Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Взаимодействие тетрациклина с ионами металлов (обзор литературы) 15
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
Глава 3. Результаты исследования спектров кругового дихроизма тетрациклина с ионами металлов 38
3.1. Влияние депротонирования на конформацию молекулы тетрациклина 38
3.2. Спектры КД водных растворов комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов 48
3.3. Особенности образования комплексов тетрациклина с кальцием и самарием 55
3.4. Влияние одновалентных катионов на процесс образования комплексов тетрациклина с ионами самария 66
3.5. Влияние растворителя на образование комплексов тетрациклина с ионами лантанидов 74
Глава 4. Оптическая и ЯМР-спектроскопия соединений тетрациклина с лантанидами 85
4.1. Оптическая спектроскопия комплексных соединений тетрациклина с европием 85
4.2. Изучение образования комплексов тетрациклина с ионами лантанидов методами ЯМР спектроскопии 94
4.3. Математические моделирование конформаций тетрациклина на ЭВМ 97
Глава 5. Применение результатов исследований комплексообразования тетрациклина в экологии, фармакологии и медицине 103
5.1. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина 105
5.2. Возможность определения тяжёлых металлов в природных водоёмах 110
Заключение 111
Список печатных работ соискателя по теме диссертации 114
Список литературы
- Спектры КД водных растворов комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов
- Влияние одновалентных катионов на процесс образования комплексов тетрациклина с ионами самария
- Изучение образования комплексов тетрациклина с ионами лантанидов методами ЯМР спектроскопии
- Возможность определения тяжёлых металлов в природных водоёмах
Введение к работе
Исследование специфичности связывания ионов металлов с биоорганическими молекулами является актуальным направлением современной биофизики и ряда смежных наук. Комплексные соединения ионов металлов являются непосредственными участниками целого ряда процессов, протекающих в живых организмах. Они играют центральную роль в переносе кислорода и углекислого газа, участвуют в процессе электронного транспорта в хлоропластах и в митохондриях, в ферментативном катализе и во множестве других процессов. Присутствие катионов металлов в водной фазе влияет на физико-химические свойства, фазовое состояние биомембран и их компонент, сказывается на регуляции работы ферментов. Научное обоснование селективности связывания ионов металлов биологическими молекулами важно для более глубокого понимания закономерностей организации живой материи, разгадки молекулярных механизмов процессов само сборки, самоорганизации и самовоспроизведения структур, характерных для разнообразных биосистем. С другой стороны, результаты исследования селективности связывания биоорганических молекул с ионами металлов в перспективе могли бы быть использованы для разработки чувствительных биосенсоров.
Особый научный и практический интерес представляет исследование молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов. Фармакологическая активность лекарственных препаратов определяется не только их химической структурой, но и состоянием функциональных групп, определяемым как взаимодействием молекул препарата с растворителем, так и друг с другом. При специфическом связывании этих молекул с клетками-мишенями, особую роль играет конформация молекул, которая может изменяться, например, при взаимодействии молекул препарата с двух и трёхзарядными ионами металлов. Одним из традиционных методов исследования конформации молекул является метод кругового дихроизма, который позволяет следить за кинетикой конформационных перестроек молекул в растворе (при наличии полос поглощения в видимой или ультрафиолетовой областях спектра).
Объект исследования
Междисциплинарным объектом нашего исследования является молекула тетрациклина. С одной стороны - это биомолекула, оказывающая воздействие на биосинтез белка в бактериальных клетках, и поэтому представляющая интерес для биологов, медиков и фармацевтов. С другой -это достаточно стабильная мезомолекула, имеющая молекулярный размер, промежуточный между размерами малых органических молекул и макромолекул, и уникальное химическое строение, благодаря которому её можно использовать, например, в качестве биосенсора.
Предметом исследования в нашей диссертационной работе является изучение особенностей взаимодействия тетрациклина с ионами лантанидов, приводящего к комплексообразованию.
Интерес к комплексным соединениям тетрациклина с ионами редкоземельных металлов связан с тем обстоятельством, что эти катионы обладают сродством к кальций-связывающим центрам белков, мембран, протеолипидов, причём константы связывания с лантанидами намного выше, чем с кальцием.
Это свойство редкоземельных катионов послужило основанием для разработки ныне широко применяемого на практике метода редкоземельного спектроскопического зондирования биомолекул, базирующегося на гипотезе эквивалентности мест связывания лантанидов и кальция. По изменениям спектральных характеристик комплексных соединений, активированных лантанидами, делаются соответствующие выводы о строении мест связывания с ионами кальция или магния.
Ионы лантанидов, несмотря на то, что являются абиотичными, находят применение в медицине в качестве диагностических средств, благодаря своим уникальным оптическим и магнитным свойствам. Катионы европия успешно используются в качестве люминесцентных зондов, катионы гадолиния применяют при магнитно-резононансной томографии в качестве контрастных агентов. Изучается влияние катионов гадолиния на пролиферацию и подвижность некоторых опухолевых клеток. Таким образом, исследование комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов имеет важное научное и прикладное значение.
Степень разработанности научной проблемы
Тетрациклин и его производные успешно применяются в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов. Тетрациклин хорошо проникает сквозь клеточные мембраны бактерий, связывается с рибосомами, оказывая ингибирующий эффект на синтез бактериальных белков. Установлено, что он может взаимодействовать и с митохондриями бактериальных клеток.
Максимум антибактериальной активности гидрохлорид тетрациклина проявляет при слабокислом значении рН, равном 5,5.
Остается открытым вопрос - чем всё-таки обусловлена селективность действия тетрациклина на клетки микроорганизмов, почему происходит увеличение проницаемости бактериальных мембран для тетрациклина по сравнению с мембранами клеток млекопитающих?
По этому поводу существует две точки зрения. Некоторые учёные считают, что проницаемость мембран для тетрациклина напрямую связана с изменением его заряда и конформационных свойств при комплексообразовании с ионами металлов (он становится электрически нейтральным и легче растворяется в липидах). Другие полагают, что перенос тетрациклина через мембраны осуществляется специальными белками-переносчиками. Так или иначе, фармакокинетические исследования плазмы крови показали, что 95% тетрациклина, несвязанного с белками, находится в форме комплексных соединений кальция и магния. Поэтому выяснение особенностей комплексообразования тетрациклина с катионами металлов играет большую роль для дальнейшего понимания механизмов транспорта тетрациклина в живых организмах.
В литературе имеются сведения, полученные методами рентгеноструктурного анализа, кругового дихроизма и ЯМР, о том, что связывание тетрациклина с ионами металлов способно изменять конформационное состояние молекул тетрациклина.
В результате рентгеноструктурных исследований были получены структурные данные (значения длин ковалентных и водородных связей, валентных и пространственных углов) для многих известных производных тетрациклина, широко применяемых в медицине. Это позволило рассчитать пространственную структуру антибиотика. Потенциометрическим методом было установлено, что константы диссоциации протонов гидрохлорида тетрациклина в водных растворах при 25°С составляют рКаі=3,33; рКаг=7,75; рКаз=9,68.
Однако, результаты спектральных исследований комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, полученные с помощью метода кругового дихроизма, противоречивы. Расхождения результатов связаны как с различиями условий проведения экспериментов (рН, ионная сила, концентрации реактивов, состав используемой щёлочи, вид аниона соли комплексообразующего катиона), так и с полным отсутствием информации о кинетических аспектах связывания тетрациклина с ионами металлов.
Кроме того, ряд исследований проводился при физиологически неприемлемых условиях (в диметилсульфоксиде, при крайне высоких рН и т.д).
Работ, посвященных изучению комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов, крайне мало - они были сделаны методом ЯМР. Методом кругового дихроизма таких исследований не проводилось.
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы является выяснение молекулярных механизмов связывания кальция и лантанидов тетрациклином при физиологически приемлемых условиях (концентрациях тетрациклина 10" М, при оптимальном рН 5,5).
Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:
1. Выявление особенностей комплексообразования тетрациклина с рядом одно, двух трёхзарядных ионов металлов в воде методом кругового дихроизма.
2. Проверка гипотезы об изоморфизме мест связывания кальция и лантанидов (на примере комплексных соединений тетрациклина с кальцием и самарием).
3. Изучение влияния фактора рН на процесс комплексообразования тетрациклина с кальцием и самарием в водных растворах.
4. Кинетическое исследование процесса комплексообразования самария с тетрациклином в водных растворах в изоэлектрической точке (при рН=5,2).
5. Исследование влияния одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.
6. Регистрация и анализ оптических и ПМР спектров комплексных соединений тетрациклина с ионами лантанидов (для выяснения строения мест связывания ионов металлов).
7. Конформационный анализ пространственной структуры молекул тетрациклина в комплексных соединениях с ионами металлов с помощью ЭВМ и сопоставление результатов расчетов с данными, полученными при исследованиях взаимодействия тетрациклина с ионами металлов методами КД и ЯМР спектроскопии.
Научная новизна работы
Впервые были получены следующие результаты:
1. Обнаружено различие мест связывания ионов кальция и лантанидов молекулой тетрациклина в воде при рН=5,2 (в изоэлектрической точке) в комплексах состава 1:1.
2. В водных растворах при рН=5,2 связывание ионов металлов с молекулами тетрациклина происходит на А-хромофоре при участии трикарбонилметановой группировки.
Для доказательства этих выводов, существенных для выявления механизмов биологического действия антибиотиков ряда тетрациклина, использовались следующие экспериментальные результаты, полученные впервые методами КД, ЯМР и оптической спектроскопии:
а) обнаружены различия спектров кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами скандия и тяжёлых металлов (стронция, кадмия, лантанидов) и с ионами лёгких металлов (магния, кальция, алюминия) в области длин волн 380-420нм в комплексных соединениях состава 1:1 при рН=5,2 в воде;
б) получены кинетические кривые образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде, свидетельствующие о зависимости кинетики комплексообразования при рН=5,2 от типа катиона щелочи (КОН, NaOH, LiOH);
в) продемонстрировано влияние ионной силы и рН на кинетику образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде в области слабокислых рН (pKi pH pK2);
г) получены и проанализированы электронно-колебательные спектры люминесценции и возбуждения Ей в комплексных соединениях тетрациклина с кальцием, стронцием, иттрием, лантаном, гадолинием, лютецием, активированных европием, которые свидетельствуют о низкой симметрии центров связывания катионов металлов. Кроме того, произведён расчёт и анализ конформационных состояний тетрациклина на ЭВМ и предложены практические методы оценки чистоты препаратов тетрациклина и определения тяжёлых металлов в природных водоёмах при помощи метода кругового дихроизма.
Научно-практическая значимость исследования
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, важны, поскольку иллюстрируют фундаментальные механизмы образования комплексных соединений полидентатных лигандов в электролитах, содержащих многозарядные ионы металлов.
Они могут найти применение в биофизике, координационной химии и медицинской биологии, позволяют приблизиться к пониманию механизмов действия тетрациклина на молекулярном уровне и стимулировать дальнейшие изыскания в этой области.
Исследована кинетика и выявлены физико-химические факторы, влияющие на процесс связывания тетрациклина с ионами лантанидов, проведён анализ конформаций тетрациклина в комплексных соединениях лантанидов на ЭВМ.
Кинетические исследования процесса комплексообразования показали, что при создании новых комплексонов важную роль играют сольватационные факторы: рН, ионная сила, полярность растворителя.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на следующих конференциях, симпозиумах и совещаниях:
1. X Всесоюзное совещание "Физические методы в координационной химии". (Кишинев, 1990);
2. VIII Всесоюзный симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. (Новосибирск, 1990);
3. VI Всесоюзное Совещание "Спектроскопия координационных соединений".-(Краснодар, 1990);
4. Всесоюзная конференция "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ". (Москва, 1990);
5. V Всесоюзное Совещание "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах". ( Иваново, 1991).
-14-Публикации
Результаты работы, описанной в диссертации, опубликованы в шести статьях и пяти докладах на Всесоюзных конференциях, симпозиумах и совещаниях. Список работ прилагается в конце диссертации (стр. 114).
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 127 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами.
Список литературы содержит 100 источников.
Спектры КД водных растворов комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов
Пробелы и противоречия работ [14-19, 36, 55], касающиеся условий проведения экспериментов, описания механизмов и мест связывания ионов металлов молекулами тетрациклина, стимулировали проведение исследований комплексообразования тетрациклина в растворах при физиологических рН методом кругового дихроизма [75, 76].
Нами исследовалось комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с хлоридами натрия, калия, цезия, магния, кальция, стронция, бария, кадмия, меди, цинка, алюминия, железа, скандия, иттрия и лантанидов в слабокислых водных растворах. Раствор гидрохлорида тетрациклина (1,5-10" М) доводился до рН = 5,2 при помощи КОН, а затем проводилось титрование соответствующим хлоридом металла.
Электронные спектры поглощения водных растворов гидрохлорида тетрациклина в присутствии хлоридов металлов приведены на рис.16.
При повышении кислотности растворов в спектрах поглощения происходит батохромное смещение максимума длинноволновой полосы Атах=360нм до Атах=380нм. При образовании комплексов тетрациклина с ионами металлов длина волны максимума Хтах смещается до значения 400 нм.
Спектры кругового дихроизма водных растворов гидрохлорида тетрациклина в присутствии НС1 или хлоридов металлов приведены на рис.17.
Спектры кругового дихроизма растворов тетрациклина с хлоридами европия (1), иттрия (2), кальция (3), магния (4), натрия (5) при мольном соотношении металл:тетрациклин =1:1, а также гидрохлорида тетрациклина (6) при с=1,5-10"4 моль/л; рН=5,2 (1-5), рН=2,0 (6) (молярная эллиптичность 0=3300-As).
В спектрах КД водных растворов комплексов при этом, наряду с изменением дихроизма оптически активных полос, наблюдается появление новой консервативной полосы КД с максимумом в области длин волн X 410 420нм. В спектрах КД свободных молекул тетрациклина эта полоса отсутствует, вероятно, из-за практически свободного вращения карбамидной группы А-кольца, объясняемой нестабильностью дополнительных шестичленных циклов, замыкаемых водородной связью.
Наиболее существенные изменения спектров КД тетрациклина, связанные с введением в раствор катионов металлов, наблюдаются в областях X 260-270 нм и X 370-420 нм. Изменения дихроизма в области X 260-270 нм обусловлены переходами между конформацией В со скрученным А-кольцом, характерной для молекулы тетрациклина в кислых средах и слабо щелочных средах, и вытянутой конформацией А, характерной для цвиттериона, наблюдаемой при нейтральных рН [19]. Приведённые спектры свидетельствуют о переходе к «вытянутой» А-конформации тетрациклина при комплексообразовании с кальцием и лантанидами.
Взаимодействие молекул тетрациклина с многозарядными катионами приводит к заметному консервативному вкладу в КД (двойной Коттон-эффект) в области наиболее длинноволновой полосы поглощения (X 370 - 420нм). Порядок чередования знаков КД компонентов полосы, наблюдаемой в указанном диапазоне, зависит от типа катионов металла, взаимодействующих с молекулой тетрациклина. Например, максимум КД длинноволновой составляющей рассматриваемой полосы имеет отрицательный знак в спектрах изомолярных растворов тетрациклина с хлоридом кальция и положительный знак в спектрах аналогичных по составу растворов тетрациклина с хлоридами скандия, иттрия или лантанидов. В случае лантанидов наибольшее значение амплитуды этой составляющей (положение максимума Хтах = 415 нм) наблюдается в спектрах водных растворов тетрациклина с хлоридом самария.
Исследования комплексообразования тетрациклина с хлоридами металлов при рН 5,2 показали, что связывание с однозарядными катионами металлов (Na , К , Cs ) не приводит к существенным изменениям спектра КД тетрациклина в области Х-380 - 420 нм даже при больших значениях отношения концентраций ионов металла и тетрациклина. Ионы ряда металлов, таких как Zn , Fe , Gd , не влияют на рассматриваемую длинноволновую область спектра КД тетрациклина. По-видимому, константы устойчивости соответствующих комплексов малы или оба возможных центра связывания на А-кольце тетрациклина заселяются этими ионами примерно одинаково. Введение в раствор тетрациклина ионов легких металлов, таких как Mg , +9 +"3
Са , А1 , приводит к появлению в рассматриваемой области спектров КД (район -410 нм) полосы с существенным отрицательным дихроизмом. В ряду катионов легких металлов 9 сатц 9 мётц 9 АІТЦ - дихроизм максимален для комплексов тетрациклина с ионами кальция.
Образование эквимолярных комплексов тетрациклина с ионами металлов, обладающих большим атомным весом, сопровождается изменением знака дихроизма, что наблюдается уже в случае ионов скандия. По ряду лантанидов дихроизм велик в комплексных соединениях тетрациклина с ионами, у которых число 4і"-злектронов меньше семи (цериевая подгруппа) и большое координационное число. Поэтому возможно, что наблюдаемый КД связан с +9 "3+ повышенной дентатностью тетрациклина. Ионы Са и Sm , образуя комплексы с тетрациклином, дают наибольший, абсолютный отрицательный для кальция и положительный для самария, вклад в дихроизм в области X 410-415 нм.
Влияние одновалентных катионов на процесс образования комплексов тетрациклина с ионами самария
Одним из обязательных условий образования таких циклов является дополнительное связывание с оксигруппои кальциевого центра, которое носит конкурентный характер. Придерживаясь такого понимания механизма образования комплекса тетрациклина с самарием в области слабокислых рН, легко объяснить и результаты по смешанному титрованию растворов тетрациклина ионами кальция и самария (рис. 19а). Действительно, в этом случае для образования комплекса с самарием необходима одна дополнительная связь с активными группами кальциевого центра, что достигается путем разрушения комплексов кальций - тетрациклин. Связывание тетрациклина с ионом самария инициирует кето-енольный переход в кольце А, сопровождающийся поворотом карбамидной группировки на 180, в результате чего происходит смена наиболее благоприятного места связывания иона металла.
Образование устойчивого хелатного цикла второго центра связывания с ионом самария при этих значениях рН осуществляется при участии одной из оксигрупп первого центра, что приводит к разрушению хелатного цикла кальция. Оставшиеся от него активные оксигруппы первого центра могут образовывать неустойчивый хелатный цикл с ионом самария. Следует учесть, что во втором центре самарий оказывается координированным тетрациклином только по двум связям. Нескомпенсированный положительный заряд катиона самария нейтрализуется за счет взаимодействия с растворителем или анионами солей металла. При этом существует конкурентное связывание "второго" центра с щелочноземельным катионом. Большое координационное число ионов самария и нескомпенсированность заряда в шестичленном хелатном кальциевом цикле приводят к взаимодействию ионов самария с молекулами воды и частичному гидролизу воды. Гидролиз воды, вызываемый ионами лантанидов, происходит благодаря большому координационному числу последних и подробно описан в литературе [77]. Известно, что в этом случае происходит частичное закисление растворов, содержащих ионы лантанидов. Атомы в шестичленных хелатных циклах, образующихся при рН 5,2, лежат почти в одной плоскости, что приводит к симметризации системы хромофоров в молекуле тетрациклина и, следовательно, к уменьшению величин дихроизма растворов комплекса. G.W.Everett [46] обратил внимание исследователей на то, что присутствие небольшого количества солей в составе электролита или буфера, добавляемого к растворителю (например, к воде или диметилсульфоксиду), приводит к ошибкам при описании результатов эксперимента по связыванию тетрациклина с ионами металлов, т.к. эти соли могут напрямую взаимодействовать с тетрациклином. В частности, он заметил, что ионы натрия способны конкурировать с ионами кальция за места связывания в комплексах с тетрациклином.
В литературе нет сведений, касающихся кинетических аспектов процесса комплексообразования тетрациклина с ионами металлов, регистрируемого in vitro методом КД. Результаты различных исследователей трудно сопоставимы, так как в их статьях не говорится о том, через какое время после сливания растворов тетрациклина и солей металлов регистрировались спектры КД. Между тем, очевидно, что, если реакция комплексообразования не завершена (в случае медленных реакций), преждевременная регистрация спектральных характеристик КД растворов таких комплексных соединений может привести к ошибочным выводам. В связи с этим, следующей нашей задачей являлось изучение изменений спектров КД комплексных соединений тетрациклина с самарием с течением времени и установление степени влияния одновалентных катионов, присутствующих в растворе, на кинетику связывания тетрациклина с ионами металлов [75, 78].
Изучение образования комплексов тетрациклина с ионами лантанидов методами ЯМР спектроскопии
В спектре комплекса иттербия узкие линии с одинаковой интенсивностью можно отнести к протонам групп 1Ч(СНз)2 при атоме С(4) тетрациклина (химические сдвиги 8 =-0.97, -2.37 м.д.) и СНз при атоме С(6) тетрациклина (8 = 10.4 м.д.). Парамагнитные сдвиги протонов указанных групп имеют разные знаки. В предположении, что ионы иттербия дают достаточно слабый контактный сдвиг линий в спектрах ПМР [88], чтобы объяснить различия знаков псевдоконтактных (диполь-дипольных) сдвигов, нужно предположить, что направления от иона металла к соответствующим радикалам составляют с осью комплекса углы 0RC(6) И 6RC(4), лежащие по обе стороны от магического угла 0м 5514 . Так как зависимость псевдоконтактных сдвигов от 9 описывается соотношением 8 3cos 6-1, что и обеспечивает разные знаки парамагнитных сдвигов. Так как абсолютная величина сдвига линии метильного радикала при атоме С(6) относительно линии СН3 в спектре диамагнитного комплекса вдвое больше величины сдвига линии метильного -радикала N(CH3)2 при атоме С(4), можно предположить, что 0RC(6) 9м 9RC(4). Последнее соотношение позволяет считать, что в слабокислых и нейтральных водных растворах атомы кислорода при атоме С(11) и при атоме С(12) не координируются ионами металла, в то время как атомы ОС(1), ОС(12а) и, в меньшей степени, атомы ОС(2 ) (при развороте C(0)NH2 - группы вокруг связи С(2)-С(2 )), ОС(3), вероятно, связывают эти ионы. Соотношение аксиальной и неаксиальной компонент магнитной восприимчивости, определяемое отношением аксиальной и неаксиальной ромбических компонент 7-е кристаллического поля, легко определяется по штарковскому расщеплению г і - уровня европия в спектрах комплексных соединений с тетрациклином, рассматривавшихся в предыдущем разделе [86]. Оценка этого соотношения дает возможность рассчитывать положение иона лантанида на тетрациклине по псевдоконтактным сдвигам линий различных протонов этого лиганда в спектрах ПМР комплексных соединений тетрациклина с лантанидами.
Таким образом, данные ПМР качественно согласуются с данными, полученными по спектрам КД, свидетельствующими о том, что при рН=5,2 ионы лантаноидов, а также кальция, стронция, иттрия взаимодействуют с трикарбонилметановой группировкой А-кольца молекулы тетрациклина.
Математическое моделирование пространственной структуры комплексных соединений производилось с целью оценки относительной стабильности различных конформаций тетрациклина при учёте Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий и внутримолекулярных водородных связей. Оно осуществлялось на ЭВМ ЕС 1055М методами молекулярной механики с помощью модифицированной программы В.Г. Дашевского [69], написанной на Фортране.
Cid-Dresdner Н. [13] были проведены точные рентгеноструктурные исследования молекулы гидрохлорида тетрациклина, в результате чего были определены значения длин всех ковалентных и водородных связей, а также значения всех валентных углов, которые мы использовали при построении моделей.
Сложность построения структурной модели тетрациклина на компьютере состоит в том, что в состав молекулы входят четыре замкнутых углеродных цикла. При построении моделей за основу брали плоское кольцо D, а затем последовательно замыкали оставшиеся В, С, А кольца, варьируя значения пространственных углов (через 1 ) и сохраняя неизменными величины валентных углов и длины связей для атомов с sp гибридизацией межатомных связей.
Таким способом нами было получено четырнадцать потенциально возможных конформаций остова молекулы тетрациклина, различающихся по степени «свёрнутости-развёрнутости» молекулы [74]. Для всех случаев построены модели молекулы тетрациклина с учётом заместителей. Характерные расстояния между крайними атомами в молекуле (атомом С(9) в кольце D и карбамидной группировкой в кольце А) составляют от 3,09 А до 10,57А соответственно в «свернутых» и «развернутых» конформациях.
Для каждой конформации суммировались вклады Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий атомов, определявшиеся значением потенциала Дашевского на расстоянии между атомами, в потенциальную энергию молекулы. Потенциал Дашевского является модификацией двучленных потенциальных функций, описывающих Ван-дер-Ваальсово взаимодействие двух атомов:
Возможность определения тяжёлых металлов в природных водоёмах
Предлагаемый нами метод физико-химического контроля содержания примесей солей металлов в препаратах гидрохлорида тетрациклина [98-100] основан на регистрации спектров КД растворов тетрациклина в дистиллированной воде (1,5-10" М) при рН -5.1-5.2 в диапазоне длин волн X - 400 - 430нм. Он обосновывается экспериментальными данными, полученными нами при изучении процессов связывания тетрациклина с целым рядом ионов металлов: с натрием, калием, цезием, магнием, кальцием, стронцием, барием, кадмием, медью, цинком, алюминием, железом, скандием, иттрием и лантанидами [75, 76, 86, 87].
При связывании с ионами металлов в молекулах тетрациклина происходит перераспределение зарядов и изменение конформации, что является причиной изменения спектральных характеристик растворов тетрациклина. Спектроскопические исследования комплексообразования тетрациклина с ионами металлов являются основой для разработки метода экспресс-анализа чистоты препаратов антибиотика. Следует заметить, что оптические методы исследования наиболее (по сравнению с ЯМР и рентгеноскопией) приближены к физиологически - приемлемым условиям проведения экспериментов, т.к. в этом случае диапазон концентраций тетрациклина (10" -10" М) соответствует уровню этого антибиотика в плазме крови пациентов [2].
При разработке данной методики использовались результаты, полученные при исследовании комплексообразования тетрациклина с ионами ряда металлов в оптимальном рН диапазоне (рН=5,2) и при физиологически приемлемых концентрациях методом КД. Водный раствор гидрохлорида тетрациклина (1,5-10" М) доводили концентрированным раствором щёлочи (КОН) до значений рН 5.1-5.2. После добавления соли соответствующего металла измерялись спектры поглощения и кругового дихроизма образующихся комплексов в области X 400-430 нм при температуре 300К.
При переходе через рКі в спектрах поглощения происходит батохромное смещение длинноволнового перехода X щах 360 нм — Хтах 380 нм и сдвиг в коротковолновую область переходов с Хтах 267 нм и Хтах 220 нм. Связывание с ионами металлов лишь незначительно усиливает батохромный эффект длинноволнового перехода. Следует также заметить, что при увеличении значения рН (рН pKi) величина смещения длины волны максимума этого перехода практически не изменяется. Поэтому возникает сложность в правильной интерпретации ныне широко применяемого на практике спектрофотометрического метода определения загрязнения тетрациклина солями металлов. Дело в том, что данный метод практически не оставляет возможности отличить комплекс тетрациклина с ионом металла от простой депротонированной формы тетрациклина.
Подробного рода недостатков лишен метод определения содержания примесей металлов по спектрам КД. Связывание молекул тетрациклина с ионами металлов приводит к конформационным перестройкам этих молекул, которые проявляются в изменениях спектральных характеристик растворов тетрациклина.
При взаимодействии с ионами металлов в спектрах КД наряду с изменением дихроизма оптически активных полос наблюдается появление новой консервативной полосы КД с экстремумами в области X 410-415 нм и X 350-360 нм. В спектрах КД свободных молекул тетрациклина эта полоса отсутствует. Наличие длинноволновой консервативной полосы в спектрах КД водных растворов препаратов тетрациклина является свидетельством присутствия в исследуемой пробе ионов многозарядных металлов. Более того, регистрация такой полосы в спектрах КД позволяет сделать вывод о возможной природе примеси. При этом достаточно снять спектр КД исследуемого раствора в области Х-360-420 нм. Нами было подробно изучено влияние природы солей металлов на характер (знак и амплитуду экстремумов) данной полосы КД.
Результаты исследований комплексообразования тетрациклина с хлоридами металлов при рН 5.1-5,2 позволили установить существование связи амплитуды и знака экстремума консервативной полосы КД при 1=410-415 нм с радиусом и зарядом катионов. Было выяснено, что взаимодействие тетрациклина с однозарядными ионами металлов (натрия, калия, цезия) не приводит к появлению консервативной полосы КД даже при значительном увеличении концентрации катионов металла или тетрациклина.
Ионы ряда металлов, таких как Zn , Fe , Gd , также не влияют на рассматриваемую длинноволновую область спектра КД водных растворов тетрациклина. По-видимому, константы устойчивости соответствующих комплексов малы или результирующий эффект взаимодействия указанных ионов с тетрациклином невелик.
Введение в раствор тетрациклина ионов лёгких металлов, таких как Mg , Са , А1 приводит к появлению в рассматриваемой области длин волн (X 410 нм) полосы КД с существенно отрицательным дихроизмом. В ряду ионов лёгких металлов 6сатц 9мётц бдітц - дихроизм максимален в комплексах тетрациклина с ионами кальция.
