Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Процессы агрегации бактерий рода Azospirillum и адсорбции на корнях растений 11
1.2. Структура липополисахарида бактерий рода Azospirillum 15
1.3. Межклеточные взаимодействия и участие в них липополисахаридов 18
1.4. Экспериментальное моделирование межклеточных взаимодействий 21
1.5. Молекулярное моделирование 28
1.5.1. Молекулярная механика и метод минимизации потенциальной энергии 30
1.5.2. Молекулярная динамика 35
1.5.3. Реализация расчетных методов в компьютерной программе HyperChem 42
Глава 2. Материалы и методы исследований 45
2.1. Бактериальная культура 45
2.2. Растительная культура 45
2.3. Выделение липополисахаридов 45
2.4. Методика очистки препарата липополисахарида от белка 46
2.5. Методика приготовления липосом 46
2.6. Определение размеров ассоциатов липосом 47
2.7. Определение размеров липосом 49
2.8. Регистрация адсорбции липосом на корнях пшеницы 52
2.9. Определение концентрации метиленового синего в липосомах и экстрактах корней пшеницы 52
2.10. Оценка влияния Ы-ацетил-О-глюкозамина на адсорбцию экспериментальных моделей на корнях пшеницы 53
2.11. Методика выделения растительных полисахаридов 53
2.12. Приготовление гидрозоля наночастиц диоксида кремния 56
2.13. Регистрация адсорбции наночастиц на корнях пшеницы 56
2.14. Определение концентрации флуоресцеин-натрия в липосомах 57
2.15. Определение концентрации индолил-3-уксусной кислоты в липосомах 57
2.16. Методика определения длины колеоптилей 58
2.17. Измерение поверхностного натяжения 58
2.18. Статистический анализ 61
2.19. Принципы работы программного комплекса HyperChem с учетом применения модифицированных методов 61
2.19.1. Алгоритм графического изображения молекулярных структур в коммерческой программе HyperChem 61
2.19.2. Алгоритм оптимизации геометрии молекулы и выбора наиболее энергетически выгодной конформации 62
2.19.3. Краткое описание программы поиска стабильной конформации молекулы в гетерогенной среде 63
2.20, Компьютерное моделирование динамики полисахарид-полисахаридного взаимодействия 67
Глава 3. Молекулярное моделирование поверхности грамотрицательных бактерий azospirillum brasilense SP245 68
3.1. Модификация метода расчета энергии сольватации химического соединения на границе раздела фаз вода-липид 69
3.2. Экспресс-метод расчета дипольного момента произвольной молекулы 72
3.3 Результаты моделирования поверхности грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и их обсуждение 75
Глава 4. Экспериментальное и компьютерное моделирование процесса агрегации бактерий azospirillum brasilense sp245 86
Глава 5. Исследование процесса адсорбции экспериментальных моделей на поверхности корней пшеницы 94
Глава 6. Применение модельных систем для доставки химических веществ к корням растений 101
выводы 111
список литературы 112
- Межклеточные взаимодействия и участие в них липополисахаридов
- Методика очистки препарата липополисахарида от белка
- Оценка влияния Ы-ацетил-О-глюкозамина на адсорбцию экспериментальных моделей на корнях пшеницы
- Экспресс-метод расчета дипольного момента произвольной молекулы
Введение к работе
Межклеточные взаимодействия составляют основу жизнедеятельности всех живых организмов. У бактерий они определяют комплекс иммуногенных реакций, позволяют обмениваться метаболитами с симбионтами, приводят к агрегации клеток - эволюционно значимому процессу, необходимому для формирования многоклеточного организма. Молекулярные механизмы межклеточных взаимодействий являются предметом изучения, биохимии, молекулярной биофизики и биофизики клетки.
Большой теоретический и практический интерес представляет исследование механизмов симбиотических взаимодействий высших растений и почвенных микроорганизмов. Это связано с перспективами использования ассоциативных азотфиксирующих бактерий в качестве продуцентов ИУК, стимулирующей рост и продуктивность сельскохозяйственных растений. Из числа хорошо изученных азотфиксаторов выделяют ризосферные грамотрицательные бактерии рода Azospirillum, которые образуют колонии на корнях широкого круга растений (Dobereiner, 1976; Окоп, 1986; Bashan, 1997). Один из наиболее исследованных штаммов Azospirillum brasilense Sp 245 преимущественно ассоциирован с корнями пшеницы.
Способность бактерий к агрегации и сорбции на корнях растений зависит от структуры компонентов бактериальных и растительных клеточных поверхностей. В процессах взаимодействия азоспирилл между собой и с корневой поверхностью выявлено участие белков, ЛПС внешней мембраны бактерий, капсульных полисахаридов, полисахарид-содержащих комплексов, экскретируемых в окружающую среду. Но макромолекулы, определяющие специфичность этих процессов, а также механизмы взаимодействий окончательно не определены.
Исторически, в системе азоспириллы-злаки большее внимание уделялось белок-углеводным взаимодействиям, поскольку этот механизм лежит в основе реакции антиген-антитело. В последние годы благодаря пионерским работам Hakomori, открыт новый тип молекулярного распознавания - углевод-углеводное взаимодействие, которое, по утверждению автора, происходит за счет образования межмолекулярных водородных связей (Hakomori, 2001). Hakomori доказал, что на первой стадии адгезии животных клеток гликосфинголипиды, образуя кластерные структуры на поверхности мембран, взаимодействуют с комплементарными гликосфинголипидами других клеток (Hakomori, 1999, 2000, 2001). Этот процесс активирует сигнальные системы клетки, вызывая ее фенотипические изменения.
Наличие углевод-углеводных взаимодействий у дрожжей подтверждают работы российских исследователей (Michalchik ,2000).
Следовательно, нельзя исключить возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций.
Для исследования сложных многокомпонентных процессов, как правило, применяют методы моделирования, экспериментального и компьютерного.
В качестве моделей клеточных мембран обычно используют искусственные бислойные мембраны, в частности липосомы, которые способны включать в себя амфифильные соединения и ориентировать их на поверхности (Марголис, 1982). В последние годы липосомы, инкрустированные липополисахаридами, применяются для изучения межклеточных взаимодействий (Водовозова, 2004; Арефьева, 2006).
Поскольку наружная мембрана бактерий рода Azospirillum состоит из липидного бислоя, адекватной моделью для экспериментального моделирования процесса полисахарид - полисахаридного взаимодействия могут служить липосомы, инкрустированные ЛПС бактериальной поверхности.
Способность модельных систем имитировать процессы агрегации и адсорбции бактерий можно использовать в прикладных целях, например для доставки химических соединений с разнообразной биологической активностью к корням растений. Разработав подход для конструирования таких систем, можно создавать средства доставки, распознающие клетки-мишени целевых растений, по аналогии с системами транспорта лекарственных веществ в организме человека.
Использование математических методов, реализованных в настоящее время в компьютерных программах, является необходимым дополнением при проведении любых модельных экспериментов.
Все вышеизложенное определяет актуальность данной работы.
Цель диссертационной работы: разработка моделей бактериальной поверхности Azospirillum brasilense Sp245 и их применение для изучения роли полисахарид - полисахаридного взаимодействия в процессах агрегации микробных клеток и адсорбции на корнях пшеницы.
Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:
1. Провести компьютерное моделирование конформации 0-специфического полисахарида (О-ПС) ЛПС наружной мембраны бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и динамики полисахарид - полисахаридного взаимодействия.
2. Разработать экспериментальные модели поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp245 для изучения полисахарид-полисахаридного взаимодействия.
3. Исследовать процесс агрегации модельных систем.
4. Изучить процесс адсорбции экспериментальных моделей на поверхности корней пшеницы.
5. Оценить возможность доставки химических веществ к корням растений с помощью наносистем с углеводной детерминантой.
Научная новизна работы:
Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-ПС в водной фазе. Показано, что при взаимодействии двух цепей полисахаридов с антипараллельной ориентацией наиболее энергетически выгодной является структура типа двойной спирали, образованная за счет межмолекулярных водородных связей. Установлено, что полисахариды, ориентированные параллельно друг другу, не образуют устойчивого комплекса.
Разработаны экспериментальные модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные липополисахаридами внешней мембраны клеток A. brasilense Sp245. Показано, что ЛПС встраиваются в липосому таким образом, что их О-ПС направлен в окружающую среду и расположен по нормали к поверхности липосом.
Впервые данные экспериментальные модели использованы для изучения полисахарид-полисахаридных взаимодействий в межклеточных контактах в системах бактерии-бактерии, бактерии-злаки. Установлено, что липосомы, инкрустированные ЛПС внешней бактериальной мембраны, подобно живым микробным клеткам, образуют агрегаты и способны сорбироваться на корневой поверхности пшеницы.
Научно-практическая значимость работы:
Впервые изучена возможность применения наносистем для направленного транспорта химических веществ к корням растений. В модельных экспериментах показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наночастиц диоксида кремния, обогащенных растительными полисахаридами, и липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны А. brasilense Sp245. Полученные результаты предлагается использовать при разработке систем доставки биологически активных веществ к корням растений с целью уменьшения антропогенной нагрузки на окружающую среду.
Модифицирован метод расчета энергии сольватации химического соединения в среде вода-липид и оценки его ориентации на границе раздела этих фаз и разработаны соответствующие алгоритм и программа. Материалы диссертационной работы использовались при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета и Курского государственного технического университета, а также применялись в курсе лекций «Молекулярная биология» и в практикуме по молекулярной биологии на биологическом факультете Саратовского государственного университета.
Работа выполнена в рамках плановой госбюджетной темы НИР ИБФРМ РАН "Изучение биологически активных веществ и моделирование их действия на растения и микроорганизмы расчетно-теоретическими методами" (№ гос. регистрации 01.200.116077).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Взаимодействие двух цепей О-ПС внешней мембраны бактерий А. brasilense Sp245, ориентированных антипараллельно, приводит к образованию структуры типа двойной спирали, стабилизированной межмолекулярными водородными связями и снижению полной энергии системы.
2. Липосомы, содержащие на своей поверхности О-ПС азоспирилл, образуют агрегаты посредством полисахарид-полисахарид ного взаимодействия и подобно живым бактериальным клеткам сорбируются на корневой поверхности пшеницы.
3. Разработанные наносистемы с углеводными детерминантами являются эффективными средствами для направленного транспорта химических веществ к корням растений.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:
Личный вклад соискателя состоит в разработке экспериментальных моделей бактериальной поверхности и теоретических методов и алгоритмов, а также в проведении экспериментов, расчетов и интерпретации полученных данных. В экспериментах использовали препарат ЛПС, полученный из лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Эксперименты по определению среднего размера агрегатов липосом выполнены совместно с к.ф.-м.н. Хлебцовым Б.Н. Электрофорез препаратов ЛПС, полученных по модифицированной методике, проводился к.б.н. Бурыгиным Г.Л. и д.б.н. Маторой Л.Ю.
Апробация работы Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях:
Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, 2003,2004.
1-ая и 2-ая Российские школы-конференции "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине", Саратов, 2002, 2004.
Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants - International Symposium, Saratov, Russia, 2003.
Macromolecular Organization and Cell Function - Gordon Research Conference, Oxford, Great Britain, 2004.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале из списка ВАК и 2 статьи в зарубежных изданиях.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы исследования», четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 170 источников, из которых 119 на иностранных языках.
Работа поддержана Программой Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы», раздел 3.3 «Развитие научно-исследовательской работы молодых преподавателей и научных сотрудников, аспирантов и студентов», проект № 45436.
Межклеточные взаимодействия и участие в них липополисахаридов
В основе жизнедеятельности живых организмов лежат межклеточные взаимодействия. У животных и человека именно они определяют эмбриогенез и морфогенез при развитии зародыша, а во взрослом состоянии особенно важны для иммунных процессов. Межклеточные взаимодействия бактерий и растений позволяют им обмениваться метаболитами, делают доступным азот атмосферы для растений, определяют комплекс иммуногенных процессов.
Детальное изучение механизмов межклеточных взаимодействий началось после открытия рецепторных белков - лектинов, которые связываются с определенными углеводными участками мембранных гликопротеинов, называемыми антигенными детерминантами. Благодаря взаимодействию лектинов с такими участками осуществляется межклеточный контакт.
Тонкая структура Оантигенов определяет иммуноспецифичность клетки. Замечено, что различные по строению моносахариды и их производные играют роль иммунохимической доминантной группировки (Томшич, 1999).
Например, на поверхности нормальных лейкоцитов и эндотелиальных клеток сосудов находится антигенная детерминанта - сиалил-Льюис X. В лимфатических узлах, на поверхности эндотелия мелких вен, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов обнаружен другой лиганд селектинов - сиалил-6-сульфо-Льюис X. Показано, что сиаловая кислота в этом лиганде может находиться в открытой или циклической форме (Chikako, 1999). Последняя образуется под действием циклазы сиаловых кислот - Са2+-зависимого фермента, работающего в слабощелочных условиях. Циклические лиганды не способны связываться с селектином, межклеточные взаимодействия осуществляют только открытые формы, которые возникают за счет гидролитического раскрытия кольца. Важно, что процесс циклизации обратим: одни и те же лиганды могут и останавливать адгезию, и вновь ее запускать.
Участие углеводных компонентов рецепторов, находящихся на поверхности клетки в межклеточных взаимодействиях является общим принципом в адгезии клеток независимо от их происхождения. У бактерий О-антигены несут липополисахариды, расположенные во внешней мембране. Показано, что бактериальные ЛПС посредством углеводной детерминанты специфически взаимодействуют с белковым фактором нормальной сыворотки, не являющимся иммуноглобулином. Они образуют комплекс, обладающий биологическими свойствами, сходными со свойствами комплекса антиген-антитело (Книрель, 1986).
В работе (Schmidt, 1970) показана зависимость биологической активности ЛПС различных микроорганизмов от химической структуры и конформации липида А. Доказано, что для проявления полного токсического эффекта необходимо присутствие дисахаридной основы, несущей две фосфатные группы и шесть остатков жирных кислот, расположенных так же, как в липиде А бактерий Escherichia coli. Молекулы, лишённые одного из этих компонентов или имеющие другое их распределение, заметно менее активны или вовсе неактивны. Причем, отсутствие уже одного остатка жирной кислоты ведет к изменению ориентации ацильного заместителя.
В липиде A E.coli обнаружено пять антигенных детерминант (эпитопов) (Galanos, 1972). Один из них связан с 1,4 -дифосфорилированным Р-1,6-связанным глюкозаминовым дисахаридом, два других - с 1- и 4 -монофосфорилированными дисахаридами, и еще два - с 1- и 4-монофосфатами D-глюкозамина, причем их специфичность не зависела от природы моносахарида. Существенное влияние на специфичность связывания оказывают фосфатные группы, т.к. они участвуют в создании иммунореактивной конформации липида A (Galanos, 1972).
В последние годы появились пионерские работы Hakomori, в которых доказано, что на первой стадии адгезии животных клеток происходит углевод-углеводное взаимодействие (Hakomori, 1999, 2000, 2001). Гликосфинголипиды, образуя кластерные структуры на поверхности мембран, взаимодействуют с комплементарными гликосфинголипидами других клеток. Этот процесс активирует сигнальные системы клетки, вызывая ее фенотипические изменения. По мнению автора, углевод-углеводное взаимодействие происходит за счет образования межмолекулярных водородных связей (Hakomori, 2001). Исследования Hakomori привели к открытию нового типа молекулярного распознавания.
Возможность углевод-углеводных взаимодействий у бактерий и дрожжей подтверждают работы российских исследователей. Их внимание привлек зимозан, полисахаридный комплекс из дрожжей Saccharomices cerevisiae. На 90% по весу зимозан состоит из полисахаридов, и только на 10% из белка. Полисахарид (ї(І-З)глюкан, содержит 65% 1-6 разветвленного маннана, 25% сильно разветвленного маннана. Исследователи обнаружили, что процесс взаимодействия зимозана с макрофагом, опосредованного лектинами макрофага, стимулируется добавлением гликоконъюгата Мап-РАА (манноза-полиакриламид). Было доказано, что гликоконъюгат связывается с зимозаном за счет углевод-углеводного взаимодействия. На это указывали следующие результаты: 1) обработка зимозана протеазой или щелочью не влияла на связывание с гликоконъюгатом; 2) напротив, действие перйодатом разрушало связь 3) р-глюкан связывался с гликоконъюгатом аналогично зимозану. Связывание было обратимым, Са -зависимым, его ингибировали метилманнозид и гликопротеины с N-цепями, богатыми маннозой. Гликопротеины с терминирующей маннозой, их гликопептиды, олигосахариды, неогликоконъюгаты, сконструированные из полиакриламида и маннозных цепей - все эти соединения связывали зимозан или ингибировали его связывание с Мап-РАА. Поскольку маннозные цепи гликопротеинов являются типичными периферическими компонентами клеточных мембран животных, а глюканы являются таковыми для клеточных стенок бактерий и дрожжей, полученные результаты могут стимулировать поиск и изучение гликопротеин-полисахаридных взаимодействий в процессах адгезии клеток in vivo. (Bovin, 1995; Michalchik, 1997; Oleinikov, 1999; Michalchik, 2000.). Таким образом, в свете открытий последних лет, нельзя исключить возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций.
Клеточная поверхность азоспирилл имеет сложный состав, что не позволяет уверенно определить структуры, ответственные за специфические взаимодействия бактериальных клеток между собой и с корневой поверхностью, а также механизмы этих взаимодействий. На наш взгляд, для исследования такого рода комплексных систем целесообразно использовать упрощенные экспериментальные модели, с помощью которых можно воспроизвести отдельные поверхностные структуры бактерий и изучить их участие в межклеточных взаимодействиях.
Методика очистки препарата липополисахарида от белка
Липосомы получали инжекцией спиртового раствора яичного фосфатидилхолина с последующей ультразвуковой обработкой взвеси (Марголис, 1986). Для этого в дистиллированную воду при 50С добавляли 10 %-ный этанольный раствор яичного фосфатидилхолина ("Биолек", Украина) до его конечной концентрации 1.4 г/л при перемешивании на магнитной мешалке при 500 об/мин. Перемешивание проводили до исчезновения запаха спирта. Полученную суспензию озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе UD-11 ("Elpan", Poland) 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Недиспергированные фосфолипиды удаляли с помощью центрифугирования (центрифуга К-24, Германия) взвеси в течение 10 мин при 8000 об/мин. Липосомы со встроенными в мембрану бактериальными ЛПС получали, как описано выше, проводя инжекцию этанольного раствора яичного фосфатидилхолина в водные растворы ЛПС. Для приготовления липосом, загруженных маркером метиленовым синим (МС), вводили спиртовой раствор яичного фосфатидилхолина в водный раствор красителя с концентрацией ОЛ г/л. Не включившийся в липосомы краситель удаляли диализом против воды в течение суток. Концентрация красителя в растворе, полученном после разрушения липосом без ЛПС, составляла 0.7±0.1 мг/л, липосом с ЛПС - 0.9±0.1 мг/л. Липосомы с индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) готовили инжекцией 10 %-ного спиртового раствора фосфатидилхолина в цитрат-фосфатный буфер (рН=6.0), содержащий ЛПС в концентрации 150 мг/л и ИУК в концентрациях 1; 10; 100 мг/л. Липосомы, загруженные флуоресцеин-натрием (ФН), получали инжекцией спиртового раствора яичного лецитина с концентрацией 5 г/л в 10 М водный раствор красителя. Низкомолекулярные соединения из суспензии липосом удаляли диализом (диаметр пор диализной мембраны 12-14 кДа) в течение двух суток против воды. Определение размеров частиц при агрегации липосом проводили методом динамического рассеяния света (Khlebtsov, 2003) в режиме записи аналогового сигнала с использованием установки, собранной из стандартных компонентов к.ф-м.н Хлебцовым Б.Н. (ИБФРМ РАН). Источником монохроматического света служил гелий-неоновый лазер (ГН-5П, 100%-я линейная поляризация перпендикулярно плоскости рассеяния, мощность 10 мвт, одномодовый режим излучения, ОАО "Плазма", Россия). Четырехсторонняя кварцевая кювета помещалась в термостатируемый держатель, установленный на гониометре ГО-5. С помощью водяного ультратермостата U7 (MLW, Германия) и контрольного термистора температура в кювете устанавливалась с точностью ±0.1 С. Свет, рассеянный суспензией липосом, принимался оптическим блоком, собранным на базе приставки для люминесцентных анализов к микроскопу ЛЮМАМ И-5 (ФМЭЛ-1М, "Ломо", Россия). Этот блок содержит фокусирующую линзу (на фотоприемнике получается действительное, перевернутое и увеличенное изображение рассеивающего объема), две диафрагмы (I мм и 0.1 мм), фотоумножитель ФЭУ-79 и предварительный усилитель.
Сигнал с усилителя через АЦП L-783 ("L-Card", Россия) записывался в файл на компьютере и затем обрабатывался. Как правило, массив записи составлял ЗхЮ6 отсчетов при частотах оцифровки от 50 до 200 кГц. Для каждого образца подбиралась частота с превышением характерных частот в спектре флуктуации фототока рассеянного света. Оцифрованный сигнал (частота оцифровки в эксперименте 100-200 кГц) обрабатывался с помощью разработанного Б.Н Хлебцовым (ИБФРМ РАН) (Khlebtsov, 2003) алгоритма вычисления корреляционной функции. Автокорреляционная функция флуктуации интенсивности рассеяния света интерпретировалась в терминах монодисперсного приближения: Оценка размера липосом была выполнена по спектру мутности суспензий х=х(Х) (Безрукова, Розенберг, 1981). В небольшом интервале длин волн ДА, спектр мутности можно аппроксимировать соотношением Ангстрема: где n-волновой экспонент. Мутность при этом связана с оптической плотностью суспензии D по формуле: где 1-длина оптического пути. Тогда Поскольку зависимость IgD от \gX линейна, то из набора экспериментальных значений D и соответствующих им X можно по графику Т)(к) найти п, как тангенс угла наклона прямой в координатах IgD и IgL Волновой экспонент является безразмерной функцией двух параметров: где m-относительный показатель преломления частиц, а связан с диаметром частиц d соотношением: где т0-показатель преломления среды. Однако, в интересующем нас диапазоне диаметров частиц 10-500 нм можно пренебречь зависимостью п от а. Зависимость n(d) известна из эксперимента и табулирована (Безрукова, Розенберг, 1981). В рамках описанного выше метода создана программа Size на языке высокого уровня Turbo Basic для расчета размеров липосом со следующим линейным алгоритмом
Оценка влияния Ы-ацетил-О-глюкозамина на адсорбцию экспериментальных моделей на корнях пшеницы
Выделение полисахаридов из биомассы корней пшеницы проводили методом концентрирования этанольного экстракта с последующей гель-фильтрацией (Коннова и др., 2005 г). Навеску корней пшеницы (10 г) перетирали в ступке. Измельченную биомассу переносили в стакан и для фиксации материала заливали пятикратным объемом 96 % горячего этанола на 5 мин, после чего фиксирующий раствор сливали. Затем к растительной биомассе приливали 80 %-ный раствор этанола и выдерживали 20 мин на кипящей водяной бане, периодически помешивая содержимое стеклянной палочкой. После чего первую порцию экстракта сливали через фильтр в сухой стакан, а процедуру экстракции повторяли еще два раза. Все экстракты объединяли и концентрировали упариванием на водяной бане при температуре 40-50 С до конечного объема 20 мл.
Для разделения полисахаридов использовали хроматографическую колонку (2 х 50 см) и носитель Sephadex G-75 ("Pharmacia", Швеция), в качестве элюента - пиридин-ацетатный буфер (0,025 М, рН 4,1). Получали высокомолекулярные и низкомолекулярные полисахар ид содержащие фракции (рис. 4). Элюционные профили при хроматографии строили по оптической плотности продуктов реакции фракций с фенолом и серной кислотой при 490 нм. Концентрацию углеводов в полученных фракциях определяли по калибровочной кривой, предварительно построенной по глюкозе в диапазоне концентраций от 12,5 г/л до 200 г/л (рис. 5). Раствором сравнения при построении калибровочной кривой служила дистиллированная вода, при определении концентрации углеводов - эквивалентный объем водного раствора глюкозы. Измерения проводили на спектрофотометре "Specord М40"
Полученные фракции углеводов высокой низкой молекулярных масс использовали в дальнейших экспериментах. Гидрозоль наночастиц получали трехкратным ультразвуковым дезинтегрированием водной суспензии диоксида кремния ("Fluka", диаметр 0,7 нм) 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Концентрация частиц в гидрозоле составила 1 г/л. Гидрозоль наночастиц, инкрустированных ФН, получали разбавлением исходного гидрозоля 10"5М раствором красителя до конечной концентрации частиц 10 2, 10 3, 10"4 г/л при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч.
Для получения наночастиц, инкрустированных полисахаридами, к суспензии частиц приливали растворы высокомолекулярных или низкомолекулярных фракций растительных полисахаридов до их конечной концентрации 10", 10", 10" г/л при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч.
От проростков пшеницы отделяли целые корни, помещали их в бюксы с 10"5М раствором ФН или суспензией наночастиц, инкрустированных ФН. Корни погружали в среды таким образом, чтобы места их срезов оставались над поверхностью, и выдерживали 1 ч. По окончании инкубации корни экстрагировали водой в течение 1 ч, ценрифугировали 10 мин при 10000 об/мин, отбирали 1 мл супернатанта, смешивали с 5 мл фосфатного буфера рН 8.25 (1:5). Измеряли интенсивность флуоресценции на спектрофлюориметре "Флюорат-панорама-02В" при \ш& 491 нм, мис. 512 нм. Концентрацию ФН определяли по калибровочной кривой. Растворами сравнения для экстрактов служил водный экстракт корней пшеницы с содержанием фосфатного буфера рН 8.25 в соотношении 1:5. Количество флуоресцеин-натрия, включенного в липосомы, оценивали по интенсивности флуоресценции после разрушения липосом детергентом ДСН: 100 мкл 10 мМ раствора ДСН на 1 мл эмульсии липосом с добавлением фосфатного буфера рН 8.25 в соотношении 1:5. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлюориметре "Флюорат-панорама-02В", при Хвозб. 491 им, Х,мис. 512 нм. В качестве контроля использовали спиртовой раствор яичного фосфатидилхолина с концентрацией 5 г/л.
Растворами сравнения для суспензий служила эмульсия липосом, разрушенных таким же количеством ДСН. Включенный в липосомы гетероауксин определяли спектрофотометрически по реакции Сальковского (Паламарчук, 1965) после разрушения липосом детергентом ДСН: 100 мкл 10 мМ раствора ДСН на 1 мл эмульсии липосом, визуально до исчезновения опалесценции.
Методика проведения реакции Сальковского заключается в следующем: 1 мл пробы переносят в пробирку с 2 мл реактива Сальковского (2 мл 0.5 М раствора FeCb + 100 мл 37%-ной НСЮ4) и тщательно перемешивают, окраска развивается в течение 1 ч.
Оптическую плотность окрашенных проб измеряли на спектрофотометре «Specord М40» при 490 нм, / - 1 см. Концентрацию гетероауксина в пробах определяли по калибровочному графику, построенному в диапазоне концентраций вещества 10"-10 2 г/л. Раствором сравнения при построении калибровочной кривой служила дистиллированная вода, при определении концентрации гетероауксина, включенного в липосомы, - эмульсия липосом, разрушенных ДСН.
Экспресс-метод расчета дипольного момента произвольной молекулы
Для вычисления энергии взаимодействия молекулы со средой необходимо рассчитывать дипольные моменты. Известно, что электростатическое взаимодействие зарядов молекулы со средой описывается в рамках модели Кирквуда, основанной на приближении реактивного поля Онзагера (Hopfinger, Battershell, 1976). В соответствии с этой моделью энергия Е взаимодействия со средой / (l=w соответствует водной среде, 1=т - гидрофобной среде активного центра) описывается формулой: где -диэлектрическая проницаемость среды /, //-дипольный момент молекулы, г - радиус полости, образованной молекулой в растворителе /. Полагается, что энергия равна /, если полость целиком находится в растворителе /. На границе раздела фаз, когда часть полости находится в воде, а часть - в липофильной среде, полагается, что энергия может быть найдена путем интерполяции. При этом: После несложных преобразований получим, что интерполяция E(Z) кубическим полиномом по Z в интервале [0,2г] с учетом (3.10) и (3.11) дает: Для оценок электронного распределения в молекуле часто используют малликеновские заряды на атомах. Политзер предложил более реалистичное нахождение заряда, как интеграла от электронной плотности по области, отнесенной к данному атому (Заградник, Полак, 1979; Mullay, 1986) предложен метод, позволяющий рассчитать заряды Политзера из принципа выравнивания электроотрицательностей. На основе этого метода разработан высокоэффективный алгоритм расчета зарядов Политзера (Кузнецов и др., 1989). Для расчета дипольных моментов было предложено макроприближение (Бурштейн, 1987): где Q; - эффективные локализованные (точечные) заряды, в частности заряды на атомах, рассчитанные по указанному алгоритму и заряды на неподеленных парах. Поскольку уже само определение точечного заряда в молекуле неоднозначно, точное определение положения и величины зарядов неподеленных пар затруднительно.
Мы принимали, что неподеленные пары атомов, способных к образованию водородных связей, лежат на сфере нормального ковалентного радиуса, описанной вокруг ядра. Заряды на неподеленных парах, а также на электронодонорном атоме принимались равными друг другу. Сумма этих зарядов полагалась равной величине заряда Политзера для электронодонорного атома. Таким образом, рассчитанный сначала по схеме Политзера атомный заряд на электронодонорном атоме затем частично "размывался" по неподеленной паре. Сравнение расчетных и экспериментальных данных (Радциг, Смирнов, 1980) проведено в таблице 1. S=0.42. Программа DIP для расчёта дипольных моментов молекул была написана на языке Turbo Basic профессором Кузнецовым П.Е. Знание пространственной геометрической структуры О-ПС бактериального липополисахарида позволяет предполагать возможные механизмы его участия в процессах межклеточного взаимодействия. Поэтому, на первом этапе исследований нами проводилось компьютерное моделирование пространственной структуры данного О-ПС, который является D-рамнаном, представленным пентасахаридными звеньями рамнозы (рис. 8) Это биополимер, молекулярная масса которого колеблется от десятков до сотен кДа, поэтому интересно было моделировать конформацию О-ПС, последовательно наращивая пентасахаридные звенья с различными вариантами сочленения рамнозы между собой. В расчетной модели имитировалась малая подвижность конца полисахарида, связанного с «кором» (примембранной частью молекулы ЛПС), что соответствует его состоянию в бактериальной мембране. Конформация одного звена D-рамнана, представленного пентарамнозой, полученного в результате окончательной геометрической оптимизации в периодическом боксе с водой, показана на рис. 9. Она соответствует времени 210 ps и минимальному значению энергии. На рис. 10 представлена конформация двух звеньев D-рамнана, полученная в результате геометрической оптимизации молекулы сначала в вакууме, а затем в периодическом боксе с водой.
Полученные конформации представляют собой достаточно устойчивые в энергетическом плане структуры, имеют форму псевдоспирали и стабилизированы внутримолекулярными водородными связями. Конформации четырех и пяти звеньев D-рамнана, полученные в результате геометрической оптимизации сначала в вакууме, а затем в периодическом боксе с водой представлены на рис. 11 и 12, соответственно.
