Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных данных 10
1.1 Нуклеиновые кислоты, их структура, функции, значение 10
1.2. Кофеин, его биологическое действие и физические свойства 21
1.2.1. «Прямые» действия кофеина 22
1.2.2. «Побочные» действия кофеина 26
1.2.3. Взаимодействие кофеина с нуклеиновыми кислотами 27
1.2.4. Самоассоциаиии молекул кофеина 28
1.2.5. Гетероассоциации кофеина с другими молекулами 30
1.3. Взаимодействие ДНК с биологически активными соединениями 35
Заключение 50
ГЛАВА 2. Методика расчетов и геометрия молекул 51
2.1. Метод молекулярной механики 51
2.2. Описание модельной системы. Геометрия кофеина и фрагментов ПК 55
2.4. Описание компьютерных программ 60
Глава 3. Уточнение параметров потенциальных функций и расчет минимумов энергии взаимодействия оснований 66
3.1. Уточнение параметров потенциальных функций 66
3.2. Расчет минимумов энергии взаимодействия оснований 71
3.2.1. Пары оснований с двумя N-H...N и (или) N-H...0 водородными связями 71
3.2.2. Минимумы энергии, отвечающие парам оснований с одной N-H...N или N-H...0 и одной слабой С-Н...0 илиС-H...N водородными связями 76
3.2.3. Стэкинг оснований. Минимумы энергии, отвечающие почти параллельному расположению
молекул 77
3.2.4. Минимумы энергии, отвечающие существенно не плоскому расположению оснований 80
Заключение 83
ГЛАВА 4. Взаимодействия кофеина с фрагментами нуклеиновых кислот 84
4.1. Самоассоциаиии молекул кофеина 84
4.2. Взаимодействие кофеина с основаниями нуклеиновых кислот 91
4.2.1. Стэкинг кофеин-основание 91
4.2.2. Плоские ассоциаты кофеина с основаниями 93
4.2.3. Минимумы, соответствующие почти перпендикулярному положению плоскостей кофеина и основания 95
4.2.4. Связывание кофеина с основаниями через атомы, не участвующие в формировании комплементарных пар 96
4.3. Взаимодействия кофеина с комплементарными парами. Возможные схемы связывания кофеина с ДНК в гликозидном и негликозидном желобах двойной спирали 99
4.4. Взаимодействие кофенна с фрагментами двойной спирали ДНК /02
4.4.1. Минимумы энергии взаимодействия, отвечающие образованию водородных связей кофеина с атомными группами широкого желоба 102
4.4.2. Минимумы энергии взаимодействия, отвечающие образованию водородных связей кофеина с атомными группами узкого желоба 106
Заключение 109
Выводы 111
Список использованной литературы
- Кофеин, его биологическое действие и физические свойства
- Описание модельной системы. Геометрия кофеина и фрагментов ПК
- Пары оснований с двумя N-H...N и (или) N-H...0 водородными связями
- Минимумы, соответствующие почти перпендикулярному положению плоскостей кофеина и основания
Введение к работе
ДНК взаимодействует со многими веществами, например, лекарственными препаратами, канцерогенами, мутагенами, и изменения в ее структуре, возникающие при таких взаимодействиях, могут существенным образом сказываться на ее функционировании, оказывать влияние на клеточный метаболизм. Вместе с тем, исследования взаимодействий ДНК с низкомолекулярными соединениями способны объяснить особенности ее структуры и функций, а также помочь в направленном синтезе новых лекарственных препаратов.
Одним из веществ, способных связываться с ДНК и влиять на процессы, происходящие с участием нуклеиновых кислот, является кофеин. Интерес к нему возник прежде всего в связи с его широчайшим распространением: он присутствует в наиболее популярных напитках - кофе, чае, какао; он и родственные ему соединения входят в состав многих лекарств, причем не только тех, которые доступны при наличии рецепта, но и таких, которые находятся в свободной продаже, поскольку усиливают действие аспирина и других анальгетиков. По оценкам специалистов кофеин является наиболее употребляемым лекарством в мире. Это стимулятор центральной нервной системы, сердечной деятельности, он регулирует кровяное давление, повышает работоспособность и концентрацию внимания, снимает усталость. Результаты исследований говорят о том, что очень небольшое количество кофеина достаточно для того, чтобы сохранять повышенную концентрацию внимания на протяжении нескольких часов. Такие явные эффекты кофеина известны достаточно давно и хорошо изучены.
Однако известно, что кофеин влияет на внутриклеточные процессы, взаимодействуя с биополимерами и вызывая скрытые изменения, проявляющиеся не сразу, а по истечении достаточно долгого времени. Накопленные данные свидетельствуют о том, что кофеин защищает от некоторых видов рака [Piosik et ah, 2002], в разных условиях может являться
мутагеном [Kuhlmann et al, 1968], антимутагеном, ингибитором репарации ДИК [Selby and Sancar, 1990; Nehlig and Debry, 1994], а также влияет на взаимодействие ДНК с другими биологически активными веществами: снижает токсичность канцерогенных соединений и уменьшает эффективность некоторых лекарств. Полагают, что такая биологическая активность кофеина связана с его способностью взаимодействовать с ДНК. Его влияние на функционирование ДНК и, в частности, на взаимодействие ее с другими биологически активными веществами, объясняется [Larsen et al, 1996; Davies et al, 2001; Piosik et al, 2002] тем, что молекула кофеина способна, с одной стороны, образовывать комплексы с другими агентами: исследования комплексов ДНК-лиганд различными методами показывают снижение их концентрации в присутствии кофеина [Lyles and Cameron, 2002; Johnson et al, 2003]. С другой стороны, кофеин может взаимодействовать непосредственно с ДНК, конкурируя с другими лигандами за места связывания [Traganos et al, 1991; Davies et al, 2001]. В первом случае говорят о действии кофеина в качестве интерцептора - «перехватчика» молекул лигандов [Traganos et al, 1991; Larsen et al, 1996], во втором -протектора ДНК [Davies et al, 2001].
Несмотря на то внимание, которое уделяется кофеину и его аналогам в исследовательских работах и обзорах, систематических исследований его взаимодействий с биомолекулами не существует, и молекулярные механизмы его действия изучены пока слабо.
Вместе с тем, теоретические расчеты дают возможность рассмотреть способы связывания молекулы кофеина с фрагментами нуклеиновых кислот, построить детальные молекулярные модели таких комплексов. Это, при сопоставлении с экспериментальными данными, может помочь объяснить механизмы влияния кофеина на процессы, протекающие внутри клетки с участием ДНК, понять пути его влияния на стабильность генома.
Методом исследования в данной работе выбран метод молекулярной
механики, наиболее быстрый и простой метод компьютерного моделирования, широко применяемый для построения структур биомолекул и изучения механизмов наиболее важных биологических процессов. С его помощью можно получить значения потенциальной энергии связывания, минимумы которой соответствуют устойчивым взаимным положениям молекул. Эти значения сравниваются со значениями энтальпии, полученными экспериментальным путем. При хорошем соответствии результатов расчетов экспериментальным данным на модельных системах метод можно использовать для изучения подобных систем, для которых экспериментальных данных нет.
Таким образом, целью работы являлось изучение взаимодействия кофеина с нуклеиновыми кислотами и построение атомно-молекулярных моделей его комплексов с компонентами и фрагментами нуклеиновых кислот для понимания молекулярных механизмов действия кофеина на функционирование ДНК.
Среди задач, возникших и решенных в процессе работы, можно выделить следующие:
уточнение параметров атом-атомных потенциальных функций для расчетов энергии взаимодействия между азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и оснований с родственными соединениями.
расчет энергии взаимодействия кофеина с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и поиск низкоэнергетических комплексов основание - кофеин с использованием метода молекулярной механики.
построение пространственных моделей возможных комплексов кофеина с фрагментами двойной спирали ДНК на основе расчета потенциальной энергии взаимодействия и поиска ее минимумов.
В работе были уточнены по новым экспериментальным данным параметры потенциальных функций для расчетов энергии взаимодействия нуклеиновых кислот и их надмолекулярных комплексов. Использование этих
параметров при изучении взаимодействия оснований нуклеиновых кислот позволило, наряду с уже известными низкоэнергетическими структурами -стэкинг-комплексами и комплексам с положением молекул в одной плоскости,- впервые обнаружить новый тип минимумов энергии взаимодействия и предсказать возможность положения оснований в почти перпендикулярных плоскостях.
Известно, что в водных растворах кофеин образует стэкинг-ассоциаты - димеры и агрегаты более высокого порядка. На это указывает наличие химических сдвигов протонов в ЯМР-эксперименте [Falk et al, 1998; Davies et al, 2001]. Однако детальная геометрия димеров - не вполне ясна. В работах [Thakkar et al, 1970; Thakkar et al, 1971; Kikkert et al, 1973; Fritzsche et al, 1980; Kan et al, 1980; Yanuka et al, 1986] предложены различные структуры димеров. Возможность использования новых данных позволила нам провести собственные расчеты самоассоциации, найти минимумы энергии взаимодействия между молекулами кофеина, выявить пути переходов от одной низкоэнергетической структуры к другой и предположить какие структуры наиболее часто встречаются в водной среде.
В научной литературе нет работ, связанных с проведением систематических расчетов взаимодействия компонентов ДНК с кофеином и построением атомно-молекулярных моделей комплексов кофеин-ДНК. Поэтому наше исследование связывания фрагментов ДНК с кофеином началось с изучения возможных взаимных положений при взаимодействии азотистых оснований с кофеином.
Для каждого из оснований и комплементарных пар получены низкоэнергетические структуры всех трех типов, соответствующие стэкинг-комплексам, положению компонентов комплексов в одной плоскости и в перпендикулярных плоскостях.
Возможности встраивания кофеина в малый и большой желоба двойной спирали ДНК показаны на примере фрагмента дуплекса
d(GACATGTC). Низкоэнергетическая конформация этого дуплекса была найдена методом молекулярной механики с помощью программы CONAN [Nesterova et al, 1997] с использованием результатов исследования его методом ЯМР (двумерные спектры ЯЭО). По результатам расчетов построены атомно-молекулярные модели полученных комплексов.
Полученные результаты имеют значение для понимания действия кофеина на генетические процессы и объяснения его влияния на взаимодействие биологически активных веществ с ДНК. С помощью построенных атомно-молекулярных моделей комплексов кофеин-ДНК можно планировать эксперимент с тем, чтобы направленно получать данные, необходимые для более полного понимания механизма действия кофеина.
Результаты исследования самоассоциации молекул кофеина, проведенные в процессе работы, в сопоставлении с экспериментальными данными позволили развить и обобщить ранее изученные способы образования комплексов кофеина.
По теме диссертации опубликовано 7 статей [Poltev and Grokhlina, 2002; Полтев и др., 2002; Poltev et al, 2003; Грохлина и др., 2003; Poltev et al, 2004; Грохлина и др., 2005; Deriabina et al, 2006].
Результаты диссертационной работы докладывались на международных конференциях QUITEL-2002 (Монтевидео, Уругвай), ChiTEL-2003 (Маракеш, Марокко), QUITEL-2005 (о. Маргарита, Венесуэла), на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), а также на семинарах ИМПБ РАН и ИТЭБ РАН (секция молекулярной биофизики).
Диссертационная работа состоит из 4-х глав. В первой главе представлен обзор литературы, который включает разделы, посвященные нуклеиновым кислотам, их структуре и функциям, изучению влияния кофеина на организм, его взаимодействиям с биополимерами и взаимодействию нуклеиновых кислот с биологически активными соединениями. Во второй описывается метод исследования, обосновывается
выбор модельной системы, содержится описание атомной структуры соединений, а также алгоритмов и компьютерных программ, созданных для данного исследования. Третья глава посвящена описанию уточненных параметров потенциальных функций и обсуждению результатов расчетов энергии взаимодействия между основаниями. В четвертой главе изложены результаты изучения самоассоциатов кофеина и моделирования его взаимодействия с фрагментами нуклеиновых кислот. В ней описываются полученные структуры комплексов, представлены их атомные модели, на основе которых предлагаются возможные объяснения некоторых аспектов влияния кофеина на генетические процессы. Заключают работу выводы. Общий объем диссертации - 127 страниц, включая 21 таблицу, 32 рисунка и список цитируемой литературы, содержащий 191 источник.
На защиту выносятся:
1. Результаты уточнения атом-атомных потенциальных функций
для расчетов энергии взаимодействия оснований нуклеиновых кислот и оснований с родственными соединениями. С использованием уточненных параметров потенциальных функций найдены три типа энергетически выгодных комплексов оснований нуклеиновых кислот - с расположением молекул почти в одной плоскости, почти параллельным и перпендикулярным положением плоскостей молекул. Последний из типов структур - с расположением молекул в почти перпендикулярных плоскостях - получен впервые.
Результаты моделирования самоассоциаций кофеина, полученные при сопоставлении данных ЯМР-исследований водных растворов кофеина и результатов расчетов энергии взаимодействия двух его молекул.
Результаты расчетов и поиска низкоэнергетических комплексов каждого из оснований нуклеиновых кислот и кофеина, показавшие существование трех типов структур, каждый из которых может быть реализован в различных условиях при взаимодействиях кофеина с
компонентами ДНК. Структуры с образованием водородной связи между кофеином и атомами аминогрупп оснований, не участвующими в образовании комплементарных пар, возможны при взаимодействии кофеина с двойной спиралью ДНК.
Результаты поиска минимумов энергии взаимодействия молекулы кофеина с фрагментом ДІЖ, показавшие возможность комплексообразования кофеин - ДНК в обоих желобах двойной спирали.
Атомно-молекулярные модели возможных комплексов кофеина с фрагментом двойной спирали.
Кофеин, его биологическое действие и физические свойства
Под воздействием кофеина меняются ощущения и настроение людей [Brauer et al., 1994]. Он влияет на кровяное давление [Nurminen et al., 1999]. Являясь мягким стимулятором центральной нервной системы, кофеин используется для того, чтобы повысить умственную и физическую работоспособность, вернуть живость ума и справиться с испытываемой усталостью.
Как полагают, существенную роль в механизме действия кофеина играет его угнетающее действие на фосфодиэстеразу - фермент, разлагающий циклический аденозинмонофосфат (цикло-АМФ), что ведет к увеличению внутриклеточной концентрации цикло-АМФ [Horrigan et al., 2006]. Под влиянием цикло-АМФ усиливается процесс расщепления гликогена (гликогенолиз), стимулируются метаболические процессы в разных органах и тканях, в том числе в мышечной ткани и в центральной нервной системе.
Другие исследования указывают на то, что стимулирующее действие кофеина может быть связано с его конкурентным связыванием с аденозиновыми рецепторами [Holtzman et al, 1991; Nehlig et al, 1992; Dalligna et al, 2004;]. Как предполагается, этому способствует структурное сходство молекулы кофеина и аденина, входящего в состав аденозина -пуринового нуклеозида, являющегося эндогенным лигандом для аденозиновых рецепторов. Поскольку аденозин рассматривается как фактор, уменьшающий процессы возбуждения в мозге, замещение его кофеином приводит к стимулирующему эффекту. При резком прекращении применения кофеина аденозин занимает все доступные рецепторы, что может вызвать утомление, сонливость, депрессию. Использование кофеина как аденозинового антагониста может быть эффективно в лечении мигрени [Guieu et al, 1998; Ferrari et al, 2006]. Некоторые эффекты кофеина могут быть отнесены к его действию на серотониновые нейроны [Nehlig et al, 1992] Ранее предполагалось, что постоянное потребление кофеина лишь в незначительной степени влияет на здоровье человека, однако затем некоторые исследователи стали характеризовать его как препарат, вызывающий привыкание [Gilliland et al, 1984; Holtzman, 1990]. Имеющиеся данные о действии кофеина на молекулярном и клеточном уровне не исключают его из ряда препаратов, вызывающих привыкание, однако влияние кофеина отличается от действия наркотиков типа кокаина или амфетамина. Исследования показывают, что после длительного приема кофеина или вследствие резкого прекращения его употребления, у большинства людей возникают симптомы (например, возникновение мигреней и головной боли), схожие с прекращением приема наркотиков, что говорит о возникновении физической зависимости от препарата. Вероятно, это можно интерпретировать как возможность применения кофеина в качестве препарата, снимающего симптомы прекращения приема наркотиков, по крайней мере, для некоторых людей и при определенных обстоятельствах [Fredholm, 1999].
Отмечается также [Fredholm, 1999], что употребление кофеина не имеет столь опасных социальных последствий как употребление алкоголя, наркотиков и никотина, который, к тому же, загрязняет окружающую среду. В качестве антидепрессанта кофеин снижает суицидальные тенденции в обществе и, как стимулирующий препарат, уменьшает количество несчастных случаев на дороге и при напряженной работе [Nehlig et ah, 1992].
Кофеин действует на всех уровнях центральной нервной системы человека, в больших дозах вызывая брадикардию, сужение кровеносных сосудов, увеличение частоты дыхания. Одним из важных аспектов использования кофеина является его двухфазный эффект, причины которого пока слабо изучены. Малые дозы кофеина (менее 1 мг/кг) способствуют повышению работоспособности, а в дозах выше 50 мг/кг он действует как депрессант [Fredholm, 1999]. Пока слабо изучено и болеутоляющее действие кофеина. В целом же, исследования на модельных системах указывают на то, что постоянное потребление кофеина может стать причиной различных биохимических изменений в организме из-за вызываемых им отклонений в концентрациях различных состояний рецепторов [Shi etal., 1993].
Повсеместное использование кофеина, а также присутствие его в диетических продуктах, привлекло внимание к исследованиям его токсичности, в частности, относительно его воздействия на сердце, а также риска возникновения онкологических заболеваний [Curatolo and Robertson, 1983; Pozniak, 1985]. Предположения об увеличении риска таких заболеваний в связи с потреблением кофеина в значительной степени преувеличены [Fredholm, 1999].
Попытка экстраполировать большое количество данных экспериментов над животными на человека приведена на рис. 5. Замечается [Fredholm, 1999], что сравнение воздействия полученных доз кофеина на человека и животных является нетривиальной задачей, хотя бы потому, что потребление кофеина человек растягивает на день, а животные принимают одну, но сильную дозу. Используя фактор коррекции веса [Gilbert, 1976] с учетом разницы в продолжительности метаболизма у человека и грызунов, пришли к следующему соответствию: 10 мг/кг кофеина у крысы соответствует примерно 250 мг кофеина на 70 кг веса тела человека (около 3.5 мг/кг), т.е. около 2-3 чашек кофе. Итак, кофеин способен значительно блокировать действия аденозина на А2л (сильнее) и А] рецепторы даже при низких концентрациях, полученных от единственной чашки кофе.
Описание модельной системы. Геометрия кофеина и фрагментов ПК
Для исследования атомно-молекулярных механизмов влияния кофеина на функционирование ДНК использовались простые модельные системы, содержащие молекулу кофеина и фрагмент ДНК. Для такой системы, пользуясь потенциальными функциями, подобранными для расчетов нуклеиновых кислот, может быть рассчитана потенциальная энергия, минимумы которой практически соответствуют экспериментально определяемой величине энтальпии. Показано (см., например, [Kabelac, Hobza, 2001]), что для взаимодействия оснований ДНК относительные значения энергии и взаимные положения молекул в минимумах потенциальной и свободной энергии отличаются незначительно. С помощью расчетов потенциальной энергии могут быть не только найдены все низкоэнергетические состояния систем, но и детально исследована зависимость энергии от взаимного положения молекул. Результаты расчетов и построенные модели таких простых систем являются первым шагом к пониманию механизма влияния кофеина на генетические процессы.
В начальных расчетах использовалась геометрия кофеина, полученная на основе кристаллической структуры его моногидрата [Sutor, 1958]. Затем методом ab initio МР2/6-31 G(d,p) была получена [Poltev et ah, 2004] уточненная геометрия (рис. 12), которая и использовалась во всех последующих расчетах. Результаты, полученные с использованием уточненной геометрии, показали незначительное изменение энергии взаимодействия и положения молекул в энергетических минимумах по сравнению с результатами, полученными при использовании геометрии кристалла (ср. Poltev et al., 2003; Грохлина и др., 2003; Poltev et ah, 2004).
При расчетах молекула кофеина являлась жесткой структурой, за исключением метальных групп, которые могли свободно вращаться вокруг C-N - связей. Барьер вращения вокруг C-N - связи отсутствовал, что часто делается при конформационном анализе нуклеиновых кислот и соответствует экспериментальным данным.
Использовалась фиксированная геометрия оснований нуклеиновых кислот, соответствующая усредненным длинам связей и валентным углам в кристаллах мономеров нуклеиновых кислот. Расчеты взаимодействия оснований и взаимодействия кофеина с основаниями и комплементарными парами проводились для 9-метилпуринов и 1-метилпиримидинов, чтобы исключить образование атомными группами N9-H пуринов и NpH пиримидинов водородных связей, невозможных в нуклеиновых кислотах. Взаимное положение оснований в комплементарных парах соответствовало минимумам энергии.
При расчетах энергии взаимодействия кофеина с фрагментом двойной спирали ДНК была использована низкоэнергетическая конформация дуплекса d(GACATGTC), найденная методом молекулярной механики с помощью программы CONAN [Nesterova et al, 1997]. Конформация соответствует результатам исследования этого дуплекса методом ЯМР (двумерным спектрам ядерного эффекта Оверхаузера) [Poltev and Grokhlina, 2002].
Конформация имеет параметры, характерные для В-семейства конформаций ДНК (табл. 5). Здесь Н и г- параметры спирали: II - расстояние между соседними парами оснований, а г- угол поворота (twist) между ними; следующие параметры описывают значения отклонений плоскости пары оснований от плоскости, перпендикулярной оси спирали в двух направлениях: TL (tilt) и RL (roll) - углы описывают соответственно поворот вокруг большой и малой осей пары; далее - углы между основаниями в паре: TW (propeller twist) - поворот одного основания в паре относительно другого вокруг продольной оси и BL (buckle) - относительно малой оси. Приведены также параметры, описывающие конформацию сахарного кольца: фазы псевдовращения левого и правого сахара в паре нуклеотидов (Phase) и торсионные углы %, описывающие поворот сахара вокруг гликозидной связи, соответственно угол C2 -Ci -N9-C8 для пуринов и Сг -Сі -І -Сб - для пиримидинов.
Геометрия дуплекса (рис. 13) при расчетах взаимодействия с кофеином предполагалась фиксированной.
Принимая во внимание все вышесказанное относительно геометрии молекул, энергия системы в нашем случае может быть описана формулами 1 и 2. Для расчета электростатической составляющей энергии использовались значения суммарных зарядов на атомах, полученные с использованием методов Хюккеля (я-заряды) и Дель Ре (а-заряды) с параметрами Берто и Пульман [Berthod and Pullman, 1965]. Рассчитанный дипольный момент молекулы кофеина равен 3,4 Д, что соответствует определенной экспериментально и приведенной в [Осипов и др., 1971] величине.
Диэлектрическая проницаемость среды є учитывалась двумя способами: принималась равной 1, для моделирования взаимодействий отдельных молекул в вакууме, т.е. без учета влияния среды, и использовалась зависимость є от расстояния между атомами (є = г) для неявного представления растворителя при моделировании взаимодействий в среде.
Функция энергии системы кофеин - фрагмент НК зависела от переменных, число которых варьировалось в зависимости от вида фрагмента. Здесь шесть переменных всегда определяли взаимное положение фрагмента НК и молекулы кофеина, три соответствовали вращению атомов водорода метальных групп кофеина, остальные - вращению метальных групп оснований.
Пары оснований с двумя N-H...N и (или) N-H...0 водородными связями
Для каждого из попарных сочетаний оснований (кроме Cyt:Cyt ) были найдены несколько энергетически выгодных структур с почти планарным расположением молекул. Например, для пары Ade:Thy существует четыре минимума энергии, что соответствует результатам более ранних расчетов [Полтев и Шулюпина, 1984]. Взаимные положения оснований в этих минимумах показаны на рис. 19. Здесь уотсон-криковская пара (9-я в табл. 9) обладает не самой выгодной энергией, а глобальный минимум соответствует хугстиновской паре (8-я в табл. 9), образующейся, как и пара 11 - обратная хугстиновская - в кристаллах производных аденина и тимина. Для пары Gua:Cyt глобальный минимум соответствует уотсон-криковской паре с тремя водородными связями, а два других минимума имеют существенно меньшую глубину. Образование комплементраных пар при биосинтезе ДНК не является следствием их наибольшей энергетической выгодности по сравнению с другими парами, а связано с тем, что только эти две пары позволяют образовать из четырех нуклеотидов почти однородную двойную спираль с антипараллельными цепями. Вероятность включения в спираль других пар при биосинтезе зависит как от энергии взаимодействия в парах, так и от близости их геометрии к геометрии канонических пар. Некоторые детали полученных результатов для пар Ade:Thy и Thy:Thy можно сравнить с данными нейтронографических исследований [Frey et ai, 1973; Kvick et al, 1974] кристаллов 1-метилтимина и комплекса 1 метилтимин:9-метиладенин. Молекула 1-метилтимина имеет плоскость псевдосимметрии, проходящую через атомы N} и С6 перпендикулярно плоскости пиримидинового кольца. Вследствие этого все три пары Thy:Thy примерно одинаковы по размерам и форме, так же как и пары Ade.Thy 8 и 11. Поэтому все три пары Thy:Thy могут быть встроены в одну и ту же кристаллическую решетку 1-метилтимина, а пары 8 и 11 - комплекса 1-метилтимин:9-метиладенин. Кроме того, различия энергии между всеми парами Thy:Thy и между парами 8 и 11 невелики, т.е. можно ожидать, что такие пары будут сосуществовать в одном кристалле, что соответствует наблюдаемой ситуации[Тгеу et al., 1973; Kvick et al, 1974]. Пары, имеющие по результатам наших расчетов наибольшую по абсолютной величине энергию, составляют основную часть пар в кристаллах [Frey et al, 1973; Kvick et al, 1974]. Рассчитанные длины водородных связей совпадают с точностью до 0.015 А с соответствующими расстояниями в кристаллах. Отклонения водородных связей от линейности в кристаллах и в рассчитанных структурах также совпадают. Для каждой пары оснований существуют минимумы энергии взаимодействия, отвечающие расположению оснований в одной или почти в одной плоскости, когда образуется только одна «нормальная» и одна слабая водородная связь между группой С-Н и акцепторами водородной связи -атомами N или О. Эти пары могут рассматриваться как возможные промежуточные этапы при возникновении транзиций и трансверсий. Энергия здесь меньше по абсолютной величине, чем в минимумах с двумя N-H...N и (или) N-H...0 водородными связями, а геометрия пар может быть существенно ближе к геометрии уотсон-криковских пар по сравнению с парами, имеющими две водородных связи. На рис. 20 представлены некоторые из таких пар. Хотя в кристаллах мономеров и встречаются водородные связи С-Н...О и C-H...N, рассмотренные здесь минимумы редко соответствуют взаимным положениям оснований в кристаллах. Это связано с тем, что положение оснований в кристаллах определяется в первую очередь взаимодействиями оснований в парах с двумя водородными связями, а минимумы, рассматриваемые в этом разделе, менее глубокие
Минимумы, соответствующие почти перпендикулярному положению плоскостей кофеина и основания
Описанные выше результаты показывают, что при взаимодействии с основаниями нуклеиновых кислот кофеин образует энергетически выгодные комплексы трех типов. Однако один из них, соответствующий стэкингу гетероциклических колец, не может реализоваться во взаимодействиях с двойной спиралью, кроме случаев существенного нарушения взаимного расположения оснований в двойной спирали или взаимодействия с концевыми парами, которые мы здесь не рассматриваем.
В двух других типах структур - с расположением молекул практически в одной плоскости и в почти перпендикулярных плоскостях - образуется водородная связь между одним из акцепторов кофеина и одним из доноров оснований. Если в качестве доноров выступают те водороды аминогрупп оснований, которые не участвуют в уотсон-криковском спаривании, то такие комплексы оснований (или пар оснований) с кофеином возможны без изменения двуспиральной структуры ДНК и интересны с точки зрения исследования возможностей связывания кофеина с ДНК.
Расчеты энергии взаимодействия 9-метилпроизводных аденина и гуанина и 1-метилцитозина с кофеином показали, что в подобных комплексах могут участвовать каждый из атомов-акцепторов кофеина и водороды Н42 цитозина, Н62 аденина и Н22 гуанина, являющиеся донорами водородных связей. Для каждой комбинации акцептор-донор было найдено по несколько низкоэнергетических структур как с положением молекул колец в одной плоскости, так и во взаимно перпендикулярных плоскостях. Характеристики некоторых из таких минимумов приведены в табл. 17, а взаимные положения молекул - на рис.28.
Все три типа минимумов, рассмотренные выше, возможны и при взаимодействии кофеина с парами оснований, как комплементарными, так и неправильными. Не рассматривая подробно минимумы, соответствующие стэкинг-ассоциатам кофеина с парами оснований, отметим, что энергия самого глубокого минимума взаимодействия кофеина с парой Ade:Thy в вакууме равна-14 ккал/моль, угол между плоскостью кофеина и плоскостью пары оснований составляет около 4, а расстояние между плоскостями молекул - 3,4А. Значения энергии в стэкинг-положениях больше по абсолютной величине, чем в минимумах двух других типов, но реализация таких положений требовала бы интеркаляции кофеина в дуплекс, то есть заметных изменений в структуре спирали, приводящих к ослаблению взаимодействий между парами оснований. Такие изменения возможны при интеркаляции молекул, имеющих три или четыре сопряженных кольца, например, акридиновых красителей, антибиотиков дауномицина или актиномицина D, когда энергия взаимодействия ароматических молекул с парами оснований в два-три раза больше, чем при взаимодействии пар с кофеином.
Для понимания механизма действия кофеина на функционирование ДНК интересны плоские и перпендикулярные структуры с образованием водородных связей между кофеином и теми водородами оснований, которые не участвуют в комплементарном связывании.
В этом случае пара AderThy имеет лишь один водород Н62 аденина, способный образовать водородную связь с кофеином, и наиболее глубокий минимум здесь имеет энергию -10,6 ккал/моль и соответствует почти перпендикулярному положению этой пары относительно кофеина с образованием водородной связи N9...H62-N6. Пара Gua:Cyt имеет два таких водорода - Н42 цитозина и Н22 гуанина.
Образование комплексов через формирование водородных связей с Н42 цитозина, как и с Н62 аденина, соответствует расположению кофеина в большом желобе дуплекса, а с Н22 гуанина - в малом желобе. Структуры с положением кофеина в широком желобе возможны для многих конформации ДНК и нуклеотидных последовательностей, тогда как связывание с гуанином в гликозидном желобе в большей степени зависит от конформации ДНК и последовательности нуклеотидов.
Характеристики структур в наиболее глубоких минимумах энергии взаимодействия пары Gua:Cyt с кофеином приведены в табл. 18, а конформации таких комплексов представлены на рис. 29.
1 Кофеин может выступать как конкурент за места связывания с ДНК и таким образом влиять на взаимодействие с ней других биологически активных веществ, уменьшая их активность [см., например, Davies et al, 2001]. Поэтому поиск возможных мест связывания кофеина с двуспиральными фрагментами нуклеиновых кислот и построение атомно-молекулярных моделей возможных комплексов ДНК-кофеин явились логическим продолжением исследования взаимодействия кофеина с основаниями нуклеиновых кислот и их парами.
Несмотря на то, что структуры с почти параллельным расположением кофеина относительно плоскости пар оснований наиболее энергетически выгодны, существование подобных комплексов, как указывалось выше, невозможно в обычных условиях. Мы предполагали, что структуры, относящиеся к двум другим типам минимумов, могут возникнуть при связывании кофеина с ДНК в желобах спирали. При этом в образовании водородных связей могут участвовать каждый из трех атомов-акцепторов кофеина и каждая из трех аминогрупп оснований ДНК.
Значение угла между плоскостями кофеина и основания зависит от конформации дуплекса. Можно предположить, что для некоторых последовательностей и некоторых конформационных параметров дуплекса могут возникать конфигурации с двумя водородными связями, формирующимися двумя протон-акцепторными центрами кофеина с соседними или расположенными через одну парами.
