Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что настоящая работа была проделана на дрозофиле, ее результаты выходят за пределы объекта исследования и могут быть рассмотрены в ракурсе общебиологических вопросов. В современной клеточной биологии существуют несколько проблем общего характера, понимание основополагающих моментов которых позволит моделировать в системе in vitro функциональную жизнеспособную объемную структуру, такую как клеточное ядро. В первую очередь это проблема внутренней организации структурных компонентов (ДНК, РНК, белков) ядра, их сопряженность с основными процессами ядерного метаболизма, а также их связь с событиями, протекающими при реконструкции ядра.
Выявление структур ДНК, РНК и белков, необходимых для поддержания функциональной внутренней архитектоники ядра, определяющей нормальную работу репликативной машины и механизмов синтеза и транспорта РНК, а также выявление компонентов, необходимых для корректной реконструкции ядерной оболочки, позволит в перспективе создать набор искусственных хромосом, самоорганизующихся в функциональное жизнеспособное ядро.
Проблема взаимодействия структурных компонентов ядра
развивается как в направлении изучения взаимодействия хроматина и
ядерной оболочки, так и в направлении анализа специфических
комплексов между ДНК и белками ядерного матрикса. В последнее
время была выделена так называемая M/SAR ДНК, обладающая
следующими характеристиками: эта ДНК выделяется как составная часть
ядерного матрикса, относится к А+Т- богатой ДНК, содержит "Ап:, "Тп"- и
"АТАТТТ" боксы. Специфические M/SAR последовательности
располагаются в основании транскрипционных петель и являются
участками, формирующими транскрипционно активную
пространственную архитектуру хроматина. M/SAR ДНК описана для подавляющего большинства исследуемых организмов. Недавно была обнаружена фракция внутриядерного ламина и показано, что M/SAR ДНК
взаимодействует с ним в условиях in vitro. Эти два факта позволяют полагать, что контакт ДНК и ламина является важным не только для ориентации хромосом относительно ядерной оболочки, но и может быть необходимым фактором формирования функциональной топологии транскрипционных доменов внутриядерного хроматина. Участие M/SAR ДНК и ламина не только в креплении хромосом к ядерной оболочке, но и в пространственной организации ядерного скелета указывает на сложность взаимоотношений компонентов ядерного матрикса, их многофункциональность. Важная роль кариоскелета как в координации различных биохимических систем ядра, так и в определении пространственной упорядоченности в ядре, подчеркивает необходимость накопления данных, вскрывающих законы его функционирования.
Общеизвестно, что ДНК интерфазных хромосом имеет сложную пространственную организацию в объеме клеточного ядра. Можно выделить два уровня пространственной упорядоченности интерфазного хроматина. Во-первых, это ориентация хромосом относительно поверхности ядра и, следовательно, определение их положения внутри клетки. Этот уровень определяется взаимодействием хроматина и ядерной периферии. Во-вторых, это трехмерная организация внутриядерного хроматина, которая заключается в установлении независимых транскрипционных доменов и в создании регулируемого доступа к информации, хранящейся в ядерной ДНК. Экстрахромосомальный кариоскелет в значительной степени состоит из белков ядерного матрикса. За счет него создается и поддерживается форма ядра, а элементы хроматина организуются таким образом, что доступность ДНК становится оптимальной.
Взаимодействие кариоскелета и хроматина осуществляется за счет специфических районоэ на хромосомах. На цитологическом уровне ДНК интерфазных хромосом взаимодействует с двумя морфологическими структурами, определяемыми в ядре: ядерной оболочкой и внутренним ядерным матриксом [Luderus et al., 1992]. В
состав ядерной оболочки входит образующий филаменты мажорный
белок, называемый ламином, белки порового комплекса и некоторые
другие протеины. Компонентный состав внутреннего кариоскелета
практически неизвестен, за исключением Торо II и нескольких недавно
описанных белков ядерного матрикса [Schaten et al., 1985; van Driel etal.,
1991]. Последние работы [Luderus et al., 1992; Boy de la Tour, Laemmli,
1988; Mirkovitch et al., 1984; Rattner, 1992; Saitoh, Laemmli, 1994] четко
определили линию в изучении M/SAR ДНК в ракурсе ее взаимодействия
с белками внутреннего ядерного матрикса. Последовательности
M/SAR ДНК, взаимодействующие с внутренним кариоскелетом,
достаточно полно охарактеризованы на молекулярном уровне [см. обзор
van Driel et al., 1992]. Установлено, что ядерный матрикс в комплексе с
ДНК определяет петельную конформацию хроматина, обеспечивая
транскрипционную активность соответствующих участков ДНК. Кроме
того, в недавних работах было показано, что M/SAR ДНК играет
значительную роль в формировании пространственной структуры
метафазной хромосомы [Saitoh, Laemmli, 1994]. По вопросу
взаимодействия ДНК хромосом и ядерной оболочки также существует серия работ, в которых на цитологическом уровне определены районы контакта хромосомі и ядерной периферии на примере политенных хромосом D. melanogaster [Hochstrasser et al., 1986; Hochstrasser, Sedat, 1987a, b; Paddy et al., 1990]. В этих работах указывается на то, что основным сайтом хромосом, ассоциированным с ламиной, является хромоцентр, содержащий повторяющиеся структуры а- и р-гетерохроматина. Хромоцентр инвариантно контактирует с оболочкой в ядрах клеток слюнных желез, средней и задней кишки. Согласно последним данным, сателлитные последовательности а-гетерохроматина вовлечены в формирование кинетохорной пластинки. Одной из функций повторов р-гетерохроматина является их участие в процессе трехмерной организации интерфазных хромосом. Следовательно можно полагать, что центромерный район хромосом
дрозофилы участвует и в метафазной, и в интерфазной активности хромосомы. Основываясь на результатах картирования сайтов контакта хромосом и ядерной оболочки дрозофилы, полученных в группе Седата, можно полагать, что расположенная в хромоцентре ДНК обладает своеобразными молекулярными свойствами, так как транспозиция ее на плечо хромосомы приводит к появлению в этом месте нового сайта контакта с ядерной оболочкой [Lifschytz, Harven, 1982]. В этом аспекте центромерный гетерохроматин может представлять собой удобную модель для анализа взаимодействия ДНК и ламины.
Как уже говорилось, одним из основных белковых компонентов ядерной оболочки является ламин, образующий сеть фибрилл, выстилающих внутреннюю поверхность ядерной периферии. До настоящего времени не описана ни одна последовательность ДНК, которая была бы изучена всесторонне на способность взаимодействия с ламином in vivo.
Поиск и анализ периферийных элементов ядерного скелета клеток D. melanogasler, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, позволит, во-первых, ответить на вопрос о существовании специфической ДНК, контактирующей с ядерной оболочкой (отлична ли она от других последовательностей, описанных как M/SAR ДНК, взаимодействующих с внутренним белковым каркасом ядра, и какие белки ядерной периферии участвуют в этом контакте). Во-вторых, позволит выяснить характер взаимодействия ДНК и белков периферии и определить молекулярную организацию хроматина, вступающего в это взаимодействие.
Постулирование существования двух типов ДНК, взаимодействующих с внутренним ядерным матриксом и с ядерной оболочкой, ставит несколько проблемных вопросов: 1) Существуют ли специфические ядерные белки, определяющие взаимодействие ДНК и ядерной оболочки, и как они соотносятся с белками внутреннего кариоскелета?
2) Вовлечены ли специфические последовательности ДНК в это
взаимодействие, то есть существует ли специфический мотив,
обеспечивающий дифференцированное связывание с белками ядерной
оболочки и белками кариоскелега?
3) Если такой мотив существует, та имеет ли он отношение к M/SAR ДНК,
взаимодействующей с внутренним ядерным матриксом?
Иными словами, существует ли взаимозаменяемость компонентов кариоскелета?
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск и анализ ДНК, специфичной к периферийным элементам ядерного скелета клеток D. melanogaster, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, выделение и характеристика последовательностей ДНК, связанных с ядерным ламином in vivo, а также анализ взаимодействия нуклеиновых кислот и ламина in vivo. Конкретными задачами данного исследования были:
1) Клонирование последовательностей ДНК центромерного
гетерохроматина дрозофилы, связанных с ядерной ламиной in vivo.
2) Выявление в структуре клонированной ДНК сегмента, связывающегося
с ламином in vitro.
3) Молекулярный и цитогенетический анализ ДНК сегмента,
ассоциирующегося с ламином in vitro.
-
Биохимический анализ характера взаимодействия ламина и ДНК in vivo с использованием кросслинкующего агента и без него.
-
Клонирование сегментов ДНК, ассоциированных с ламином in vivo.
6) Контекстный и структурный анализ нуклеотидных
последовательностей, ассоциированных с ламином in vivo.
Научно-практическое значение исследования. В результате проделанной работы впервые были выделены и охарактеризованы последовательности повторяющейся ДНК из центромерного района дрозофилы, за счет которых хромоцентр контактирует с ядерной оболочкой. По-видимому, именно эта ДНК определяет пространственную
ориентацию хромосом в объеме ядра и, следовательно, является необходимым фактором существования жизнеспособной архитектоники хроматина. Новым является описание сайта контакта тандемно организованного повтора и ядерной ламины. Характер ассоциации тандема и ламины позволяет говорить о возможном механизме движения хроматина по ламиновым филаментам.
Впервые выделены и охарактеризованы последовательности ДНК, ассоциированные с ламином in vivo. Показано, что все изученные ДНК относятся к структурам ядерного матрикса, что говорит об их потенциальном участии в организации скелета ядра.
Выявлен ранее неизвестный факт, что связь ламина и некоторых последовательностей ДНК in vivo сохраняется в условиях жесткого лизиса и денатурации, определяемых биохимически для ковалентного взаимодействия. Установлено, что ламин ассоциирован с НК разного типа. Во-первых, это комплексы ламин-РНК, во-вторых, это ассоциаты ламина с молекулами ДНК, различные по степени устойчивости к условиям жесткого лизиса и денатурации.
В теоретическом плане была сформулирована гипотеза "плавающей центромеры", построена модель компактизации и выявлены формообразующие принципы при конденсации митотической хромосомы. Кроме того, на основании полученных результатов был разработан подход к конструированию искусственной хромосомы D. melanogaster.
Научная новизна исследования. Впервые выделена и изучена ДНК центромерного гетерохроматина D. melanogaster, способная к ассоциации с ядерной оболочкой. До выполнения этой работы не было информации о молекулярных особенностях этой ДНК, характера ее связи с ламином и ее цитогенетической локализации.
Впервые описаны последовательности ДНК, ассоциированные с ламином in vivo. Установлен новый факт существования связи между молекулами ДНК и ламином, различной по степени устойчивости к
жесткому лизису и денатурации. Впервые выявлено, что ламин in vivo контактирует как с ДНК, так и с РНК-молекулами, при этом как А+Т-, так и G+C-богатые области НК вовлечены в зону контакта.
Развито представление о функциональной организации центромерного локуса хромосом D. melanogaster.
Впервые предложен возможный механизм обратимой укладки хроматина в митотическую хромосому.
Сформулирован принципиальный подход к созданию искусственной хромосомы дрозофилы.
Впервые выдвинуто предположение, что в ядре существует система посредников (ламины-M/SAR ДНК) между двумя компонентами кариоскелета (ядерным матриксом и ламиной), за счет которых осуществляются структурные преобразования в ядре.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на международном симпозиуме "Трансмиссия хромосом и митоз", Ленинград, 1990; VII Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом", Пущино, 1991; Keystone Simposia "The nuclear matrix: involvement in replication, transcription, gene splicing and cellular regulation", 1994; Twentieth EMBO Annual Symposium "Genomes and chromosomes", Heidelberg, Germany, 1994; международном симпозиуме "Эволюция жизни на Земле", Томск, 1997; международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики", Новосибирск, 1997; Keystone Symposia "Integrating cellular architecture/function and regulation. Architectural and functional dynamics of the nuclear matrix", 1998.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных данных, обсуждения (динамика хроматина) и списка литературы, изложенных на 241 странице машинописного текста. Работа иллюстрирована 2 таблицами, 59 рисунками и приложением. Список литературы включает 299 работ отечественных и зарубежных авторов.
Основные результаты получены автором самостоятельно. Часть работы была проделана совместно с Шараховым И.В. Без активного вмешательства Якубова Л.А., Кокозы Е.Б., Велша Ф., Ашбурнера М. и Фишера П., а также без стечения некоторых обстоятельств история предлагаемого исследования была бы не возможна. За что я безгранично признателен этим людям. За время осуществления данного проекта большое количество людей так или иначе принимало в нем участие. В этой связи я хочу поблагодарить за помощь в осуществлении настоящей работы Байбородина СИ., Киселеву Е.В., Баричеву Э.М., Копыла С.А., Волкову Е., Шилова А.Г., Филиппову М.А., Борисевича И.В., Строц О.В., Себелеву Т.Е., Лапик Е.Р. и молодых сотрудников лаборатории молекулярной биологии клетки Бойкову Т.В., Лихачеву Е.В., Рогачева В.А. Особо хочется поблагодарить Катохина А.В., Батанина М. и Гетц В. за критические дискуссии по вопросам пространственной организации митотической хромосомы. Данная работа не могла бы быть выполнена без удивительного Пола Фишера и его лаборатории, в которой были получены основные результаты этого проекта. Огромное спасибо я говорю юному голландцу Нико Штурману, в плодотворных дискуссиях с которым родились основные концепции исследования. Я бесконечно благодарен Кикнадзе И.И. Именно она явилась вдохновителем идеи предлагаемого проекта. Не могу не поблагодарить Колесникова Н.Н., Таранина А.В. и Муллокандова М.Р., которые просто помогали мне "по жизни" в ходе работы над проектом. Очень большую помощь в оформлении печатных трудов мне оказывали Прасолов В.А. и Фадеева А.Н. За что я им также глубоко признателен. И наконец, данная работа поддерживалась следующими грантами и стипендиями: молодежный грант СО АН СССР 1990-1991; приоритетные направления генетики 1993-1998; РФФИ 1993-1998; Fogarty fellowship 1993-1994; грант лаборатории Фишера П.А. (Stony Brook USA) 1994-1995.
НК - нуклеиновые кислоты; M/SAR - последовательности ДНК, выделяемые совместно с ядерным матриксом; CREST - (различные типы коллагенозов - аутоиммунных заболеваний); нг - нанограммы; т.п.н. -тысяч пар нуклеотидов; SDS - додецил сульфат натрия; DTT -деитиотриетол; IAA - йодоацетамид; УФ - ультрафиолет; ТХУ -трихлоруксусная кислота; AT - антитела; IP - иммуноприцепитат; IgG -тяжелые цепи иммуноглобулинов; ям - ядерный матрикс; цгх -центромерный гетерохроматин.
