Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы АТФазы Р-типа: классификация, структура, механизм работы .
1.1. История вопроса и основные сведения по AT Фазам Р-типа 7
1.2. Гепомика и субстратная специфичность семейства АТФаз Р-типа 8
1.3. Исследования пространственной структуры АТФаз Р-типа 12
1.4. Молекулярный механизм работы АТФаз Р-типа 19
1.5. Регуляция активности АТФаз Р-типа 22
1.6. Заключение 23
Глава 2. Методы и подходы молекулярного моделирования 25
2.1. Применение метода молекулярной динамики для изучения динамической подвижности белков 25
2.2. Построение 3-мерных моделей белков на основании гомологии аминокислотной последовательности с белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально 31
2.3. Оценка качества 3-мерных моделей белков с помощью метода Айзенберга (Profiles-3D) 34
2.4. Применение метода молекулярного докинга для предсказания структуры комплекса белок-лиганд 36
2.5. Метод оценки комплементарности гидрофобных взаимодействий белок-АТФ 38
Глава 3. Исследования кристаллических структур Са -АТФазы саркоплазматического ретикулума. - Изучение : характерных взаимодействий в комплексах белков с АТФ ,
3.1. О кристаллических структурах SR Са2+-АТФазы 40
3.2. Анализ траекторий МД изолированнх нуклеотид-связывшощих доменов Са*-АТФазы 43
3.3. Докинг АТФ в МД-конформеры нуклеотид-связывающих доменов SRCa^-АТФазы 47
3.4. Разработка качественного критерия для оценки результатов докинга АТФ. Применения критерия для анализа результатов докинга АТФ в МД-коиформер SR Са2+-АТФазы 51
Глава 4. Построение 3-мерной модели нуклеотид-связывающих доменов Ш+,К+-АТФазы. Исследование структурно-функциональных аспектов связывания АТФ .
4.1. Общие сведения о Ыа+,К+-АТФазе 55
4.2. Построение и оценка качества 3-мерных моделей нуклеотид-связывающих доменов Na,К-АТФазы 56
4.3. Анализ траекторий МД 3-мерных моделей №+,К+-АТФазы в явно заданном растворителе 62
4.4. Результаты докинга АТФ в структуры из МД 3-мерных моделей Ыа+,К+-АТФазы 65
4.5. Анализ экспериментальных данных точеченого мутагенеза на основе j-мернои модели Na\K-АТФазы 68
4.6. Термодинамическая модель, выявляющая связь между стабилизацией "закрытой" конформации N- и Р-доменов АТФаз Р~ типаи свободной энергией связывания АТФ 74
Глава 5. Построение 3-мерной модели нуклеотид-связывающих доменов медь-транспортирующей АТФазы. Исследование структурно-функциональных аспектов связывания АТФ и механизмов проявления мутаций, сопряженных с болезнью Вильсона (WNDP).
5.1. Общие сведения о медь-транспортирующей АТФазе человека 77
5.2. Построение и анализ 3-мерных моделей нуклеотид-связывающих доменов WNDP 78
5.3. Анализ траекторий МД моделей нуклеотид-связывающих доменов WNDP 84
5.4. Построение и анализ "альтернативной" 3-мерной модели N-домена WNDP 88
5.5. Результаты докинга АТФ в МД-структуры 3-мерных моделей WNDP 90
5.6. Интерпретация данных мутагенеза на основе 3-мерной модели
WNDP 94
Выводы 97
Литература 98
- Гепомика и субстратная специфичность семейства АТФаз Р-типа
- Построение 3-мерных моделей белков на основании гомологии аминокислотной последовательности с белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально
- Анализ траекторий МД изолированнх нуклеотид-связывшощих доменов Са*-АТФазы
- Построение и оценка качества 3-мерных моделей нуклеотид-связывающих доменов Na,К-АТФазы
Введение к работе
Для понимания молекулярного механизма работы ферментов необходим анализ их пространственной структуры атомарного разрешения. Более того, часто нужно установить пространственные структуры белка в разных функциональных состояниях: в комплексе с субстратами или их аналогами, ингибиторами и др. Однако во многих случаях определение структуры белков с помощью экспериментальных методов представляет значительную техническую проблему. Наибольшие трудности возникают при структурных исследованиях мембранных белков, к которым относятся множество важнейших ферментов, рецепторов и транспортеров. Экспериментально установлены пространственные структуры высокого разрешения только нескольких типов мембранных белков. В то же время, благодаря успехам геномных исследований, для большинства биологически важных белков известна аминокислотная последовательность.
В связи с этим, широкое применение находит метод построения моделей пространственной структуры белков (3-мерных моделей) на основании гомологии аминокислотной последовательности с родственными белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально. Дальнейшее исследование 3-мерных моделей ферментов с помощью методов молекулярного моделирования, таких как молекулярная динамика и докинг лигандов, позволяет эффективнее анализировать экспериментальные данные, осуществлять компьютерный дизайн точечных мутаций белков, а также выдвигать различные гипотезы о структуре и функции белка.
Одно из важных и перспективных направлений структурной биологии связано с изучением мембранных белков из семейства АТФаз Р-типа. Ферменты из этого обширного и широко распространенного в живых организмах семейства осуществляют активный транспорт специфичных для них катионов за счет энергии гидролиза АТФ. Для наиболее изученного представителя АТФаз Р-типа, Са -АТФазы саркоплазматического ретикулума, в последние годы был получен ряд кристаллических структур высокого разрешения в различных функциональных состояниях, в том числе в комплексе с аналогами АТФ. Эти структуры используются в качестве основы ("шаблона") для построения моделей пространственной структуры других АТФаз Р-типа на основании гомологии.
Диссертационная работа посвящена построению 3-мерных моделей двух цитоплазматических нуклеотид-связывающих доменов (т. н. N- и Р-доменов) Na+,K+-АТФазы плазматической мембраны и медь-транспортирующей АТФазы человека, и изучению их структуры, динамики и взаимодействий с АТФ с помощью методов молекулярного моделирования.
Ка+,К+-АТФаза плазматической мембраны - наиболее распространенный в клетках млекопитающих представитель семейства АТФаз Р-типа. Градиенты концентраций ионов Na+ и К+ необходимы для формирования трансмембранного потенциала, поддержания клеточного объема, вторичного активного транспорта других веществ. Пространственная структура Na+,K+-ATOa3bi атомарного разрешения до сих пор экспериментально не установлена. Выравнивание аминокислотной последовательности нуклеотид-связывающих доменов фермента с Са2+-АТФазой показало относительно высокую гомологию. Это дало возможность построить реалистичную 3-мерную модель Na+,K+-АТФазы и предложить модель ее комплекса с АТФ, на основе которых были объяснены экспериментальные данные точечного мутагенеза.
Более сложная задача решалась при построении и анализе 3-мерных моделей медь-трапспортирующей АТФазы. Для аминокислотной последовательности N-домена этого белка гомология с соответствующим участком Са2+-АТФазы практически отсутствует. Тем не менее, результаты теоретического анализа показали, что укладка пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов обоих ферментов сходна. Исследование 3-мерной модели медь-транспортарующей АТФазы, построенной на основе структуры Са +-АТФазы, представляет не только фундаментальный, но и биомедицинский интерес. Мутации гена, кодирующего данный фермент, обусловливают летальный гепато-неврологический синдром - болезнь Вильсона. При этом многие и наиболее часто встречающиеся мутации локализованы в N- и Р-доменах и являются причиной нарушения связывания АТФ белком и/или процесса каталитического фосфорилирования. Объяснение молекулярного механизма этих мутаций и выявление функционально важных остатков, отвечающих за связывание АТФ, необходимо для поиска путей лечения этого наследственного заболевания.
Результаты моделирования как для Ка+,К+-АТФазы, так и для медь-транспортиругощей АТФазы, помогут планировать эксперименты сайт-направленного мутагенеза и лучше понять механизм работы этих ферментов. Модели нуклеотид-связывающих доменов АТФаз, полученные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы в качестве стартовой точки для построений более подробных молекулярных моделей ферментов.
В диссертации приняты следующие сокращения:
МД - молекулярная динамика; РСА - рентгеноструктуриый анализ; СКО — среднеквадратичное отклонение; ЭМ - электронная микроскопия; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; PDB - Protein Data Bank; WNDP - WilsoN Disease Protein.
Аминокислотные остатки представлены в однобуквенном обозначении:
Гепомика и субстратная специфичность семейства АТФаз Р-типа
Гены АТФаз Р-типа более широко распространены и разнообразны в геномах эукариотических организмов по сравнению с геномами бактерий и архей. Только четыре АТФазы Р-типа идентифицированы в геноме Escherchia coli [7], у термофильных архей Methanococcus jannaschii - одна [8], а некоторые паразитические бактерии не имеют их вовсе. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae 16 АТФаз Р-типа [9], около 45 идентифицировано в геноме Arabidopsis thaliana [10], что показывает важность этих ферментов для грибов и растений. Поиск АТФаз Р-типа в геномах нематоды Caenorhabditis elegans и плодовой мушки Drosophila melanogaster выявил до 21 и 15 генов, соответственно [11]. Аналогичного исследования геномов человека или мыши пока не проводилось.
Все АТФазы Р-типа - мультидоменные мембрано-связанные белки с молекулярной массой 70-150 кДа. N- и С-концевые остатки находятся на цитоплазматической стороне мембраны. По гомологии аминокислотных последовательностей АТФазы Р-типа разделяют на 5 подсемейств, обозначаемых как типы I-V. Внутри каждого семейства ферменты делятся на подтипы, каждый из которых специфичен к конкретному иону (субстрату). Будущие геномные исследования, возможно, модифицируют эту систему классификации.
АТФазы типа-1. Наиболее просто устроенные и, возможно, наиболее эволюционно древние представители семейства принадлежат к типу-І. Подтип-1А включает бактериальные ферменты, прототипом которых служит Kdp К+ из Е. Coll АТФаза Kdp К - комплекс из четырех различных мембранных белков (KdpF, KdpA, KdpB и KdpC). Белок KdpB (72-кДа) содержит каталитический центр и участок, связывающий и переносящий ионы [12]. В составе KdpB только 6 трансмембранных спиралей, этот белок - наименьший из АТФаз Р-типа.
Хотя большинство АТФаз Р-типа переносят малые катионы (Н+, Na+, К+, Са + и Mg2+), субстратами подтипа IB являются ионы тяжелых металлов. АТФазы подтипа IB, (например, бактериальные белки "устойчивости к металлам" СорА [13], ZntA [14] и CadA [15]) удаляют из клетки такие токсичные ионы, как Cu+, Ag+, Zn2+, Cd2+ и Pb +. Гомеостаз по концентрации необходимых для клетки элементов Си+ и Zn2+ достигается балансом активности соответствующих АТФаз, выделяющих их из клетки, и системы белков-транспортеров металлов АВС-типа [15, 16], осуществляющей поступление этих ионов в клетку. В отличие от АТФаз подтипа IA, ферменты из подтипа IB состоят из одной полипептидиой цепи и включают 8 трансмембранных спиралей. Интересно, что последние четыре спирали в подтипе IB не соответствуют консенсусной последовательности, общей для прочих АТФаз Р-типа, а N-копцевой участок содержит две "дополнительные" трапсмембранные спирали. Большинство АТФаз подтипа IB - бактериальные, но близкие гомологи были обнаружены в S. Cerevisiae [9], растениях [7] и животных [17]. Мутации в медь-транспортирующей АТФазе человека обусловливают редкие, но летальные, наследственные болезни Менкена и Вильсона. Из-за большого значения для медицины, исследованиям этого фермента, открытого около 10 лет назад, уделяется много внимания [18-20]. АТФазы типа-IV и -V. Ферменты этого типа близки по свойствам к АТФазам типа-1. АТФазы типа-IV выявлены только в эукариотических клетках, где они участвуют в транспорте липидов и формировании асимметрии липидного бислоя. Показано, что Mg2+-АТФаза осуществляет переходы липидов из наружного монослоя плазматической мембраны во внутренний монослой ("flip-flop"), например, в эритроцитах [21]. Сравнение аминокислотных последовательностей показывает, что Мд2+-АТФаза сходна с другими АТФазами Р-типа [7], и в ее ТМ-домене имеется сайт связывания ионов. До сих пор не выяснено, каким образом сайт связывания в центре "пучка" из 10 трансмембранных спиралей может быть адаптирован для транспорта как ионов, так и фосфолипидов. Возможно, Mg +-АТФаза работает в комплексе с ион-зависимым липид-транспортирующим белком, таким как АВС-транспортеры [21].
Еще менее изучены АТФазы типа V, которые были недавно выделены в отдельный класс в эукариотических геномах [7]. Их субстратная специфичность и биологическая роль пока не установлены, но, вероятно, это также ионные насосы.
АТФазы типа-П и -III. Это наиболее изученные представители семейства, создающие и поддерживающие трансмембранный потенциал в клетках животных и растений, который обусловлен значительной разностью концентраций ионов по разные стороны мембраны. Наличие трансмембранного градиента концентраций ионов - одно из необходимых свойств живой клетки, и стимулирует вторичный активный транспорт Сахаров и аминокислот, а также других малых молекул и ионов. Основные "электрогенериругощие" АТФазы принадлежат типу-Н или -III. Почти все сведения о структуре, функции и механизме работы семейства АТФаз Р-типа были получены для основных представителей этих типов.
АТФазы типа-П наиболее разнообразны. Подтип ПА представлен саркоплазматической (SR) Са -АТФазой [22, 23], а Са -АТФаза плазматической мембраны принадлежит подтипу ПВ. SR Са2+-АТФаза стала как бы "архетипом" АТФаз Р-типа, т.к. только для нее методом рентгеноструктурного анализа (РСА) были получены пространственные структуры высокого разрешения [24, 25]. Этот фермент перекачивает 2 иона Са2+ из цитоплазмы мышечной клетки в полости саркоплазматического ретикулума, используя энергию гидролиза 1 молекулы АТФ. При этом в обратном направлении перекачивается 2 или 3 иона Н+ [23]. Обратный выход Са2+ из ретикулума в клетку через Са2+-каналы происходит при сокращении мышцы [26]. У растений Са+-АТФаза плазматической мембраны (подтип-ПВ) выполняет ряд специальных функций [27, 28]. Активность АТФаз подтипа-НА в клетках животных регулируется фосфоламбаном, а для подтипа-ПВ характерны С- и N-концевые кальмодулин-связывающие регуляторные домены [29].
Подтип-ПС включает Ыа+,К+-АТФазу (см. обзоры 30, 31) и Н К -АТФазу эпителиальных клеток желудка [32, 33], обеспечивающую низкие значения рН пищеварительного сока. После SR Са +-АТФазы, Ыа+,К+-АТФаза - следующий по степени изученности представитель семейства. Этот фермент создает трансмембранный потенциал в клетках млекопитающих, выбрасывая из клетки 3 иона Na+ взамен 2 входящих внутрь ионов К+ за один ферментативный цикл. В почечной ткани, например, Ыа+,К+-АТФаза потребляет -30% синтезируемой в клетках АТФ [31]. Ма+К+-АТФаза и Н+,К+-АТФаза человека - важные мишени для действия лекарств [34]. Так, Ыа+,К+-АТФаза - мишень для гликозидов дигиталиса (сердечные гликозиды), которые веками используют при лечении болезней сердца. Функция Н+,К+-АТФаза подавляется веществом омепразол [35], которое является потенциальным антиязвенным средством, предотвращающим избыточную продукцию кислоты в желудке.
Построение 3-мерных моделей белков на основании гомологии аминокислотной последовательности с белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально
Широкое применение находит метод построения моделей пространственной структуры белков (3-мерных моделей) на основании гомологии аминокислотной последовательности с родственными белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально. Одним из часто используемых с этой целью программных пакетов является MODELLER [82, 83]. В качестве входных данных программе необходимо предоставить выравнивание аминокислотных последовательностей моделируемого белка и белков с известной структурой, а также структуры этих белков в формате PDB, получив которые алгоритм автоматически рассчитывает модель пространственной структуры. С наиболее общей точки зрения, программа MODELLER реализует автоматизированный подход для предсказания пространственной структуры белка по его аминокислотной последовательности, которая удовлетворяет заданному набору геометрических ограничений. На выходе программа выдает 3-мерные модели белка, которые удовлетворяют, насколько это возможно, набору ограничений. Ограничения, налагаемые на пространственную структуру белка, в принципе, могут быть произведены из различных источников. Они могут быть рассчитаны по известной пространственной структуре родственного белка, данным спектроскопии ЯМР, предсказанной вторичной структуры и упаковки ее элементов и др. Ограничения могут быть наложены на межатомные расстояния, углы, двугранные углы. Автоматически MODELLER генерирует геометрические ограничения только по известной структуре белка-шаблона. Оптимизация пространственной структуры белковой молекулы производится для позиций его атомов в декартовых координатах с использованием методов сопряженных градиентов и молекулярной динамики с алгоритмом "отжига" (simulated annealing).
Схема работы программы MODELLER. На Рис. 2.2. показана схема работы программы MODELLER, которая включает 3 основных шага: (1) Пользователь выполняет выравнивание аминокислотных последовательностей белка с неизвестной пространственной структурой (отмеченной на схеме, как SEQ) и родственных белков с известной структурой (3D). (2) На основании структур-"шаблонов" программа автоматически генерирует множество ограничений на межатомные расстояния и двугранные углы для моделируемой последовательности. Также возможно добавление пользователем специальных ограничений на моделируемую структуру. (3) Производится оптимизация 3-мерных моделей с тем, чтобы структура белка наилучшим возможным образом удовлетворяла набору ограничений. Вычисления производятся в классическом CHARMm-подобном силовом поле, задающем ограничения на валентные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия в молекуле белка.
Если идентичность первичных структур модели и белка-"шаблона" с известной пространственной структурой составляет не менее 30 - 40%, то, как правило, проблем с выравниванием последовательностей не возникает. Эту процедуру можно выполнить в автоматическом режиме, например, с помощью программы BLASTp [84], доступной на сервере http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, или программы CLUSTAL_W [85], выполняющей множественное выравнивание более чем двух аминокислотных последовательностей.
В случае отсутствия структуры белка-"шаблона" с высокой гомологией по последовательности к моделируемому белку, напротив, выполнение выравнивания -задача творческая, и успешность моделирования зависит, главным образом, от результата ее решения. Для того, чтобы установить возможный тип укладки основной цепи (фолда) модели, используют метод "протягивания" аминокислотной последовательности через набор структурных шаблонов (программа GenTHREADER [86]). Этот подход использует статистические данные по атом-атомным, контактам в белках с известной пространственной структурой.
Если предполагается, что моделируемая структура и структуры "шаблона" принадлежат к одному типу фолда, то при выравнивании их последовательностей необходимо совместить положение наиболее консервативных элементов вторичной структуры. Разумеется, в выравнивании должны совпадать также наиболее консервативные функционально важные остатки. Для предсказания вторичной структуры по аминокислотной последовательности существует ряд программ, доступных на Internet серверах, и показывающих достаточно хорошую надежность (правильное предсказание вторичной структуры для -60% остатков белка) [87]. В данной работе предсказание вторичной структуры нуклеотид-связывающих доменов Na+,K+-ATOa3bi и медь-транспортирующей АТФазы (WNDP) было получено с помощью программ PHD [87] и PSIPRED, доступных на сервере http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred [86].
Анализ траекторий МД изолированнх нуклеотид-связывшощих доменов Са*-АТФазы
Знание пространственной структуры белка часто недостаточно для того, чтобы понять механизм его работы. Во многих случаях лучшее понимание молекулярных механизмов функционирования белка достигается в результате изучения его динамического поведения. Ниже изложены результаты моделирования МД нуклеотид-связывагощих доменов SR Са -АТФазы в явно заданном растворителе. Можно выделить следующие цели этого исследования: 1) Анализ крупномасштабных движений в белке и выявление движений доменов относительно друг друга; 2) Исследование влияния динамического изменения конформации белка на возможность связывания молекулы АТФ; 3) Проверка корректности предложенного протокола МД в целях его дальнейшего использования при изучении 3-мерных моделей.
Расчет МД изолированных нуклеотид-связывающих доменов в явно заданном растворителе был произведен с помощью программы GROMACS. Системы для МД были построены на основе кристаллических структур SR Са2+-АТФазы в формах Е1-Са2+ (PDB-код 1SU4 и 1EUL), Е1-Са2+-АТФ (1T5S) и Е2 (1IWO). Далее будут использованы обозначения "МДІБШ" "МДшиь" "МДШБ" и "МДщуо" Для МД траекторий доменов SR Са +-АТФазы, стартующих из различных конформации.
Для позиций атомов основной цепи отдельных доменов Са2+-АТФазы среднеквадратичное отклонение (СКО) от стартовой конформации составило 2-3 А (Рис. 3.2), что показывает достаточную стабильность структуры N- и Р-доменов в МД. Анализ МД траекторий показал, что равновесная конформация отдельных доменов достигается после —1-2 не МД. Был изучен также показатель конформационной подвижности отдельных остатков белка - средняя квадратичная флуктуация (СКФ) позиций атомов основной цепи, рассчитываемая при выравнивании отдельных доменов, и для равновесного участка МД траектории. По зависимостям СКФ от номера остатка (данные здесь не приводятся) было выявлено несколько петлевых участков в N-домене (455-462, 500-510, 575-585), подверженных информационным перестройкам в МД. В Р-домене N- и С-концевые сс-спирали могут значительно смещаться в МД относительно своей стартовой позиции, в то время как в пативном белке их положение стабилизируется связями с трансмембранными М4 и М5, соответственно. 1.4 1,2
Изменение значений СКО в МД, рассчитанных по позициям атомов основной цепи относительно стартовых структур нуклеотид-связывающих доменов Са2+-АТФазы. Зависимости СКО от времени, рассчитанные отдельно для N- и Р-домена, показаны черным и красным цветом, соответственно. Зависимости СКО от времени, рассчитанные для обоих доменов при выравнивании структур по Р-домену, показаны синим цветом. Показаны данные для (А) МД Шиь (Б) МД nwo, (В) МД 1Su4, (Г) МД 1T5S.
Хотя структура отдельных доменов остается достаточно стабильной, их взаимное расположение значительно изменяется в МД. При совмещении МД-конформеров по Р-домену СКО по позициям атомов основной цепи обоих доменов относительно стартовой конформации составляет 13 А при достижении равновесия в МДіЕщ, и МДп-ss (Рис.3.2). Это результат крупномасштабных конформационных движений доменов в МД. Подобные движения наблюдаются в МДнтуо и МД ш, хотя соответствующее значение СКО не превышает 7 А (Рис. 3.2).
Из МД траекторий моделей с помощью средств пакета GROMACS были выделены низкочастотные моды, отвечающие наиболее крупным конформационным переходам белковой структуры, представляющие собой движения динамических доменов относительно друг друга. Как было показано с помощью программы DynDom [118], эти динамические домены практически соответствуют N- and Р-доменам. Любые доменные движения состоят из двух принципиальных компонент: "закрывание" и "кручение". В доменные движения SR Са +-АТФазы основной вклад вносит компонента "закрывания", хотя компонента "кручения" доменов относительно друг друга вокруг оси, соединяющей их центры масс, также присутствует.
Изменения взаимного расположения доменов отражаются с помощью введенного нами угла 0, вершина которого расположена на переходном участке, а лучи направлены к центрам масс отдельных доменов (Рис. 3.3В). На Рис. 3.3 видно, что для полученных траекторий амплитуда доменных движений, измеряемая с помощью показателя О, различается. В МДіниь N- и Р-домены сближаются друг с другом, и их взаимное расположение становится сходным со структурой Са2+-АТФазы 1IWO (Рис. 3.3А). В МДц\то и !V%su4 , конформация домены белка остается вблизи положения стартовой "закрытой" ( 9 125) и "открытой" (0-165) конформации, соответственно. В стартовой структуре 1T5S, соответствующей форме белка Е1-АТФ, N- и Р-домены сближены в большей степени по сравнению со структурой 1IWO: значения угла 6 для них составляют 107 и 122, соответственно. Тем не менее, в МДітзз не наблюдается стабилизации "закрытого" состояния и значение угла & выходит на равновесный уровень -135. Равновесное значение угла & составляет 135 для всех траекторий МД, кроме МДІБШ» В которой домены остаются в максимально "открытой" конфигурации (Рис. 3.3 Б),
Выявленные доменные движения ведут к значительным изменениям позиции нуклеотид-связывающего сайта в N-домене относительно сайта фосфорилирования в Р-домене (остаток D351). Так, в МДшиь и МДц\уо характерное расстояние между N- и Р-доменами, измеренное между атомами Са остатков Е439 и D351, изменяется в пределах 18 -5-23 А и 16- - 19 А, соответственно. Как будет показано ниже, изменение взаимного расположения двух доменов является необходимым событием для правильной ориентации молекулы АТФ в сайте связывания и приведения в контакт у-фосфатной группы АТФ с каталитическим остатком Asp, Хотя для некоторых МДіниь-конформеров возможно получить методом докинга структуру комплекса, в котором АТФ находится в контакте с остатками обоих сайтов (Рис. 3.4), для большинства структур расстояние между доменами остается слишком большим для этого.
Построение и оценка качества 3-мерных моделей нуклеотид-связывающих доменов Na,К-АТФазы
В настоящей главе обсуждается построение 3-мерпых моделей нуклеотид-связывающих доменов Na ,К -АТФазы и исследование их структуры, динамики и взаимодействий с АТФ. 4.1. Общие сведения о Ка К -АТФазе.
Ка+,К+-АТФаза плазматической мембраны - наиболее распространенный в клетках млекопитающих представитель семейства АТФаз Р-типа. По некоторым оценкам, 20 -30% синтезированной в клетках АТФ тратится на активный транспорт ионов Na+ из клетки наружу и ионов К+ внутрь [30]. Градиенты концентраций ионов Na+ и К+ необходимы для формирования трансмембранного потенциала, поддержания клеточного объема, вторичного активного транспорта других веществ.
Ка+,К+-АТФаза - наиболее крупный белковый комплекс в семействе АТФаз Р-типа. Минимальная функциональная единица - гетеродимер, состоящий из а- и р- субъединиц, а в почечной ткани фермент может включать также и дополнительную регуляторную у-субъединицу [121]. Первичная последовательность а-субъединицы была установлена в работах группы Н.Н. Модянова [121а]. У млекопитающих идентифицированы индивидуальные гены для 4-х изоформ а-субъединицы и не менее 3-х изоформ р-субъединицы [30]. Эти изоформы комбинируются и входят в состав ряда изоферментов Ш+,К-АТФазы, которые специфично экспрессируются в различных тканях и типах клеток. Один из центральных вопросов физиологии активного транспорта ионов Na+ и К - природа регуляции экспрессии этих изоферментов и разнообразные системы посттрансляционной модификации.
В последние годы многие экспериментальные работы были посвящены изучению каталитического цикла и кинетических свойств Ка+,К+-АТФазы, а также физиологических механизмов регуляции их работы [30, 121-123]. Структурно-функциональную роль отдельных остатков Ыа+,К+-АТФазы изучали методом точечного мутагенеза [124-126]. В настоящее время полная пространственная структура Na ,К -АТФазы не определена с разрешением, достаточным для детального изучения ее молекулярного строения. Тем не менее, в 2003 году по данным спектроскопии ЯМР были получены модели пространственной структуры изолированного N-домена Na ,К -АТФазы как в комплексе с АТФ, так и в свободном состоянии [45]. По ЯМР-структуре комплекса изолированного N-домена с АТФ можно лишь приблизительно оценить локализацию лиганда в интактном белке, т.к. в связывании АТФ принимают участие остатки и Р-домена. Сравнение с кристаллической структурой Са2+-АТФазы позволяет заключить, что в изолированном N-домене конформация некоторых важных участков белка может быть сильно искажена из-за отсутствия контакта с Р-доменом. Эти факторы обусловливают сильное снижение сродства изолированного N-домена к АТФ по сравнению с интактным белком: измерены значения константы диссоциации для АТФ 5 мМ и -0.01 мкМ, соответственно [45]. Поэтому, предсказание и анализ пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов №+,К+-АТФазы и их комплекса с АТФ является актуальной задачей в фундаментальном смысле.
Модель пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов Na ,К -АТФазы (фрагмент К342-К766) была построена по гомологии с SR Са2+-АТФазой, для которой экспериментально определены пространственные структуры высокого разрешения в различных функциональных состояниях. В качестве "шаблонов" были использованы структуры Са +-АТФазы в форме Е1 (PDB-код 1SU4) [24] и в форме Е2 (PDB-код 1IWO) [25], различающиеся взаимным расположением Р- и N-доменов. В дальнейшем мы будем обозначать модели, построенные на основе Е1- и Е2-структур как "открытая" (N- и Р-домены удалены друг от друга) и "закрытая" (N- и Р-домены сближены), соответственно.
Для построения 3-мерных моделей нуклеотид-связывающих доменов Na ,К -АТФазы было выполнено выравнивание их аминокислотной последовательности с соответствующим регионом Са2+-АТФазы. Как видно из Рис. 4.1, участки Na+,K+-АТФазы, соответствующие Р-домену (K342-R378,I582-K766), за исключением фрагмента А638-С656, имеют высокую гомологию с Са2+-АТФазой (48% идентичных остатков). Для N-домена (M379-L581) характерна относительно низкая степень гомологии по последовательности (20% идентичных остатков). Выравнивание аминокислотных последовательностей было получено с помощью программы BLASTp [84]. Затем была проведена оптимизация выравнивания для совмещения элементов вторичной структуры, установленных по данным спектроскопии ЯМР для N-домена [45] или предсказанных теоретически для Р-домена №+,К+-АТФазы [86, 87], с аналогичными элементами в структуре Са2+-АТФазы. предсказания вторичной структуры по методу PHD (Р1) и PSIPRED (Р2), изображенные символами синего цвета.
Структурные различия в N-домене главным образом обусловлены наличием двух делеций в последовательности Ыа,К-АТФазы (между остатками F386/D387 и V455/C456, соответственно). Первая делеция соответствует дополнительному р-тяжу в структуре N-домена Са2+-АТФазы, а вторая - неструктурированной петле между спиралями а2 и аЗ N-домена. Тем не менее, анализ ЯМР-структуры изолированного N-домена Ыа+,К+-АТФазы показывает, что его общая укладка сходна с соответствующим доменом Са -АТФазы: -75% остатков близки по положению атомов Са (Рис. 4.2).
Предсказание вторичной структуры для Р-домена №+,К+-АТФазы показало, что в районе участка "вставки" (А638-С656), конформация которого неизвестна, возможно образование а-спирали (E632-N642). В полученных нами 3-мерных моделях белка эта а-спираль в большой степени экспонирована в воду. Возможно, этот участок соответствует выступу в Р-домене, наблюдаемому в структуре Na ,К -АТФазы низкого разрешения, полученной с помощью методов ЭМ [127].
