Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Основные свойства белковых молекул 9
1. Состав и строение белков 9
2. Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля 12
Глава 2 Рассеяние света в растворах биополимеров 15
1. Основные положения теории рассеяния света 15
2. Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц 23
Глава 3 Трехкомпонентные лиотропные системы (Обзор литературных данных) 26
1. Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах. Теория Скэтчарда 26
2. Исследования рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы 28
Глава 4 Экспериментальное исследование растворов альбуминов, содержащих ионы меди, свинца и кадмия 38
1. Объекты исследования и подготовка образцов 38
2. Описание экспериментальной установки 43
3. Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых металлов 49
4. Зависимость эффективной массы рассеивающих частиц в водных растворах белков от поверхностного заряда макромолекул и ионной силы раствора 53
5. Поляризационные свойства исследуемых растворов при изменении водородного показателя и ионной силы 57
6. Влияние температуры на свойства рассеивающих частиц в растворах, содержащих ионы тяжелых металлов 62
Глава 5 Обсуждение экспериментальных результатов 67
1. Особенности процесса адсорбции ионов металлов с различными ионными радиусами на поверхности белковых молекул 67
2. Изменение характера межмолекулярного взаимодействия в растворах белков при наличии ионов тяжелых металлов. Образование дипольных кластеров 70
Заключение 74
Приложение: 76
1. Тяжелые металлы как фактор влияния на окружающую среду 76
2. Геохимические особенности некоторых ТМ и их роль в жизни человека 80
3. Основы экологического контроля 85
Выводы 88
Литература 90
- Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля
- Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц
- Исследования рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы
- Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых металлов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой одну из наиболее актуальных проблем физики конденсированного состояния вещества. Межмолекулярные взаимодействия и динамика белковых макромолекул играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем. В условиях современной жизни особенно интересным представляется изучение неизбежного влияния на эти системы различных отрицательных факторов и токсических воздействий, среди которых особое внимание следует уделить воздействию тяжелых металлов (ТМ), т.е. металлических ионов, обладающих большими ионными радиусами.
Сравнительно недавно было обнаружено новое явление - образование макромолекулярных кластеров в растворах белка в присутствии солей тяжелых щелочных металлов RbCl и CsCl. Поведение белков в растворах, представляющих собой лиотропные жидкокристаллические системы, определяется сильным электростатическим взаимодействием между зарядами на поверхности макромолекул. Однако оказалось, что при определенных условиях (когда силы заряд-зарядового взаимодействия экранируются ионами ТМ) в таких системах, как и в термотропных жидких кристаллах, существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, что приводит к изменениям как статических, так и динамических параметров молекул. Таким образом, несомненный интерес представляло детальное исследование механизма подобного поведения белковых молекул при наличии в растворе ионов металлов с различными значениями заряда и ионного радиуса.
Исследуемая проблема появляется на стыке таких областей естествознания как физика, химия, биология, медицина и экология, а потому представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для практического понимания механизмов патологических изменений в биологических объектах при токсических воздействиях. С другой стороны, именно поэтому исследования носят преимущественно поисковый характер, а полученные результаты пока весьма сложны для однозначной интерпретации в рамках существующих теорий или построения собственной последовательной теории.
Цели и задачи работы
Целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в жидких системах растворов белковых макромолекул, содержащих ионы тяжелых металлов. Для этого ставился ряд практических задач:
Исследовать экспериментально явление возникновения макромолекулярных кластеров в растворах яичного и сывороточных альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов: свинца, меди и кадмия.
Изучить влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия.
Изучить влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, в области изоэлектрической точки белка.
Показать, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе определенным образом связаны с величиной и знаком поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе.
Предложить физическую модель, объясняющую обнаруженное явление.
Научная новизна
С помощью метода светорассеяния впервые проведено
систематическое исследование нового явления образования
макромолекулярных кластеров в водных растворах яичного и сывороточных альбуминов в присутствии солей свинца, меди и кадмия при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, водородный показатель раствора (поверхностный заряд частиц) и ионная сила (концентрация ионов ТМ).
Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ.
Впервые показано, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе: электронная поляризуемость, оптическая анизотропия, коэффициент деполяризации, - существенным образом связаны с величиной и знаком поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе, и имеют экстремумы в изоэлектрической точке.
Предложена физическая модель, объясняющая явление агрегации белковых макромолекул на основании модели сильных диполь-дипольных взаимодействий. Сделано предположение о том, что обнаруженный эффект обусловлен началом фазового перехода в упорядоченную мезофазу, связанного с преобладанием диполь-дипольных взаимодействий над силами кулоновского отталкивания.
Практическая ценность
Изученное в работе поведение биополимерных макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей позволяет установить молекулярный механизм патологических изменений в биологических объектах, связанный с токсическим воздействием тяжелых металлов на живые объекты. Материалы диссертации могут быть использованы при разработках способов контроля качества органических жидкостей и физических методов диагностики распространенных заболеваний, а также для создания диагностических приборов.
Защищаемые положения
Впервые обнаружено и детально исследовано явление возникновения макромолекулярных кластеров в растворах яичного и сывороточных альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов: свинца, меди и кадмия.
Изучено влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия.
Гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка подтверждена на основании физической модели агрегации макромолекул вследствие сильных диполь-дипольных взаимодействий.
Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру надмолекулярных агрегатов, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, и подтверждено существование температурного эффекта в области изоэлектрической точки белка, связанного с процессом разрушения кластеров.
Апробация работы и публикации
Основные результаты работы были доложены на конференциях «Физические проблемы экологии» (Москва, 2001), «Ломоносовские чтения 2002» (Москва, 2002), «Conference on Lasers, Applications and Technologies IQEC/LAT'2002» (Moscow, 2002), а также представлены на конференциях ALT-99, LALS-2002, ALT-02, ALT-03.
По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ: 7 статей и 8 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, приложения, выводов и списка литературы, содержащего 112 источников. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 39 рисунков.
Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля
Макромолекулы, полимерные цепочки которых содержат ионизируемые боковые группы, называются полиэлектролитами. К ним относятся также белковые глобулы в растворе. Растворы электролитов описываются с помощью простейшей идеализированной модели, в которой ионы рассматриваются " как твердые шарики, погруженные в сплошную среду с диэлектрической проницаемостью е и взаимодействующие друг с другом по закону Кулона. Изолированный ион с зарядом Ze (Z - валентность иона, е — заряд электрона) создает на расстоянии г в чистой воде электрический потенциал Поскольку раствор в целом является электрически нейтральным, то около каждой заряженной группы на поверхности белковой молекулы должен находиться противоположно заряженный ион. Согласно теории Дебая-Хюккеля [11,17,21], исходящей из классической статистической механики и электростатики, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий. Т.о., в среде, содержащей ионы противоположного знака потенциал ф(г) имеет вид: Плотность этой атмосферы, характеризуемая параметром se. в данной теории, определяется общей концентрацией ионов в растворе (ионной силой) ju: Здесь є - заряд электрона, z/ — валентность иона, с,- — молярная концентрация ионов, є. - диэлектрическая проницаемость раствора. Параметр ае имеет смысл обратной величины эффективного радиуса ионной атмосферы, т.е. определяет расстояние до иона, на котором осуществляется полная экранировка кулоновских взаимодействий. Ионная сила характеризует общее число ионных зарядов в единице объема независимо от их знаков. Суммарный заряд на молекуле белка определяется концентрацией свободных протонов в растворе, которую обычно характеризуют величиной рН: Значение рН меняется при добавлении в раствор кислоты или щелочи, при этом в среде появляется либо избыток, либо недостаток протонов по сравнению с чистой водой. Концентрация водородных ионов в чистой воде составляет 70" моль/л, т.е. для нейтральной среды рН=7, для кислойрН 7, для основнойрН 7 [35]. Для каждого белка существует определенное значение рН, при котором молекула в целом электронейтральна - так называемая изоэлектрическая точка (рГ). При значениях рН р1 белок будет обладать отрицательным суммарным зарядом, при рН р1 - положительным. (Для сывороточного альбумина pl=4,9).
Вообще говоря, группы на поверхности белковой молекулы взаимодействуют сложным образом, и их ионизация происходит не независимо. Для анализа связи рН раствора с суммарным зарядом на белке составляется уравнение для идентичных групп [19]: Здесь pK — характеристическая константа ионизации для данного класса, активности; а - доля ионизованных групп; W - полная электростатическая свободная энергия, заимствованная из теории Дебая-Хюккеля, или работа по перемещению всех зарядов на поверхность сферы радиуса Ъ и сообщению ей равнораспределенного заряда: а - расстояние предельного сближения белковой молекулы и иона (часто полагают а Ь+2,5 А). Т.о., Величина рК зависит от взаимодействия данной группы с остальными, а следовательно, от среднего суммарного заряда Z. Таким образом, уравнение (7) выражает нелинейную зависимость величины Z от Я. Полученное уравнение основывается на некоторых допущениях, поэтому не совсем точно согласуется с экспериментом [19,21]. Во-первых, форму молекул только приближенно можно считать сферической. Во-вторых, распределение заряда вблизи поверхности молекулы нельзя считать равномерным. Наконец, добавление любого электролита в раствор белка приводит к поляризации молекул, поэтому локальная диэлектрическая проницаемость не имеет постоянного по объему значения. На практике для определения суммарного заряда на белке в растворе при различных рН используют данные по титрованию [6,25] или электрофорезу [21].
Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц
Уравнение рассеяния (12) позволяет, в принципе, определить молекулярную массу малых невзаимодействующих частиц: здесь К — фактор Кабанна. Однако в большинстве полимерных растворов сказывается влияние межмолекулярных взаимодействий. Эйнштейном на основе термодинамических соображений было получено более общее выражение для R90 [18]. Рассматривая рассеяние на флуктуациях диэлектрической проницаемости, обусловленных флуктуациями AN числа рассеивающих частиц в элементарных объемах, малых по сравнению с Л3, но содержащих еще достаточное число молекул, он пришел к выражению: Зависимость коэффициента рассеяния от имеет понятный физический смысл: разность осмотических давлений в соседних областях препятствует развитию флуктуации концентрации в растворе, т.о. чем больше , тем меньше развиты флуктуации, тем меньше коэффициент рассеяния. Для идеальных растворов, в которых скомпенсированы межмолекулярные взаимодействия, выполняется закон Вант-Гоффа М С учетом этого выражения (30) сводится к (11). Осмотическое давление раствора как функцию концентрации можно представить в виде Полученная зависимость R90 от с делает невозможным определение М путем измерения Rg0 при одной концентрации. Необходимо провести измерения для нескольких с и экстраполировать результаты к с=0. Т.о., получаем: Оптическая постоянная раствора Н находится путем рефрактометрических измерений —— (12). Экстраполяцию выполняют графически, откладывая как функцию с. Наклон прямой позволяет вычислить коэффициент В. Напомним, что второй вириальный коэффициент характеризует степень неидеальности раствора и учитывает парные межмолекулярные взаимодействия в растворе [15]. Термодинамическая теория растворов макромолекул дает следующее выражение для В: где V0- исключенный объем, т.е. объем, из которого молекула вытесняет все остальные. Отметим также, что мультиплетные взаимодействия, описывающиеся третьим вириальным коэффициентом, проявляются в искривлении прямых, выражающих зависимость от с. Парциальное разложение осмотического давления строго применимо, вообще говоря, лишь для растворов нейтральных частиц, потенциал притяжения между которыми является ван-дер-ваальсовым и спадает как г 6. Белковые же молекулы в растворах при всех значениях рН, кроме изоэлектрической точки, являются заряженными.
Потенциал взаимодействия между ними является кулоновским и спадает как г"1. Тем не менее, как уже было указано, вокруг макроиона, согласно теории Дебая-Хюккеля, образуется атмосфера противоионов, экранирующая кулоновское взаимодействие. И если рассматривать разбавленные растворы (с 5%), в которых дебаевский радиус экранировки Го с/, d — среднее расстояние между макроионами растворенного вещества, то изложенная выше теория оказывается применима к белковым растворам. При этом из-за отталкивания одноименно заряженных макроионов будет расти исключенный объем, и В, соответственно, будет иметь большие значения, чем для раствора нейтральных молекул. Следовательно, можно ожидать определенной зависимости В от заряда на белке Z и ионной силы раствора //. Взаимодействие макроионов в растворе, содержащем кроме низкомолекулярного растворителя еще и третью компоненту - сильный электролит, было рассмотрено в теории Скэтчарда [4,5,6,11,17,19]. Согласно Скэтчарду, парные взаимодействия в таких растворах описываются вторым вириальным коэффициентом в разложении для свободной энергии, выражение для здесь Vj — удельный объем растворителя, М2 — масса макроиона, гпз — концентрация ионов соли. Параметры Ду характеризуют эффект исключенного объема и взаимодействие между парами ионов (индекс 2 - макромолекула белка, 3 - ион соли). Очевидно, что коэффициент взаимодействия меняется с ростом суммарного заряда на белке по параболическому закону (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке [11,17]. Параметр f522 обычно незначителен, а третий член в (36) может принимать достаточно большие значения, так что при существенной концентрации соли в растворе В может стать отрицательным [54,84]. При возрастании ионной силы (т3) вокруг заряженной молекулы белка коэффициент В уменьшается и стремится к величине, характерной для полностью незаряженных молекул и определяемой ван-дер-ваальсовыми силами, однако параболический вид зависимости В(рН) сохраняется. приведен вид графиков В(рН) для раствора сывороточного альбумина HSA в присутствии соли NaCl. С увеличением концентрации соли наблюдается смещение минимума кривых от изоэлектрической точки в сторону меньших рН (положительных Z). Это явление было объяснено в работе Эдсолла и др. [6] более сильным химическим сродством ионов СГ с поверхностью белка.
По смещению минимума кривых B(Z) в этой работе приближенно оценивалось изменение эффективного значения величины изоэлектрической точки pi, соответствующей поверхностному заряду Z=0, и число мест сильного связывания ионов СГ на поверхности белка (смещение на / рН соответствует изменению заряда на 5-6 единиц). Среди немногочисленных работ, относящихся к исследованиям рэлеевского рассеяния в растворах белков, основополагающей является работа Эдсолла и др. [6]. В этой работе были исследованы водные растворы бычьего сывороточного альбумина (BSA) в присутствии солей NaCl и CaCl при различных величинах поверхностного заряда белка. Были получены зависимости параметра межмолекулярного взаимодействия от величины суммарного заряда на белке {Рис.3). В изменяется нелинейно с минимумом в изоэлектрической точке, что подтверждает теорию Скэтчарда, при этом оказалось, что масса белка не зависит от величин заряда и ионной силы. Следует отметить, что в данной работе не учитывались поляризационные свойства макромолекул белка, т.е. фактор Кабанна полагался равным единице. В серии работ, проведенных в нашей лаборатории за последние несколько лет [44,47,54,58,59,61,62,82,84], были исследованы растворы сывороточного и яичного альбуминов, гемоглобина, 7"глбулина, лизоцима и белка-фермента липоксидазы. При этом было показано, что поляризационные свойства белковых макромолекул зависят от ионной силы раствора и суммарного заряда на поверхности белковой глобулы существенно нелинейным образом.
Исследования рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы
Среди немногочисленных работ, относящихся к исследованиям рэлеевского рассеяния в растворах белков, основополагающей является работа Эдсолла и др. [6]. В этой работе были исследованы водные растворы бычьего сывороточного альбумина (BSA) в присутствии солей NaCl и CaCl при различных величинах поверхностного заряда белка. Были получены зависимости параметра межмолекулярного взаимодействия от величины суммарного заряда на белке {Рис.3). В изменяется нелинейно с минимумом в изоэлектрической точке, что подтверждает теорию Скэтчарда, при этом оказалось, что масса белка не зависит от величин заряда и ионной силы. Следует отметить, что в данной работе не учитывались поляризационные свойства макромолекул белка, т.е. фактор Кабанна полагался равным единице.
В серии работ, проведенных в нашей лаборатории за последние несколько лет [44,47,54,58,59,61,62,82,84], были исследованы растворы сывороточного и яичного альбуминов, гемоглобина, 7"глбулина, лизоцима и белка-фермента липоксидазы. При этом было показано, что поляризационные свойства белковых макромолекул зависят от ионной силы раствора и суммарного заряда на поверхности белковой глобулы существенно нелинейным образом.
Особое внимание следует обратить на результаты, полученные для липоксидазы и лизоцима [54,58,59,84]. Как показали опыты, липоксидаза плохо растворяется в воде и имеет высокие значения интенсивности поляризованной компоненты рассеяния. При низких значениях ионной силы (ju 0,001 моль/л) без добавления соли были получены отрицательные значения В и величины массы до 32 10бг/молъ. Увеличение концентрации ионов соли NaCl до 75000 молекул на одну молекулу белка (ju=0,l моль/л) позволило определить значение собственной массы липоксидазы и получить положительные значения второго вириального коэффициента. Найденная в результате молекулярная масса 97000 г/моль в пределах ошибки совпадает с табличными значениями [11,17].
Для белка лизоцима зависимость параметра В(рН) также меняет знак при увеличении ионной силы (Рис.4). Это указывает на сильные взаимодействия между ионами электролита и молекулами белка и характеризуется ростом (по модулю) третьего члена формулы Скэтчарда (36). При этом коэффициент взаимодействия сохраняет нелинейную зависимость с экстремумом при рН 3,5, что согласуется с формулой
Скэтчарда. С увеличением ионной силы, определяемой концентрацией соли, зависимости В(рН) становятся более пологими, что также согласуется с данными работы [6].
Основной вклад в интенсивность рассеяния света в растворах макромолекул дает рассеяние на флуктуациях концентрации, которые, как показывают эксперименты, резко возрастают при перезарядке молекул с изменением водородного показателя среды. При этом, очевидно, должны изменяться и поляризационные характеристики растворов, связанные с флуктуациями ориентации анизотропных молекул. В работах [44,47,54] были проведены измерения коэффициентов деполяризации при различных величинах рН и различных ионных силах. На Рис.5 представлены некоторые из полученных зависимостей. Как можно видеть, зависимости Av(pH) имеют существенно нелинейный характер с экстремумом в окрестности изоэлектрической точки белка. Этот экспериментально обнаруженный факт был положен в основу простого и эффективного метода определения изоэлектрической точки белков, не требующего большого количества вещества [48]. При возрастании ионной силы исследованных растворов, определяемой концентрацией соли NaCl, характер зависимостей Av(pH) несколько изменяется, кривые становятся более пологими.
Из экспериментально определенных значений коэффициента деполяризации и электронной поляризуемости а для некоторых белков были рассчитаны величины компонент тензора поляризуемости и оптической анизотропии (14,16,17) при различных значениях водородного показателя раствора {Рис.6,7). На полученных графиках также четко выражен экстремум, который совпадает с соответствующей изоэлектрической точкой.
Как было показано в работах [71,76,77,78], характер зависимости В(рН) резко изменяется в присутствии соли тяжелого щелочного металла {Рис.8,9). Наблюдаются экстремумы кривых В(рН), но вместо минимума в области изоэлектрической точки В имеет максимальную величину, причем с ростом ионной силы раствора происходит рост максимума В и смещение его в сторону отрицательных значений Z (больших рН).
На основании полученых данных было сделано предположение [71,76], что подобное явление может быть связано с размерами малых ионов, присутствующих в системе. В случае белкового раствора, содержащего соль легкого натрия, ионы хлора (СГ), обладающие большим ионным радиусом, слабее удерживают гидратную оболочку по сравнению с ионами Na+. Ионный радиус СГ составляет 1,75 A, a Na+ 0,8 А, в результате ион хлора прочнее связывается с поверхностными группами белка, чем Ncf. Поэтому при увеличении ионной силы минимум зависимостей B=f(pH) сдвигается в сторону меньших рН, соответствующих большему положительному заряду на белке, аналогично тому, что наблюдалось в работе Эдсолла [6].
Сравнивая относительную энергию взаимодействия заряженного иона и дипольной молекулы воды с тепловой энергией (Рис.35), можно сделать вывод, что ионы щелочных металлов, обладающих значительной массой и большими ионными радиусами (например, для рубидия Rb+ и цезия Cs+ 1,5 и 1,7 А соответственно), будут также сравнительно слабо удерживать гидратную оболочку. Это должно привести к тому, что процессы адсорбции тяжелых ионов Rb+ и Cs+ и легкого Na+ на поверхности белка будут существенно различаться. Эффект смещения, который наблюдался в [44,76,84], был объяснен адсорбцией ионов Cs+ на белке.
Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых металлов
Как было показано в Главе III, характер межмолекулярного взаимодействия существенно изменяется при наличии в растворе ионов тяжелого щелочного металла. В настоящей работе были проведены детальные исследования обнаруженного явления в системах с нещелочными ТМ в узком диапазоне концентраций при изменении водородного показателя в окрестности изоэлектрической точки белка.
Ниже приведены зависимости второго вириального коэффициента В от поверхностного заряда белка Z (рН) для человеческого сывороточного альбумина (HSA) в растворе хлорида меди (Рис.15) и для бычьего сывороточного альбумина (BSA) в растворе ацетата свинца (Рис.16) при различных концентрациях соли (различных ионных силах). Для сравнения на каждом графике показана кривая, соответствующая "чистому" раствору белка без третьей компоненты. Как можно видеть, в присутствии ионов Си++ и РЬ++ в растворе характер зависимости В(рН) также существенно изменяется, аналогично тому, что наблюдалось в случае щелочных ТМ.
Как можно видеть из Рис. 16 (кривая 2), при малых ионных силах, определяемых концентрацией соли свинца, коэффициент взаимодействия В с ростом рН изменяется по параболическому закону с минимумом в области изоэлектрической точки, причем принимает отрицательные значения. Можно предположить, что это происходит за счет роста третьего члена в формуле Скэтчарда (36), характеризующего взаимодействия между макроионами и ионами соли.
При дальнейшем увеличении ионной силы вид зависимости В(рН) резко меняется, наблюдается рост В с ярко выраженным максимумом в области изоэлектрическои точки, причем с увеличением ионной силы раствора происходит рост максимума В. Как будет показано в Главе V, это связано с тем, что изменяется характер взаимодействия частиц, и начинают играть роль диполь-дипольные взаимодействия. Заметим, что в области больших положительных и отрицательных зарядов на белке коэффициент В имеет близкие численные значения для всех //. Кривые с максимумом в изоэлектрическои точке характеризуют, по-видимому, взаимодействие между сформировавшимися в растворе макромолекулярными комплексами.
Аналогичные эксперименты были проведены с растворами яичного альбумина в присутствии ацетата свинца (Рис.17) и бычьего сывороточного альбумина в присутствии сульфата кадмия (Рис.18). Во всех случаях коэффициент взаимодействия изменяется нелинейно с минимумом в изоэлектрическои точке, уменьшаясь с ростом ионной силы, причем добавление соли делает кривые зависимостей более пологими.
Согласно исследованиям водных растворов различных белков методом светорассеяния, масса белковых макромолекул в растворе остается практически постоянной с изменением поверхностного заряда на белке [6,47,54]. Тем не менее, как было показано в Главе III, это утверждение несправедливо, если в растворе присутствуют ионы тяжелого щелочного металла [76,77,78]. В нашей работе из экспериментальных данных для параметра рассеяния (33) были рассчитаны эффективные значения массы рассеивающих частиц (34).
На Рис.14 приведены концентрационные зависимости параметра рассеяния для раствора BSA, содержащего ацетат свинца при различных рН в сравнении с раствором альбумина в чистой воде. Очевидно, что масса рассеивающих частиц вырастает почти на два порядка в присутствии соли ТМ (величина, обратная массе, определяется точкой пересечения с осью ординат).
Действительно, на полученных зависимостях М(рН) для растворов человеческого сывороточного альбумина в присутствии хлорида меди {Рис.19) и бычьего сывороточного альбумина в присутствии ацетата свинца {Рис.20) хорошо выражен рост массы при увеличении ионной силы. При этом зависимости принимают нелинейный характер в присутствии соли ТМ и имеют максимум в области, близкой к изоэлектрической точке. Максимум коэффициента межмолекулярного взаимодействия смещен относительно максимума массы примерно на 1,5 ejx.pH.
Заметим, что при малой ионной силе {Рис.20, кривая 2) значения массы рассеивающих частиц примерно вдвое превышают молекулярную массу чистого альбумина, что позволяет сделать предположение об образовании в растворе макромолекулярных комплексов из двух-трех молекул белка.
Эксперименты, проведенные для растворов яичного альбумина (Egg) в присутствии ацетата свинца (Рис.21) и BSA в присутствии сульфата кадмия (Рис.22), также качественно подтверждают изменение характера зависимости эффективной массы от поверхностного заряда макромолекулы в области изоэлектрической точки. Масса рассеивающих частиц в растворах с солями ТМ не остается постоянной, как это наблюдается в растворах с NaCl, а резко возрастает в области, соответствующей нулевому суммарному заряду на белке 2=0, причем максимум значений М возрастает с ростом ионной силы ц.
Полученные результаты хорошо согласуются с данными работ [76,77,78] и могут служить подтверждением обнаруженного нового явления — возникновения надмолекулярных структур (кластеров) в белковых растворах в присутствии ионов тяжелого металла.
