ. Особо следует отметить гетерогенность липидной фазы биологической мембраны. На основании экспериментальных данных установлено одновременное существование "твердой" и "жидкой" фазы липидов (Phillips et. ai.,1972; Kohler et. ai., 1972). Доказано существование изменений липидов мембран от жидкого состояния в твердое, и эти фазовые изменения описывают в терминах разделения фаз, а не фазовых переходов (Мс Connei, 1972). Таким образом, вследствие происходящего из-за гетерогенности липидов разделения фаз в мембране имеются участки как с твердой., так и с жидкой фазами липидов. Показано, что текучесть липидов имеет, по-видимому, важное значение и в механизмах трансмембранной передачи антигенных стимулов, поскольку жидкостность липидов ПМ увеличивается ПОСЛе ВЗаимОДеЙСТВИЯ С МИТОГенаМИ (Ferber and Resch, 1973), а по данным Инбара (inbar, 1976) при контролируемом увеличении текучести липидов нормальных лимфоцитов значительно увеличивается активация их митогенами растений. Подвижность компонентов поверхности лимфоцитов, особенно тех структурных компонентов, которые участвуют в механизмах распознавания и активации лимфоцитов - молекул иммуноглобулинов, ассоциированных, встроенных в ПМ, а также рецепторов митогенов особенно важно. Существует несколько уровней подвижности: I. движение всей клеточной поверхности (типа миграции макрофагов либо амебоидного движения лимфоцитов), 2. подвижность макромолекулярных комплексов-внутримембранных о частиц - ВМЧ, размер которых составляет приблизительно 100 А ; 3. подвижность отдельных белковых и липидных молекул, вклю чающая латеральную подвижность и фосфолипидный перескок - "флип- флоп", обозначающий перемещение молекулы фосфолипида с одной поло вины двойного липидного слоя на другую, вращение молекул белков и липидов вокруг оси, перпендикулярной плоскости, проходящей через середину двойного слоя липидов. К этому типу, видимо, следует отнести "микрораспределение" - "вертикальную" активность, экспонирование на поверхности ранее закрытых рецепторов (Ситковский М.В., Макаренко И.Г., Козлов Ю.П., 1977). 4. внутримолекулярное движение - конформационные перестройки белков, изгибы жирнокислотных цепей фосфолипидов, колебания фосфатных диполей полярных групп молекул фосфолипидов. Подвижности первых трех типов являются причиной изменений топографии поверхности ПМ и приведение пространственного расположения мембранно-связанных ферментативных комплексов в соответствие с уровнем функциональных нагрузок. Внутримолекулярное движение компонентов ПМ иногда имеет важное значение в межклеточных взаимодействиях, однако его следует рассматривать в другой временной шкале. Перераспределение на плазматической мембране рецепторов лек-тинов и антигенных детерминант характеризует такие физиологические процессы, как деление клеток, ее дифференциацию и трансформацию. Многие из молекул, идентифицированных на поверхности В- и Т-лимфоцитов могут перемещаться в плоскости ПМ после взаимодействия с соответствующими лигандами.
Перемещающиеся в ПМ комплексы лиганда и рецептора могут распределяться в плазматической мембране в виде кластеров, либо агглютинировать в одно место на одном из полюсов клетки с образованием "шапок", так называемых "кэпов". В дальнейшем мы будем пользоваться именно этим термином, как наиболее употребляемым в современной литературе. Общие выводы, которые можно сделать на основании изучения подвижности компонентов поверхности - это зависимость от температуры, поскольку образование "кэпов" - "кэпинг" - происходит при температуре 37С, НО НЄ ПРОИСХОДИТ ВООбще ПРИ 4С (Taylor et. al., 1971; Unanue et. al., 1972). Процесс неспецифической активации лимфоцитов лектинами растений - митогенез - служит удобной моделью для выяснения механизмов активации лимфоцитов на уровне рецепторных молекул плазматических мембран, которая выражается морфологическими изменениями клеток, увеличением синтеза белка, РНК, ДНК, изменением активности различных ферментов, ведущих к митозу и увеличению числа клеток, ставших чувствительными к этому стимулу (Фонталин, Певницкий, 1976; Rasmussen, Goodman, 1977; Lichtman et. al., 1983). Взаимодействие лектинов с плазматической мембраной также вовлекает в действие комплекс метаболических процессов, обуславливающих изменение иммунологической активности: пролиферацию, цитотоксическую активность, секрецию антител, лимфокинов и других биологических факторов (Varesioet.al,I980; Larsson et. al., 1982). Активация лимфоцитов вызывается различными митогенными стимулами растительной (ШГА, КонА, митоген лаконоса - PW П), бактериальной (стафилоккоковый Ь- токсин, эндотоксин, липополисахари-ды) природы и некоторыми другими (периодат натрия, ионофор A23I87 и т.п.). Известно, что для активации лимфоцитов помимо митогенного стимула необходимо участие ростового фактора, выделяемого Т-клет-ками для В-клеток и макрофагами для Т-клеток (Комиссаренко, 1981; Oppenheim, Rosenstreich, 1976; Varesio et. al., I980;Larsson et. al.,I982). Роль необходимости присутствия макрофагов оспаривалась разными авторами (Sundqvist, Wanger, 1980; Waksman, Wagshal, 1978). Одни указывали на то, что удаление макрофагов усиливает СТИМУЛЯЦИЮ ЛИМфОЦИТОВ (Waksman, Wagshal f 1978), ДРУГИЄ указывали на безразличность их влияния на действие лектинов.
Роль ионов кальция в образовании кэпов
Образование кэпов, как уже отмечалось, приводит к существенной реорганизации плазматической мембраны, перестройке элементов не с изменением концентрации Са ..внутри лимфоцитов, а с падением уровня АТШ. Тем не менее имеются данные о том, что образование кэпов, вызванное анти-иммуноглобулином на поверхности В-лимфоци-тов селезенки, сопровождается быстрым выходом из клеток кальция (Braun, 1979). Эти процессы объясняются изменениями цитоплазма- тической концентрации Са в ходе образования кэпов. Таким образом, почти не существует прямых доказательств того, что изменение или перераспределение концентрации внутриклеточного кальция является причиной образования кэпов, однако, существует предположение о возможной физиологической роли кальция в митоген-зависимом формировании КЭПОВ (Braun, 1980). С помощью quin- 2 было показано, что взаимодействие анти-им-муноглобулинов с плазматической мембраной лимфоцитов селезенки мышей происходит резкое увеличение концентрации кальция, которое Сохраняется В течение ДЛИТеЛЬНОГО времени (Pozzan et. al., 1982), причем увеличение концентрации внутриклеточного кальция предшествует образованию кэпов. Концентрация кальция при этом возрастает с 115 мМ до 470 мМ. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция, предшествующее образованию кэпов на лимфоцитах селезенки мышей, наблюдается как в кальциевой, так и в безкальциевой среде (в присутствии 200 мМ ЭГТА). Однако, если во внешней среде отсутствовал кальций, увеличение внутриклеточной концентрации цитоплазматичес-кого кальция было менее значительным (Pozzan et. al., 1982). Ионофор A23I87 в В-клетках вызывал значительное и быстропро-ходящее увеличение концентрации внутриклеточного кальция, и на фоне этого увеличения не наблюдался эффект анти-иммуноглобулинов. В этих экспериментах митохондриальные яды, FCCP и олигомицин не і вызывали сколь либо значительного увеличения концентрации внутриклеточного кальция. Это позволило авторам предположить, что увеличение концентрации внутриклеточного кальция происходит за счет высвобождения его из митохондрий.
Однако, блокировка митохондри-ального дыхания приводит к подавлению ответа на анти-иммуноглобу-линовый выброс кальция, при этом также подавляется процесс образования кэпов. гССР вызывает выход кальция из митохондрий, а олигомицин нет, но так как оба эти агента блокируют увеличение концентрации внутриклеточного кальция, вызываемого взаимодействием анти-иммуноглобулинов с плазматической мембраной, Поззан с сотр. предположили, что эффект увеличения концентрации внутриклеточного КаЛЬЦИЯ Требует НаЛИЧИЯ В КЛетке АТФ (Pozzan et. al., 1982). Образование кэпов на поверхности лимфоцитов селезенки происходит как в присутствии кальция, так и в отсутствии его во внешней среде. Высокая концентрация quin-2, связывающая внутриклеточный кальций, лишь незначительно блокировала образование кэпов. Преинкубация клеток с A23I87 до стимуляции также не влияла на образование кэпов, - эти причины позволили предположить, что" изменение внутриклеточной концентрации свободного кальция прямо не свя- " ЗаНО С Образованием КЭПОВ (Pozzan et. al., 1982). Суммировать результаты исследования взаимоотношения кальция с образованием кэпов можно следующей схемой: В связи с развитием клеточной биологии, изучением функционального состояния клеток, в частности иммунокомпетентных клеток, особенно важно исследовать интегральные характеристики этих клеток, изменяющихся в ходе физиологических и фармакологических воздействий. Одной из таких характеристик является трансмембранный потенциал лимфоцитов. Трансмембранный потенциал клеток определяет ее жизнеспособность и, вероятно, может участвовать в самых разных физиологических процессах, в том числе в активации лимфоцитов лек-тинами . Наиболее удобным для измерения изменений трансмембранного потенциала оказался 3,3 дипропилтиодикарбоцианин йодид (dis -с -(5) ). Изменение флуоресценции этого красителя в клеточной суспензии отражает процесс перераспределения красителя между клетками и внеклеточной средой, зависящее от клеточного потенциала - накопление его при гиперполяризации и выделение из клетки при деполяризации (Sims et. al., 1974). Вследствие того, что связанный с клетками краситель обладает значительно меньшим квантовым выходом флуоресценции, чем при нахождении в среде, по интенсивности его флуоресценции можно опосредованно судить об изменении трансмембранного потенциала. Степень гашения зависит от количества красителя, связанного с клетками. До гиперполяризации зонд связывается с 10-20% поверхности мембран, а после гиперполяризации - с 20-40%. Sims с сотр.(1974) предполагают, что краситель перераспределяется при изменении потенциала вследствие того, что краситель распределяется по интерфазе клеточной мембраны и только малая часть его аккумулирована во внутриклеточном пространстве. Несмотря на то, что dis -Cg - (5) оказывает некоторое влияние на дыхание митохондрий (Coffey et. ai., 1977) результаты, полученные с помощью красителя и изотопным методом хорошо согласуются друг с другом, что, на наш взгляд, подтверждает возможность использования этого зонда в определенном интервале концентраций, для работ по регистрации изменений трансмембранного потенциала лимфоцитов.
Температурная зависимость процесса перераспределения рецепторов
Процесс перераспределения рецепторов является следствием диффузии рецепторов в плоскости мембраны. Поскольку эта диффузия осуществляется в липидном матриксе, а состояние липидного матрик-са, его структура, в том числе переходы золь-гель из жидкокристаллической фазы в жидкостную резко зависят от температуры, представлялось интересным выяснить температурную зависимость процесса перераспределения рецепторов от времени. На рис.3 показана типичная зависимость процесса перераспределения рецепторов КонА от температуры инкубации клеток. Отложенная по оси абсцисс температура соответствует температуре второй инкубации. Первая инкубация - это инкубация клеток при 4С в течение I часа - характеризуется связыванием молекул меченного лектина клетками. При этом распределение рецепторов на клеточной поверхности было равномерным и диффузным. После отмывания клеток от избытка несвязавшегося лектина клетки продолжали инкубировать при других температурах (вторая инкубация). В этом случае клетки инкубировались тоже в течение I часа, после чего оценивали в поле люминесцентного микроскопа количество клеток с пэтчами, кластерами, кэпами. Как видно из рис.3, при температуре 4С инкубация клеток не проводит к перераспределению рецепторов, по-видимому, рецепторы "заморожены" в липидном матриксе мембраны и не способны перераспределяться из-за диффузных, механических ограничений. При повышении температуры до ЮС, резко увеличивается количество клеток с пэтчами и соответственно уменьшается количество клеток с диффузным распределением рецепторов. Резкий переход в количестве клеток с перераспределяющимися рецепторами наблюдается в области температур от ЮС до 15С, по-видимому, в этой области температур наиболее резко меняется жидкостность мембраны, возможно образуются так называемые жидкие каналы липидов, благодаря которым возможна быстрая диффузия рецепторов. Так, при температуре 15С количество рецепторов, образующих пэтчи, составляет 70%. Однако кэпов еще очень мало. При повышении температуры от 15С до 25С продолжается дальнейшее увеличение количества пэтчей, которое достигает практически 95-98%. При этой температуре увеличивается также и количество перераспределенных в кэпы рецепторов, т.е. состояние липид-ного матрикса при температуре 25С, а также и состояние метаболизма клетки делают возможным в некоторой степени процесс образования кэпов. При физиологической температуре подвижность клеточных рецепторов максимальна, уже нельзя вообще обнаружить диффузно окрашенные клетки т.е. клетки с неперераспределяющимися рецепторами, практически отсутствуют, имеются только клетки, рецепторы которых образуют пэтчи и кэпы. Количество кэпов среди клеток лимфоузлов крыс в наших экспериментах не превышало 25%.
Существенно отметить, что при температуре 42С процент клеток с кэпами практически не увеличивался, что говорит о том, что образование кэпов при температуре 37С достигает практически максимальной скорости. Общим явлением, по-видимому, для рецепторов КонА является то, что среди лимфоидных клеток практически невозможно найти популяцию, 100% клеток которой образовывали бы кэпы рецепторов КонА, их образует лишь часть всех клеток. Так на рис.2 изображена зависимость от времени процесса образования кэпов рецепторов КонА на лимфоцитах различного происхождения. Эти кривые зависимости характерны и отличаются от опыта к опыту амплитудой, но лишь незначительно. В наших экспериментах на неочищенных субпопуляциях клеток из лимфоидных органов мы не могли получить количества кэпов, превышающее 25%, причем эти количества кэпов были получены на клетках мышиных тимусов. Как видно из временной зависимости процесса образования кэпов (Рис.2), процесс довольно быстро достигает максимума и быстро набирает скорость в период времени от 20 до 30 минут. В дальнейшем увеличение количества кэпов не очень значительно и достигает плато практически через 50-70 минут. Поэтому в последующих экспериментах мы всегда использовали время инкубации с лектинами 60 минут при температуре 37С, т.е. время, необходимое для завершения процесса образования кэпов. 3. Влияние метаболических ингибиторов на образование кэпов КонА-ФИТЦ. Как видно из таблицы 2, образование кэпов рецепторов конка-навалина А практически полностью ингибируется при обработке клеток такими ингибиторами, как азид натрия, олигомицин. Характерно, что зависимость ингибирования образования кэпов от азида натрия характеризуется дозной зависимостью и наиболее низка при концентрации 0/Гмиллимоль, Динитрофенол также ингибирует процесс образования кэпов, однако в меньшей степени. Максимальное ингибиро-вание динитрофенолом достигает 65 - это означает, что лишь эта часть кэпов образуется за счет энергии не действительного фосфо-рилирования, а поставляемой другими энергетическими механизмами. Олигомицин ингибирует процесс образования кэпов на 100%, это говорит о том, что образование кэпов на 100% зависит от макроэргов, которые образуются в олигомицинчувствительных процессах. (Bona et. al., 1976, Chaplin, Wedner, 1978 ). В КОМПЛЄКСЄ С данными об отсутствии процесса перестройки рецепторов при тем- пературе 34С это свидетельствует о том, что образование кэпов - ЭТО МетабОЛИЧесКИ ЗаВИСИМЫЙ аКТИВНЫЙ Процесс. ( Chen, Коп, 1980).
Доказательством является то, что клетки, инкубированные до 37С и обработанные метаболическим ингибитором не образуют кэпов, а образуют кластеры и пэтчи, что является свидетельством того, что просто свободной подвижности рецепторов в мембране не достаточно для того, чтобы образовывались кэпы. В наших экспериментах значительно ингибировал процесс образования кэпов также йодацетамид. Колхицин в обычно используемой концентрации, известный антимитотическии агент, в ряде условий ингибирующии процесс образования кэпов КонА, в наших условиях рецепторы КонА не ингибировал, не влиял на образования кэпов этих рецепторов. Ингибиторы синтеза белка пуромицин и циклогексимид на процесс образования кэпов практически не влияли. Инкубация клеток в присутствии ЭГТА также не вызывала изменения процесса образования кэпов. Это свидетельствует о том, что в использованных экспериментальных условиях хелатирование ионов магния и кальция не влияет на процесс образования кэпов. Следует отметить, что хелаторы ЭГТА не влияли на процесс образования кэпов в условиях эквимолярных к содержанию ионов кальция и. магния. 4. Влияние концентрации лектина на процесс образования кэпов. Как видно из рисунка 4 при увеличении концентрации лектина количество клеток с кэпами уменьшается. Максимальное количество клеток, образующих кэпы, мы регистрировали в области митогенных концентраций - 5, 10, 20 микрограмм КонА в миллилитре раствора, причем максимум образования кэпов приходится на 10 мкг/мл. Как следует из рисунка 4 процесс образования кэпов тесно связан с количеством иммобилизованных рецепторов, т.е. с чисто поверхностным явлением оккупации клеточной поверхности лигандом. Итак, на основании полученных данных, суммированных в таблице 2 и на рис.3 можно прийти к выводу, что образование кэпов рецепторов КонА представляет собой активный зависимый от температуры процесс, индуцированный мультивалентным лигандом на клеточной поверхности, для которого нужна метаболическая активность и неважно наличие ВНеКЛетОЧНОГО КалЬЦИЯ ИЛИ МаГНИЯ. (Mikkelsen et. al., 1980; Pozzan et. ai.,I98I). Особо следует отметить необходимость мультивалентного связывания и роль иммобилизации дополнительного количества рецепторов в предотвращении процесса образования кэпов, так как при увеличении концентрации выше митогенных для лимфоузлов крыс наблюдается ингибирование процесса образования кэпов.
Количественное определение связывания меченно го КонА
После того, как были определены условия отмывания лимфоцитов гаптенными углеводами от связавшейся метки и условий оптимального определения количества специфически связанного КонА, мы предприняли попытку изучения связывания КонА с поверхностью лимфоцитов периферической крови человека и лимфоузлов крыс для того, чтобы выяснить максимальное количество центров связывания данной аффинности и константы ассоциации связывания рецепторов с лектином. Как следует из описанной нами теории взаимодействия лектинов с рецепторами, если связывание КонА с центром связывания на поверхности клетки соответствует условиям этого связывания, то уравнение Скетчерда должно выполняться. Согласно этому уравнению ь/и= пК - ьк, при условии, что все клетки и центры связывания КонА имеют одинаковые аффинности, точки отношения связанного КонА к несвязанному КонА (по ординате) и количества связанного КонА (по абсциссе) должны укладываться на прямую. На таблице №8 представлены результаты для построения кривых по Скетчерду. По данным этой таблицы построена кривая, представленная на рис.16. Первая, более крутая прямая, отсекает на оси абсцисс максимальное количество рецепторов данной аффинности. Согласно анализу, описанному в подписи к рисунку, количество высоко аффинных рецепторов составляет 7,1 млн молекул КонА на клетку. Константа ассоциа- ции этих рецепторов с КонА составляет 0,32 10 л/моль. Эти абсолютные значения константы и количества молекул КонА совпадают с данными, имеющимися в литературе. ( Edeiman, 1976). Другая, более пологая прямая, проходящая через экспериментально найденные точки, по-видимому, описывает свойства и количество низкоаффинных рецепторов. Этих рецепторов порядка 29,5 млн на клетку и они об- ладают аффинностью, отражающей константу ассоциации 0,062 10 л/моль, т.е. константа ассоциации высокоаффинных рецепторов почти в 5 раз выше, чем у низкоаффинных, а количество низкоаффинных рецепторов почти в 4 раза больше, чем количество высокоаффинных рецепторов.
Аналогичные данные о количестве и аффинности рецепторов получены для поверхности лимфоцитов периферической крови человека (табл.№9, рис.17). Как видно из этих данных принципиальных различий в распределении рецепторов нет. При сравнении результатов определения количества рецепторов и их аффинности в лимфоцитах лимфоузлов крыс и периферической крови человека можно заметить, что если кривые по Скетчерду одинаковы, т.е. выявляют два типа рецепторов - высокоаффинных и низкоаффинных, приблизительно с равным соотношением констант ассоциации друг к другу, то существует значительное различие в абсолютных значениях, причем константы аффинности несколько выше для лимфоцитов лимфоузлов крыс, а максимальное количество высокоаффинных рецепторов почти более, чем в два раза больше для лимфоцитов периферической крови человека. Количество низкоаффинных рецепторов также почти в два раза больше для лимфоцитов человека. Объяснением может быть то, что лимфоидные клетки лимфоузлов находятся в ткани, а лимфоциты периферической крови циркулируют; возможно, что циркулирующие клетки гораздо больше нуждаются в большем количестве гликопротеинов на поверхности для процессов узнавания, чем клетки нециркулирующие. В наших экспериментах по определению связывания, описанных в рис.16, 17, мы обнаружили гетерогенность к центру связывания, наличие высоко- и низкоаффинных центров. Гетерогенности не было обнаружено в работе Гетеля и Берза, которые изучали взаимодействие КонА с лимфоцитами крыс. Они показали лишь наличие однородных высокоаффинных центров связывания. Правда в их экспериментах использовались недостаточно высокие концентрации КонА. Влияние преинкубации клеток с митогенной концентрацией КонА на последующие связывание меченного лектина обработанными клетками Ранее полученные данные по эффекту "подстегивания" можно иллюстрировать после обработки результатов по Скетчерду. Одним из объяснений эффектов "подстегивания" является то, что связывание немеченного лектина вначале меняет количество и аффинность рецепторов для КонА, что и является причиной усиления эффекта действия митогена. Для того, чтобы выяснить влияние преинкубации с немеченным лектином на последующие связывание с оставшимися незанятыми компонентами плазматических мембран свободными молекулами лектина, мы провели следующие эксперименты, описанные в таблице № 10. Результаты представляли согласно требованиям Скетчердского анализа. Из этой таблицы видно, что увеличение концентрации меченного КонА в среде приводит к увеличению, количество немеченного, связанного с поверхностью КонА, не принималось во внимание, т.е. результаты этой таблицы имеют своей целью выяснить, как отличаются рецепторы поверхности лимфоцитов по связыванию меченного лектина после того, как они связали не-меченный лектин. Поэтому в графе "общее количество молекул меченного КонА в среде", а также "количество несвязанного КонА" подсчитаны исходя из отсутствия молекул КонА в среде, т.е. молекулы первоначально связавшиеся с поверхностью в расчет не принимались. Нас интересовало только то, как они повлияли на связывание меченного лектина. На основании табл.№10 построена кривая, отраженная в рис.18. наличие высокоаффинных и низкоафинных центров. Воспроизводимость в этих экспериментах была достаточно велика, использовали один и тот же набор меченного препарата, одних и тех же животных. В условиях достаточной воспроизводимости эксперимента некоторое уменьшение количества высокоаффинных рецепторов на клетке (максимальное количество высокоаффинных рецепторов составляет 5,2 млн молекул на клетку) может быть связано с экранированием тех рецепторов КонА, которые заняты после инкубации с 5 мкг/мл КонА, т.е. разница между максимальным количеством высокоаффинных рецепторов из данных рис.16 и 18 можно объяснить оккупацией части высокоаффинных рецепторов.
Константа ассоциации с КонА практически не меняется. Из анализа этого рисунка видно, что предварительная инкубация с лектином практически не влияет на максимальное количество центров связывания (учитывая то, что связалось немеченным лектином затем оказалось незанятым при связывании меченным лектином) и влияет на аффинность центров связывания. Поэтому эффект "подстегивания" нельзя объяснить тем, что изменяется количество рецепторов и их аффинность. Остается открытой возможность того, что количество и аффинность рецепторов не меняются, а меняются другие функции плазматических мембран, в частности, активных мембранносвязанных ферментов, с которыми тесно пространственно связаны рецепторы, оккупированные немеченным КонА, особо тем, которые занижают количество свободных, максимально связывающихся с высокой аффинностью рецепторов (рис.18). А если предположить, что мембранные ферменты, имеющие важное значение в активации лимфоцитов, модифицированы связавшимся КонА в начале инкубации с немеченным КонА, то это один из путей реализации механизма эффекта "подстегивания" ответа. Различие в зависимости эффекта стимуляции лимфоцитов от количества рецепторов, оккупированных с самого начала инкубации, и от количества рецепторов, оставшихся связанными после взаимодействия с гаптенными углеводами. В уже описанных данных (рис.II, 12) по изучению влияния гаптенных углеводов на количество оставшихся ассоциированными с поверхностью молекул КонА, мы обнаружили различную способность гаптенов снимать, предотвращать связанные молекулы КонА с поверхностью клеток и удалять уже связавшиеся молекулы КонА с плазматической мембраны лимфоцитов. Рассматривая действие митоге-на в двух различных по условиям процессах взаимодействия КонА с плазматической мембраной, мы можем предположить, что взаимодействие КонА и рецепторов плазматической мембраны, которое осуществляется без действия гаптенных углеводов в самого начала инкубации, отличается от взаимодействия КонА с рецепторами, на которых лектин остался после удаления менее тесносвязанных молекул лектина с помощью гаптенов.
