Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методологические подходы в изучении паразитарных систем 23
1.1. Учение о паразитарных системах, современные представления 23
1.2. Интегративно-функциональный подход в изучении паразитарных систем 31
Глава 2. Применение интегративно-функционального подхода для анализа паразитарной системы ECHINOCOCCUS SPP 38
2.1. Паразитарная система рода Echinococcus 38
2.2. Характеристика внутривидовых вариантов Echinococcus granulosus 46
2.3. Характеристика внутривидовых вариантов Е. multilocularis 55
2.4. Паразитарная система Echinococcus spp.c позиций интегративно-функционального подхода 58
2.4.1. Определение системных элементов и комплекса стадийных и инфраструктурных целей системных элементов паразитарной системы Echinococcus spp 59
2.4.2 .Взаимодействие и взаимное влияние биологических ресурсов и механизмов активации системных элементов паразитарной системы Echinococcus spp 77
Глава 3. Патогенез ларвальных (цистного и альвеолярного) эхинококкозов с позиций интегративно-функционального подхода 85
3.1. Метацестода Е.granulosus 85
3.2. Феномен экзогенного почкования метацестод гидати-дозного эхинококка у человека 87
3.3. Метацестода E.multilocularis 95
3.4. Особенности развития метацестоды E.multilocularis у человека 96
Глава 4. Экспериментальное моделирование ларвальных эхинококкозов 101
4.1. Экспериментальное моделирование ларвального цистного эхинококкоза 102
4.1.1. Лабораторная модель ларвального цистного эхинококкоза. 104
4.1.2. Методика получения протосколексов Е.granulosus.. 105
4.1.3. Методика заражения лабораторных животных биоварами цистного эхинококкоза 107
4.1.4.Восприимчивость белых мышей к внутрибрюшинному заражению протосколексами Е.granulosus от промежу точных хозяев разных видов 110
4.1.5. Характеристика лабораторных штаммов Е.granulosus по морфологии крючьев протосколексов 115
4.1.6. Оптимизация методов сохранения и поддержания лабораторных штаммов Е.granulosus 119
4.2. Экспериментальное моделирование ларвального альвеолярного эхинококкоза 122
4.2.1. Лабораторная модель ларвального альвеолярного эхинококкоза 124
4.2.2. Инвазионный материал E.multilocularis 124
4.2.3. Методика получения протосколексов E.multilocularis 125
4.2.4. Подсчет числа протосколексов в инокуляте 127
4.2.5.Усовершенствование метода парентерального вторичного заражения 127
4.3. Характеристика лабораторных штаммов E.multilocularis 130
4.3.1. Продуктивность метацестод лабораторных штаммов E.multilocularis в отношении протосколексов и ацефало-цист от экспериментальных промежуточных хозяев одного вида 130
4.3.2. Восприимчивость белых крыс к парентеральному заражению протосколексами биоваров E.multilocularis 132
4.3.3. Морфология хоботковых крючьев биоваров E.multilocularis 134
4.3.4. Характеристика лабораторного штамма «восточноевропейского» биоваров E.multilocularis 136
Глава 5. Экспериментальное моделирование стробилярного эхинококкоза 140
5.1. Разработка лабораторной модели стробилярной стадии развития E.multilocularis 141
5.2. Характеристика изолятов E.multilocularis по особенностям роста и развития стробил 146
5.3. Характеристика изолятов E.multilocularis по морфологии крючьев 149
5.4. Искусственная трансплантация стробил E.multilocularis иммуносупрессированным и интактным лабораторным грызунам 151
5.5. Метод диагностической интестинотомии при экспериментальном стробилярном альвеококкозе 158
Глава 6. Практические и теоретические аспекты использования экспериментальных моделей элементов паразитарной системы ECHINOCOCCUS SPP 165
6.1. Методика изучение воздействия группы новых проти-воцестодных препаратов на моделях ларвального и кишечного альвеококкоза 166
6.2. Результаты воздействия полимерной формы альбенда-зола (ПФА) на метацестоду паразита 168
6.3. Изучение действия флузамида на стробилярную стадию развития E.multilocularis 180
6.4. Способ скрининга антигельминтных препаратов. 188
Заключение 195
Выводы 200
Практические рекомендации 202
Список литературы 205
- Интегративно-функциональный подход в изучении паразитарных систем
- Характеристика внутривидовых вариантов Echinococcus granulosus
- Феномен экзогенного почкования метацестод гидати-дозного эхинококка у человека
- Экспериментальное моделирование ларвального альвеолярного эхинококкоза
Введение к работе
Эхинококкозы - актуальная глобальная проблема медицинской паразитологии. Эхинококкозы представляют собой сложные паразитарные системы, структурными компонентами которых являются цестоды рода Echinococcus на разных стадиях развития, а также животные и человек, являющиеся хозяевами разных стадий жизненного цикла паразита. Популяция паразитов - интегрирующее звено паразитарной системы, образованной конкретной популяцией паразита и поддерживающими ее существование популяции всех хозяев. В основе паразитарной системы лежит выработанное в ходе эволюции взаимодействие популяций паразита и хозяев.
Ларвальные эхинококкозы (цистный и альвеолярный) тканевые гельминтозы, характеризующиеся, длительным хроническим течением заболевания, тяжелой органной и системной патологией, обширностью поражения, приводящие к инвалидности и нередко заканчивающиеся смертью больного.
Эхинококкозы широко распространены во многих странах мира [93, 103, 106, 131, 137, 240, 241]. Распространение гидати-дозов в России за последние годы остается примерно на одном уровне - около 1,1 случаев на 100 тысяч населения [36, 173].
Эхинококкозы человека и сельскохозяйственных животных представляют серьезную социально-экономическую проблему, требующую разработки новых подходов для ее разрешения. Одним из таких подходов может стать интегративно-функциональный [8]. Применительно к паразитарной системе
Echinococcus spp. этот подход определяет методологию изучения
механизмов взаимодействия разных стадий развития паразита с организмами хозяев и их роли в реализации инвазионного процесса.
Для изучения указанных механизмов могут быть использованы известные лабораторные модели эхинококкозов, разработанные в России [38, 50]. Недостатком, которых является использование большого числа экспериментальных животных, так как при пассаже лабораторные животные-доноры погибают. До сих пор ограничены сведения об инвазионности паразита от естественных хозяев разных видов для лабораторных животных [156, 161,162,163, 211]. Отсутствуют методы длительного поддержания лабораторного штамма возбудителя, гарантирующие сохранение возбудителем морфологических особенностей и полноценных инвазионных свойств [40,56]. Особый интерес в этом аспекте представляют стабильное воспроизведение и поддержание лабораторных штаммов возбудителей эхинококкозов, отработка стандартизованных лабораторных моделей метацестодной стадии и разработка новых моделей стробилярной стадии Echinococcus spp. Большое теоретическое и прикладное значение имеет создание моделей с использованием в качестве донорского материала паразитов, полученных от оперированных больных альвеококкозом для уточнения конкретных параметров паразито-хозяинных отношений.
Интегративно-функциональный подход служит эффективным инструментом определения механизмов реализации биологических возможностей (ресурсов или потенциалов) паразита на всех стадиях его развития в организме различных хозяев. Моделирование условий, в которых паразит вынужден использовать все имеющиеся биологические ресурсы для обеспечения своего развития и сохранения, в том числе и при неблагоприятных для него условиях, позволит определить механизмы взаимодействия и особенности биологического потенциала разных стадий паразита.
С целью выявления новых возможностей в разработке профилактических мероприятий и лечения промежуточных и окончательных хозяев, а также использования стандартизованных экспериментальных моделей в скрининговых исследованиях противо-цестодных препаратов, начиная с 1999 года в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины (ИМПиТМ) им. Е. И. Марциновского ММА им. И. М. Сеченова проводились специальные исследования в рамках НИР по решению заданий программы «Оптимизация профилактики паразитарных болезней» договор № 034/146/052 от 16.07.03 отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология и микробиология» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработка методологии моделирования паразитарной системы Echinococcus spp. для применения в экспериментальной медицине и биотехнологии.
• ДЛЯ ДОСТИЖЕНИЯ ПОСТАВЛЕННОЙ ЦЕЛИ ПОТРЕБОВАЛОСЬ РЕШИТЬ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДАЧИ:
определение системных элементов, инфраструктурных (са-мосохранительных) целей на разных стадиях жизненного цикла паразита и механизмов активации данных элементов паразитарной системы Echinococcus spp.;
воспроизведение, модификация и стандартизация экспериментальных моделей биоваров возбудителей цистного и альвеолярного эхинококкозов на лабораторных животных;
использование «очищенных» свободных микроскопических ацефалоцист, полученных из метацестоды от оперированного больного альвеолярным эхинококкозом, для создания лабораторного штамма экспериментального альвеококкоза;
совершенствование и оптимизация методов моделирования кишечных форм цестод для изучения особенностей развития зрелых форм паразита;
определение и стандартизация параметров культивирования стробилярной стадии альвеолярного эхинококка на лабораторных грызунах;
изучение возможности использования экспериментальных моделей биоваров возбудителей альвеолярного и цистного эхинококкозов для скрининга противоцестодных препаратов;
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ:
В результате проведенных исследований нами впервые: • обоснована целесообразность применения интегративно-функционального подхода для анализа взаимоотношений в пара зитарных системах, который позволяет определять механизмы активации разных стадий развития паразита Echinococcus spp. в организмах разных видов хозяев;
• отработаны методические приемы поддержания стандартизованных лабораторных штаммов и моделей эхинококка;
• показана ведущая роль ацефалоцист в выживании и увеличении популяции паразита в организме промежуточного хозяина;
• доказана возможность лабораторного воспроизведения экспериментального альвеолярного эхинококкоза при использовании в качестве паразитарного донорского материала очищенных свободных микроскопических ацефалоцист из метацестод от оперированных больных альвеококкозом;
• создана принципиально новая методология лабораторного поддержания экспериментальных моделей цестод путем искусственной трансплантации незрелых стробилярных форм цестод из кишечника экспериментально зараженного животного-донора в желудок неинвазированного животного-реципиента, с последующим развитием паразита в кишечнике грызуна до стадии формирования инвазионных яиц. Этот подход определяет новое направление в моделировании гельминтозов;
• на основе метода искусственной трансплантации незрелых и зрелых стробилярных форм эхинококков доказан новый для науки факт — возможность оперативной трансплантации взрослых цестод и нематод из кишечника животного-донора в желудок животного-реципиента с последующим развитием гельминта в кишечнике донора до стадии зрелых яиц;
• обнаружен новый биологический феномен — возможность экзогенного почкования личиночной стадии Echinococcus granulosus в организме человека.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
Результаты исследований позволили оптимизировать и стандартизировать методы экспериментального моделирования разных стадий развития Е. granulosus и E.multilocularis. Значимость работы для практического использования заключается в следующем:
1. Обоснована возможность применения интегративно-функционального подхода для анализа взаимоотношений в паразитарных системах, который позволяет определять механизмы активации разных стадий развития паразита Echinococcus spp. в организмах разных видов хозяев;
2. Получен новый лабораторный штамм E.multilocularis «восточно-европейского» биовара (от оперированного больного [78]) -продуцент большого числа протосколексов.
3. Отработана безопасная модель стробилярных цестод с использованием «восточно-европейского» и «камчатского» биова-ров эхинококка.
4. Отработана методика трансплантации кишечных цестод и нематод у экспериментальных животных, что обеспечивает стандартизацию и сокращение стоимости моделей.
5. Создана высокопродуктивная модель кишечного альвеолярного эхинококкоза на золотистых хомяках, упрощающая скрининг химиопрепаратов и позволяющая получать большие объемы, ан тигенного материала для целей биотехнологии, производства диагностических тест-систем и конструирования вакцин против эхинококкоза окончательных хозяев.
6. Доказана эффективность использования стандартизованных лабораторных моделей эхинококка для скрининга противоэхино-кокковых препаратов и отработки новых подходов к терапии, в том числе:
6.1. на экспериментальной модели кишечного альвеолярного эхинококкоза золотистых хомяков выявлена высокая противоцестод- ная активность: полимерной, формы альбендазола, представляющей собой металлокоплекс альбендазола и меди, дополнительно включенного в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы (ПФА), флуза- мида, микрокапсулированного комплекса альбендазола и кобальта, препарата Г - 1741 и препарата растительного происхождения - кукурбина;
6.2. выявлен феномен адаптации хозяина к постепенно и постоянно повышаемым суточным дозам препаратов группы карбамат-бензимидазолов в течение продолжительных непрерывных курсов лечения, что открывает новые подходы к терапии;
6.3. установлено, что терапевтическая активность эффективных противоэхинококковых препаратов на экспериментальных моделях ларвальных эхинококкозов характеризуется быстрой первоначальной и равномерной во всей популяции паразитов деструкцией протосколексов и последующим замедленным и неравномерным отмиранием микро- и макроацефалоцист метацестоды эхинококка.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРАКТИКУ.
Материалы исследований использованы при подготовке с личным участием автора нормативно-методических документов, утвержденных Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации:
1. Санитарные правила и нормативы (СанПиН) 3.2.1333-03 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации". Утверждены Министерством здравоохранения РФ 28.05.03 г. Зарегистрированы в Министерстве Юстиции РФ 09.06.03 № 4662.
2. Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями: Методические указания (МУ 3.2. 1756 - 03), М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2004.
3. Получены патенты на изобретение:
3.1. Антигельминтное средство. Патент РФ № 2195280. -2002.
3.2. Способ скрининга антигельминтных препаратов. Патентная заявка № 2001134511/14. Приоритет 21.12.01
4. Материалы диссертации были использованы в педагогической работе на сертификационных циклах для врачей паразитологов, эпидемиологов и других специалистов ЦГСЭН; терапевтов, педиатров, инфекционистов и других специалистов лечебно- профилактических учреждений на тематических циклах усовершенствования на кафедре паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И. М. Сеченова (2001 - 2004 гг.); в курсе «Тропические паразитарные болезни» для иностранных студентов 6 курса лечебного факультета ММА им. И. М. Сеченова (2000 - 2004 гг.).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Интегративно-функциональный подход открывает новые возможности в изучении патогенеза эхинококкозов. Он позволяет рассматривать проявления особых биологических ресурсов паразита (экзогенное почкование Е.granulosus по типу альвеолярного, развитие ацефалоцист E.multilocularis внутрь паразитарного узла и другие), как основную причину выживания и увеличения популяции паразита, приводящую к рецидивам инвазии.
2. Созданный универсальный спектр стандартизованных экспериментальных моделей эхинококкозов позволяет проводить изучение всех стадий развития паразита. Отработанные для этой цели методические приемы — диагностическая лапаротомия и интести-нотомия, ультразвуковое и рентгенологическое исследование — обеспечивает выявление инвазии, определение размеров и степени зрелости метацестод. На модели кишечного альвеолярного эхинококкоза показана возможность трансплантации препатент-ной и стробилярной стадий развития паразита.
3. На основе стандартизованных экспериментальных моделей отработана оригинальная методика ускоренного скрининга анти-гельминтиков, позволившая выявить ряд перспективных для дальнейшего изучения противоцестодных препаратов. Поступательное увеличение дозы вводимых препаратов, испытанное на лабораторных моделях эхинококкозов, предложено для повышения эффективности терапии этих заболеваний.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Материалы диссертации были доложены на:
Международной научно-практической конференции «Проблемы эхинококкоза», Махачкала, 2000 г.
Научно-практической конференции «Тканевые гельминтозы: диагностика, патогенез, клиника, лечение и эпидемиология», Витебск, 2000 г..
XXI Международный Конгресс Гидатидологов, Турция, г. Кусадаки, 2001 г.
I Международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию со дня открытия профессором К. И. Виноградовым сибирской двуустки у человека, Томск, 2001 г.
Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозы), Москва, 2002 г.
III Международной Российско-Иранской Конференции «Сельское хозяйство и природные ресурсы», Москва, 2002 г.
X Международном Конгрессе Паразитологии, Канада, г. Ванкувер, 2002 г.
XI Международном Гельминтологическом Симпозиуме «Гельминты, гельминтозы и окружающая среда», Словакия, г. Старо Леста, 2003 г.
XXI Симпозиуме Скандинавского Общества Паразитологов, Норвегия, г. Берген, 2003 г.
XIX Международной Конференции Всемирной Ассоциации Прогресса Ветеринарной Паразитологии, США, г. Нью Орлеан, 2003 г.
XXI Международном Конгрессе Гидатидологии, Кения, г. Найроби, 2004 г.
Научно- практической конференции: «Теория и практика борьбы с гельминтозами». ВИГИС, г.Москва, 2002, 2003, 2004.
Объединенной сессии Центрального Совета ОГ РАН и секции «Инвазионные болезни сельскохозяйственных животных». Отделение ветеринарной медицины РАСХН, г. Москва, 2002, 2003 г.г.
Заседании ВОГ РАН, г. Москва, 2002, 2003, 2004 г.г.
Заседании Ученого Совета ИМПиТМ им. Е. И. Марциновского ММА им. И. М. Сеченова (2002 - 2004 г.г.)
Диссертация апробирована на заседании Специализированной комиссии по предварительной экспертизе диссертаций в ИМПиТМ им. Е. И. Марциновского ГОУ ММА им. И.М.Сеченова (протокол № 79 от 07 сентября 2004 г.).
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ.
Результаты диссертации отражены в 48 печатных работах (из них 6 в журналах, включенных в перечень ВАК; 19 в зарубежных изданиях), 1 СанПиНе, 1 методическом указании, 2 патентах.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертация изложена в виде монографии на 233 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 86 отечественных и 162 зарубежных публикаций. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 41 рисунком.
Интегративно-функциональный подход в изучении паразитарных систем
В основе интегративно-функционального подхода в изучении паразитарных систем лежит понимание системы как целостного и целесообразного комплекса причинно-следственных связей, обеспечивающего устойчивое сохранение паразита как вида. Причинно-следственная связь - взаимообусловленность проявления различных свойств паразита и хозяина, характеризующая их функциональные зависимости. Для паразита - это удержание его патогенных свойств в пределах, сохраняющих жизнь хозяина на уровне, обеспечивающем возможность размножения и передачи паразита другому хозяину. Для хозяина - реализация потенциала защиты, противодействие и нейтрализации патогенности воздействия паразита. В рассматриваемом подходе системным элементом выступает элементарная причинно-следственная связь. Для паразита — это разные аспекты взаимодействия конкретной стадии развития с организмом хозяина или окружающей средой. Элементарной причинно-следственной связью паразитарных систем является вирулентность инвазионной стадии (яйца, личинки и др.) и восприимчивость (комплекс ответных реакций) хозяина, приводящие к развитию заболевания. Под «вирулентностью» понимают степень патогенности паразита в отношении определенного вида животного или человека при определенном способе заражения [82]. Это определение включает в себя степень: инфективности (способности паразитического организма внедряться в организм хозяина), инвазивности (способности преодолевать клеточные, тканевые и гуморальные защитные барьеры для проникновения и роста в хозяине)и токсигенности возбудителя. Для изучения этого свойства используются следующие параметры: инфицирующая доза и способность паразита к размножению и росту в организме хозяина. Таким образом, основными системными элементами паразитарной системы являются: вирулентность инвазионной стадии (яйца, личинки) и как следствие развитие личиночной или зрелой стадии паразита, и восприимчивость хозяина к данному паразиту, приводящая как следствие к: о развитию паразита - у восприимчивых организмов, или о гибели паразита - у организмов, обладающих резистентностью (устойчивостью) по отношении к данному патогену. Учитывая то, что паразитарные системы чаще всего многокомпонентны, то число системных элементов может быть различно. Биологический ресурс или потенциал (свойство-следствие) — возможность влияния на ход некоторого процесса с использованием свойства-причины системного элемента. Для различных стадий развития паразита — это возможность активации его инвазивности (вирулентности).
Организм хозяина, как промежуточного, так и дефинитивного выступает в паразитарной системе не только как биотическая среда, но и как структурный элемент её, обладающий или не обладающий чувствительностью к данному объекту, т.е. способностью синтезировать активные вещества (или клетки) для инактивации патогена или метаболитов последнего. Механизм активации (свойство-причина) - способ или механизм, при помощи которого реализуется потенциальная возможность заражения и паразитирования возбудителя, несмотря на защитную реакцию организма хозяина. Для паразита - это реализация факторов инвазивности, обеспечивающих сохранность данной стадии развития в организме хозяина и возможность дальнейшего развития или размножения; для организма хозяина - реализация комплекса последовательных реакций, способствующих развитию паразита или препятствующих этому развитию (рис.1). Совокупность элементарных механизмов активации в системе составляет интегративный (суммарный) механизм активации. Взаимодействие патогенного воздействия паразита и защитных механизмов хозяина являются сутью паразито-хозяинных отношений. Превалирование паразитарного воздействия (высокая вирулентность) приводит к развитию тяжелого заболевания. На- оборот, превалирование защиты ведет к «абортированию» патологического процесса. Таким образом, при использовании настоящего подхода основой изучения становятся не морфологические особенности паразита и хозяина, а их взаимодействие, то есть, используя медицинскую терминологию, патогенез болезни. Устойчивое существование паразитарной системы может быть обеспечено исключительно благодаря балансу "интересов", организмов в нее входящих. Воздействие паразита нарушает гомеостаз макроорганизма "достаточно" для обеспечения возможности выживания паразита в организме хозяина, но эти нарушения не столь выражены, чтобы привести к необратимым изменениям и гибели хозяина.
Со своей стороны хозяин воздействуя на паразита также "калибрует" свою реакцию, чтобы не навредить себе необратимо, т. е. отсутствуют гиперергические реакции, способные обеспечить гибель паразита и как "побочный эффект" гибель хозяина. Для каждого из системных элементов необходимо определить параметры возможного развития процесса, без взаимоуничтожения и способы реализации данной возможности. Биологический потенциал инвазионной стадии и развитие паразита, определяются геномом паразита. Совокупность реакций обеспечивающих процесс заражения и преодоления защитных ответных реакций хозяина, обеспечивается физиологическими особенностями паразита. При этом комплекс реакций хозяина, так же детерминирован, и реализуется генетической детерминацией последнего.
Характеристика внутривидовых вариантов Echinococcus granulosus
Паразитарная система Е.granulosus (эхинококк гидатидоз-ный) включает более десяти видов плотоядных (дефинитивных хозяев гельминта) и около десяти видов преимущественно травоядных и человека (промежуточные хозяева) (рис.2).
По сравнению с другими видами Е.granulosus обладает меньшей специфичностью к промежуточным хозяевам. Поскольку промежуточными хозяевами данного вида в пастбищном цикле являются сельскохозяйственные животные, это обуславливает его обширное географическое распространение. Такие мощные социальные (антропогенные) факторы как торговля животными и племенное животноводство, связанные с перевозкой животных (промежуточных хозяев) способствовали распространению биоваров и стиранию различий в циркуляции разных вариантов на конкретных ограниченных территориях. В лесном цикле развития паразита участвуют дикие животные, что ограничивает перенос этих биоваров между разными эн-зоотичными территориями.
Определение «европейская форма» применяется к биоварам Е. granulosus чаще всего в тех случаях, когда цикл предусматривает вовлечение сельскохозяйственных животных. Термин не является прямым отражением происхождения этой формы, так как ленточные гельминты вовлекались в синантропные циклы, вероятно, с начала появления животноводства в Евразии и Африке. При этом, однако, допускается, что антропогенное давление оказало влияние на процесс естественного отбора паразитов из природы с наиболее характерными для местной «популяции» чертами. Постулируемая этой точкой зрения внутривидовая изменчивость вида Echinococcus granulosus была весьма тщательно прослежена рядом исследователей [51,217,224].
Почти во всех частях ареала европейской формы Е. granulosus личиночная стадия выявляется у домашних животных и часты случаи заражения человека. Единственный эпидемически значимый окончательный хозяин - собака. Домашние копытные почти всех видов могут служить промежуточными хозяевами формы Е. granulosus, но вероятность заражения зависит от местных условий и типа животноводства. Существуют различия между видами ко пытных в степени восприимчивости к заражению и развитию личиночной стадии эхинококка. «Северная» форма распространена в арктических зонах тундры и тайги, хотя встречается, при благоприятных условиях, и в более низких широтах у копытных семейства Cervidae. В природном цикле северная форма существует преимущественно в паразитарной системе "хищник - жертва". В этом цикле наибольший удельный вес занимает тандем между волком и большим северным оленем (включая одомашненные формы). В Евразии наиболее распространенной является паразитарная система, включающая пару: собака - одомашненный северный олень, что вызвано использованием собак для управления или охраны стадами последних. В северной Сибири этот вариант паразито-хозяинных отношений (собака - одомашненный северный олень) является ведущим, а дополнительными промежуточными хозяевами северной формы могут выступать дикий северный олень и лось [185]. Патология человека преимущественно определяется биоваром, циркулирующим в синантропном цикле.
Популяция Е. granulosus, имеющая место на севере Североамериканского материка, представлена лесным циклом между волком, лосем и диким северным оленем. Домашние копытные и различные виды грызунов мало восприимчивы к этому варианту паразита. В противоположность «домашнему» изоляту эхинококка, заражение диким изолятом вызывает, как правило, у человека бессимптомное течение заболевания [137, 244]. Заболевания, вызванные разными вариантами, отличаются серологически [135,170,179,182] и при типировании на лабораторных животных [37,41,44].
В пределах вида Е. granulosus (на стадии метацестоды) имеются доказательства существования, по крайней мере, девяти хозяинно-специфичных вариантов, которые были охарактеризованы на основании генетических [152], морфологических [154, 167], биологических [165, 226] и эпидемиологических исследований [137, 139, 150].
Однако, идентификация биоваров Е. granulosus по морфологии, биологии развития, эпидемиологии, хозяиной специфичности и генетическим особенностям часто дает неоднозначные результаты. [142, 230]. Примерами полностью доказанной внутривидовой дифференциации пастбищного цикла могут служить исследования в Великобритании, где британские «лошадиный» и «овечий» штаммы Е. granulosus были дифференцированы с использованием ряда критериев. Помимо хорошо документированных морфологических различий между ними [139, 243, 229] было показано различие в хозяиной специфичности [243, 229], биологии развития [220, 221], физиологии [154, 208], биохимии [150, 152, 165, 166] эпидемиологии и эпизоотологии [105, 229]. На основании этих исследований были определены критерии, которые имеют значение для дифференциации внутривидовых вариантов Echinococcus.
Подобные критерии были применены и к популяциям Е. granulosus в Австралии, где географическая изоляция может являться важным фактором видообразования, поскольку эндемичные по гидатидозу территории разделены обширными территориями пустыни или моря, где циркуляция паразита невозможна [224]. На материковой части Австралии имеется два изолята Е. granulosus. Пастбищный цикл встречается главным образом в типичной паразитарной системе овца - собака. Этот изолят идентичен таковым же у овец в Великобритании и Новой Зеландии. Beроятно, он был завезен ранними поселенцами из Европы. Лесной цикл образует паразитарная система - сумчатые — динго [224]. Этот изолят полностью отличен и имеет мало общего с формами Е. granulosus, описанным в других странах. Он хорошо адаптирован к своей уникальной паразитарной системе (развитие личиночной стадии у сумчатых), нормально развивается у динго, в то время как у домашних собак его развитие замедляется [217]. Это позволяет предполагать, что это местный вариант паразита, присутствующий на континенте до появления собак и овец.
Особо можно выделить вариант Е. granulosus острова Тасмания, который встречается в паразитарной системе овца — собака. Характерной чертой его является быстрое созревание у собак по сравнению с материковым домашним изолятом (в частности, яйца начинают выделяться на 1 неделю раньше, чем у последнего). Возможно, причиной возникновения нового биовара могла послужить программа интенсивного контроля за гидатидозом, принятая на Тасмании более 30 лет назад, включающая регулярное медикаментозное лечение собак [217]. Таким образом, уменьшение препатентного периода отражает эволюционно обусловленное приспособление паразита к регулярному антигельминтному лечению.
В Центральной Африке была отмечена вероятность существования лесного варианта Е. granulosus в паразитарной системе между бородавочниками и львами [136]. Собаки при экспериментальном заражении протосколексами, полученными от бородавочника, были не восприимчивы к инвазии. Вовлечение льва в жизненный цикл паразита было отмечено и в других африканских странах: в Уганде бородавочник - лев, африканский буйвол - лев [136]; в Южной Африке львы были экспериментально инвазированы протосколексами от зебры (Equus burchellii) [177, 233, 234, 246], описана также пораженность львов эхинококками в Южной Африке.
Феномен экзогенного почкования метацестод гидати-дозного эхинококка у человека
Нами впервые описан феномен увеличения популяции метацестод Е. granulosus у человека путем экзогенного почкования паразитарной кисты по типу, характерному для альвеолярного эхинококка. Он был выявлен у больной П., 69 л., оперированной по поводу гидатидозного эхинококка. Из полости печеночной паразитарной кисты (диаметром 150 мм) была выделена дочерняя киста (диаметром 50 мм), несущая на поверхности 9 плотных шаровидных наростов беловатого цвета (диаметром 10-30 мм) с бугристо-фестончатой поверхностью, напоминающих по внешнему виду кочаны цветной капусты в миниатюре (рис.5).
При микроскопии содержимого этих образований выявлено множество тесно прилегавших друг к другу мелких паразитарных кист диаметром 0,1-3 мм. Наиболее крупные из них содержали выводковые капсулы с живыми юными и зрелыми ввернутыми протосколексами. Основание этих образований имело 1-2 полых ветвящихся канала, устья которых сообщались с полостью дочерней паразитарной кисты и были четко различимы в виде 1-2 отверстий диаметром 2-3 мм на внутренней поверхности дочерней кисты (рис. 6). Факт обнаружения феномена экзогенного почкования у дочерних паразитарных кист свидетельствует о формировании новых очагов за счет локальной экзогенной пролиферации клеток герминативной оболочки паразита. Это позволяет с принципиально новых позиций объяснять механизм послеоперационного рецидива эхинококковой болезни у человека.
высказанную еще Smyth [207], и обнаруженную Ф.П. Коваленко [40] на экспериментальных моделях лабораторных животных.
Факты экзогенного почкования у человека были подтверждены проведенным паразитологическим анализом пунктатов, из кистозных образований и самих цист от ряда больных, оперированных по поводу цистного эхинококкоза различной локализации. Ниже приведены несколько примеров наших исследований. Больной Б., 23 лет (диагноз - эхинококкоз сердца). В исследованном фрагмента выявлено 8 спавшихся материнских метаце-стод, множество мелких дочерних кист (диаметром от 50 мкм до 5,0 мм), наблюдается экзогенное почкование с формированием внучатых кист.
Больной С, 21 года (диагноз - эхинококкоз левого легкого). Проведено макро- и микроскопическое исследование представленного материала, в результате которого выявлена хорошо развитая оболочка кисты, толщиной 2,0 мм (примерный возраст кисты -2-3 года), к кутикулярной оболочки прилегают микроскопические дочерние и внучатые кисты, наблюдается экзогенное почкование.
Больной Ч., 26 лет (диагноз - эхинококкоз печени). В осадке жидкого содержимого метацестоды (объем 800 мл) выявлено множество зрелых и незрелых дочерних и внучатых ларвоцист. В основном ларвоцисты погибшие, но выявлены до 300 экз. мелких, диаметром от 0,3 до 8,0 мм дочерних и внучатых кист; у некоторых мелких, диаметром 3-6 мм отмечено экзогенное почкование с диаметром почек 0,5 - 2,0 мм.
Обращают на себя внимание синхронные процессы дегенерации материнских кист и пролиферация отдельных клеток герминативной оболочки с формированием дочерних и внучатых кист. В пунктатах других больных (8 человек) даже в погибших кистах, обнаруживались несколько жизнеспособных ацефалоцист. При обнаружении зрелых и юных протосколексов (свободных и заключенных в выводковые капсулы) примерно в 20 - 30 % из них, наблюдалось описанное ранее [40] развитие ацефалоцист (диаметром 10 - 120 мкм) из герминативных клеток "ножки" протосколексов. Это является признаком злокачественной экзогенной пролиферации элементов метацестоды паразита. Больная Ш.. 39 лет (диагноз - множественный рецидивный эхинококкоз большого сальника, корня брыжейки подвздошной кишки, забрюшинной клетчатки, париетальной и висцеральной брюшины). Размеры и масса этих кист (с соединительно-тканной фиброзной капсулой) составляли 7 х 9 см (масса - 451 г.) и 8,5 х 11 см (масса - 462 г.).
После удаления соединительно-тканной капсулы с более крупной кисты, установлено, что под общей капсулой располагались две материнские кисты, поверхность наиболее крупной из которых несла конгломерат наружных дочерних кист, диаметр которых варьировал от 0,5 до 15 мм (рис. 9,10).
Экспериментальное моделирование ларвального альвеолярного эхинококкоза
Яйцами паразита заражаются многие виды грызунов: нелинейные и линейные мыши, степная пеструшка, сибирский лемминг, бурундук, суслик, большая и монгольская песчанки, хлопковая и многососковая крысы и др. [236]. Невосприимчивость к первичному заражению белых крыс, морских свинок и золотистых хомяков отмечали многие авторы [51, 56, 148]. Однако в виду того, что паразит высоко патогенен для человека, эксперименты с яйцами этого гельминта без специальных «режимных» условий проводить нельзя.
Впервые безопасный для экспериментатора метод воспроизведения модели альвеолярного эхинококкоза был предложен Rausch R.L. [186], который успешно заразил полевок нескольких видов путем внутрибрюшинного введения им зрелых протоско-лексов. В дальнейшем метод внутрибрюшинного (вторичного) заражения протосколексами был использован многими исследователями при воспроизведении экспериментального альвеолярного эхинококкоза у хлопковых крыс, монгольских песчанок, нелинейных и линейных мышей, ондатр [44, 56, 221].
Важной с практической точки зрения оказалась возможность заражения животных альвеолярным эхинококкозом путем парентерального введения мелких ацефалоцист. Мелкими ацефа-лоцистами диаметром до 1 мм, полученными от хлопковых крыс и джунгарских хомячков после их заражения протосколексами, удалось заразить 100 % используемых в эксперименте подопытных животных (95 хлопковых крыс и 80 джунгарских хомячков). В дальнейшем, как показали эксперименты, данный метод оказался пригодным для перезаражения животных и позволил увеличить скорость роста и сократить сроки созревания ларвоцист в 2-3 раза [44].
Использование для заражения высоко инвазивных ацефа-лоцист позволило воспроизвести ларвальный альвеолярный эхи-нококкоз у несвойственных паразиту лабораторных животных -нелинейных и линейных крыс и золотистых хомяков без применения иммунодепрессантов.
Экспериментальный альвеококкоз белых крыс в отличие от известных моделей характеризуется более медленным ростом паразита, что обеспечивает возможность длительного сохранения жизни животных при значительной биомассе паразита. Нелинейные белые крысы оказались восприимчивыми к заражению в 100% случаев после внутрибрюшинного введения каждой дозой в 500-10000 ацефалоцист диаметром 0,1-1,0 мм от экспериментально зараженных доноров — хлопковых крыс и джунгарских хомячков. Длительность выживания зараженных белых крыс достигала 1,5-2 лет, а биомасса паразита - 400 г, превышая массу тела животного в 1,5-2 раза. Созревание паразита начиналось через 1 мес. развития. Установлена высокая инвазивность альвеококка от белых крыс-доноров для хлопковых крыс, джунгарских хомячков, нелинейных и линейных мышей при вторичном заражении реципиентов.
Восприимчивость золотистых хомяков в возрасте 1-1,5 мес. к ларвальному альвеококкозу составила 100% после внутрибрюшинного введения животным по 300 - 1000 ацефалоцист альвеококка диаметром 0,1-1,0 мм. Длительность выживания зараженных животных достигала 1 года, а биомасса паразита - 30 г (около 50% массы тела хозяина). В наших опытах, также как было показано Коваленко Ф. П. [39], созревание паразита начиналось через 1,5-2 мес. после имплантации. Базовую модель ларвального альвеококкоза поддерживали на хлопковых крысах путем заражения животных микроскопическими ацефалоцистами альвеококка от экспериментально зараженных доноров того же вида, по методике предложенной Кротовым А. И. [52]. В ИМПиТМ им. Е. И. Марциновского в течение почти 30 лет не наблюдалось снижения инвазивной и антигенной активности ларвальной стадии возбудителя инвазии («казахский» штамм). Рабочие модели ларвального альвеококкоза мы воспроизводили на молодых хлопковых крысах (массой тела 80-100 г) и аут-бредных мышах (массой тела 18-22 г) путем внутрибрюшинного и подкожного заражения животных 100-200 ацефалоцистами альвеококка диаметром 50-300 мкм. В своих экспериментах мы использовали инвазионный материал E.multilocularis (ИМПиТМ) от лабораторных грызунов-доноров - хлопковых (Sigmodon hispidus) и белых (Rattus norvegicus) крыс. Лабораторных животных заражали внутрибрю-шинно протосколексами и ацефалоцистами E.multilocularis, полученными от: о красной лисицы (стробилярная форма) с юго-восточного Казахстана — этот лабораторный штамм назван «казахстанским» (КазЛШ) [53]; о волка (стробилярная форма) с полуострова Камчатка - «камчатский» (КамЛШ) лабораторный штамм [29]i о оперированного больного - жителя Тульской области (ларваль-ная стадия) - «восточно-европейский» (ВЕЛШ) лабораторный штамм. Этот лабораторный штамм был получен и описан нами [78] (табл.1) Ларвоцисты от животных-доноров (экспериментально зараженных хлопковых и белых крыс) измельчали ножницами или с помощью мясорубки до гомогенного состояния. Гомогенат промывали стерильным физиологическим раствором над мельничным газом с диаметром ячейки 0,3 мм. Фильтрат распределяли в цилиндры с коническим дном и отстаивали в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость отсасывали резиновой грушей со вставленной в ее конец пастеровской пипеткой и заменяли свежим физиологическим раствором.
