Содержание к диссертации
Введение
глава 1. Взаимодействие молекул в растворах белков
1. Теория дебая-хюккеля 11
2. Теория взаимодействия молекул в растворах электролитов 16
3. Взаимодействие ионов металлов с молекулами белков в растворах 18
краткие итоги главы 1 31
Глава 2. Методы люминесцентного анализа 33
1. Обзор люминесцентных методов 33
2. Понятие люминесценции. метод поляризованной флуоресценции 36
Понятие флуоресценции 36
Характеристики флуоресценции 39
Метод поляризации флуоресценции 43
3. Описание экспериментальных установок 52
4. Методика проведения эксперимента 57
краткие итоги главы 2 63
глава 3. Исследуемые вещества 65
1. Белки 65
2. Тяжелые металлы 76
3. красители 80
4. Хелат европия 87
Краткие итоги главы 3 94
глава 4. Экспериментальное исследование растворов методами флуоресцентной спектроскопии и поляризованной флуоресценции 96
1. Исследование спектров и поляризованной флуоресценции белковых растворов при добавлении красителя флуоресцеина 96
2. Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при добавлении красителя tns 100
3 Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при добавлении красителя dsy 113
4 Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при добавлении хелата ей 117
5 Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне длин волн 129
6.Исследование растворов сыворотки крови 139
краткие итоги главы 4 142
глава 5. Обсуждение результатов. сравнение с экспериментальными данными, полученными другими методами . 146
1. Сравнения спектральных характеристик растворов бса с данными исследования поляризованной флуоресценции .146
2. Расчет времен корреляции вращательной подвижности частиц в растворах бса с ионами металлов 148
3. Расчет сорбции флуоресцентного красителя tns на поверхности бса по теории ленгмюра 155
4. Исследование растворов бса, содержащих хелат ей, методами интегрального рассеяния света и корреляционной спектроскопии 159
Краткие итоги главы 5 161
Заключение. основные результаты и выводы 164
список Литературы
- Теория взаимодействия молекул в растворах электролитов
- Описание экспериментальных установок
- Хелат европия
- Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при добавлении красителя tns
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Большинство метаболических реакций в живом организме осуществляются при непосредственном участии белковых макромолекул. Несомненный интерес для современной биофизики и физико-химической медицины представляют исследования воздействий на белковые системы токсичных металлов, которые являются причиной экологических загрязнений и приводят к серьезным, часто необратимым структурно-функциональным нарушениям в организме.
Токсичные металлы могут находиться в растворах белков как в свободной (ион металла + гидратная оболочка), так и в хелатной формах (ион металла + хелат + гидратная оболочка). Хелатные соединения, в частности этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) с ионами металлов, являются устойчивыми комплексами. Это свойство используется в пищевой промышленности, а также в клинической практике для лечения отравлений тяжелыми металлами. Конкурирующими ионами за место в комплексе с ЭДТА могут выступать ионы кальция, калия, натрия. Поэтому применение комплексов на основе ЭДТА может приводить к нарушениям установившегося равновесия между различными ионами металлов в плазме крови и тканях организма. Молекулы комплексонов практически не подвергаются расщеплению в биологической среде и при определенных концентрациях могут отрицательно воздействовать на слизистую оболочку.
Поведение белковых макромолекул в растворах определяется электростатическим взаимодействием между зарядами на их поверхности. Однако оказалось, что при определенных условиях, например, когда в растворе присутствуют ионы тяжелых металлов, взаимодействие заряженных групп белковых макромолекул с ними может приводить к экранированию поверхностных зарядов. В этом случае существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, молекулы белка
сближаются на предельно допустимые расстояния, что приводит к изменениям их как статических, так и динамических параметров.
Ранее с помощью методов статического и динамического рассеяния света было показано, что присутствие токсичных ионов в белковых растворах приводит к агрегации частиц и образованию т.н. белковых нанокластеров.
Среди существующих оптических методов флуоресцентные методы анализа являются одними из наиболее чувствительных для определения количественного содержания вещества в биологических образцах. Параметры флуоресценции чувствительны к структуре окружения флуорофора, поэтому флуоресцентные методы применяются также и для изучения структурных превращений в различных веществах.
Очень важное свойство флуоресцентных методов в биологических экспериментах состоит в том, что измерения люминесценции и спектров поглощения могут проводиться в сильно рассеивающих, гетерогенных средах.
В основе метода поляризации флуоресценции лежит исследование вращательной подвижности молекул в растворах. Вращательная подвижность частиц в растворах белка при добавлении токсичных ионов будет изменяться при образовании белковых структур — нанокластеров. Поэтому, исследуя поляризацию флуоресценции молекул в растворах белка, содержащих токсичные ионы, можно определять времена корреляции вращательной подвижности, которые напрямую связаны с массами и размерами нанокластеров, а также условия их образования в зависимости от параметров среды.
Исследования растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов или их хелатные комплексы, представляют несомненный интерес для понимания механизмов токсического воздействия этих соединений на организм.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы — экспериментальное исследование возникновения
макромолекулярных кластеров в растворах альбумина, содержащих ионы
тяжелых металлов и хелата европия, с помощью методов поляризации
флуоресценции, светорассеяния, флуоресцентной и корреляционной
спектроскопии.
Для достижения этой цели в работе предполагалось решить ряд задач:
создание экспериментальной установки на основе у4г-лазера для изучения поляризации флуоресценции биологических жидкостей в видимом диапазоне длин волн;
подбор флуоресцентных зондов для исследования вращательной подвижности частиц в растворах альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов;
исследование флуоресценции растворов белков, содержащих соли свинца, натрия и хелат европия;
получение и сравнение спектров флуоресценции водных растворов альбумина при добавлении токсичных ионов и без них;
расчет времени корреляции вращательной подвижности и эффективной массы частиц в исследуемых растворах в зависимости от параметров среды (концентрации токсичных ионов, рН);
сравнение полученных результатов с данными по светорассеянию и корреляционной спектроскопии в тех же системах.
Научная новизна диссертации
С помощью флуоресцентной спектроскопии в видимом и
ультрафиолетовом диапазонах длин волн и метода поляризации
флуоресценции проведено исследование растворов сывороточного
альбумина (БСА) с солями металлов (Na , Pb и Cd ) при изменении
ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН и
ионная сила растворов.
Впервые с помощью флуоресцентной спектроскопии и метода
поляризации флуоресценции проведено исследование растворов
хелата европия (соединение ЭДТА с Ей ) при изменении ряда
параметров среды, таких как концентрация ирНрастворов.
С помощью флуоресцентной спектроскопии и метода поляризации
флуоресценции проведено исследование растворов БСА, содержащих
хелат европия при изменении различных параметров, таких как
концентрация компонентов, рН растворов, длина волны возбуждения
флуоресценции.
Показано, что наличие в растворах белка ионов легких металлов (Na )
не приводит к увеличению времени корреляции вращательной
подвижности и массы частиц. Наличие в растворах БСА ионов
тяжелых металлов (Cd , Pb ) вызывает образование наночастиц —
белковых кластеров.
Впервые показано, что наличие в растворах БСА молекул хелата
европия приводит к образованию белковых макромолекулярных
комплексов — наночастиц, как и при добавлении солей тяжелых
металлов.
Показано, что значения времен корреляции вращательной
подвижности частиц в растворах белков, содержащих тяжелые ионы,
растут при увеличении ионной силы (концентрации).
Получены зависимости времен корреляции вращательной
подвижности частиц в белковых растворах от поверхностного заряда
на макромолекулах; эти зависимости имеют максимумы в
изоэлектрической точке белка.
Метод поляризации флуоресценции применен для исследования
растворов сыворотки крови; показано, что интегральные
характеристики времен корреляции вращательной подвижности
белков сыворотки крови могут различаться для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.
Научно-практическая значимость исследования
Основные результаты работы способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.
Изученное в работе поведение белковых макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных металлов, в том числе с ионами тяжелых металлов, может быть использовано в исследованиях изменений физико-химических характеристик сыворотки крови, происходящих при патогенезе многих распространенных заболеваний.
Метод поляризации флуоресценции, отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью, возможно применять для диагностики заболеваний (в том числе онкологических) на ранних стадиях их развития, даже при незначительных изменениях свойств сыворотки крови.
Материалы диссертации могут быть использованы при разработке физических методов мониторинга загрязнения природных сред тяжелыми металлами, а также для создания диагностических приборов.
Защищаемые положения
Показана возможность определения малых концентраций ионов токсичных металлов в свободной и хелатной формах с помощью флуоресцентных методов.
С помощью метода поляризации флуоресценции обнаружено образование наночастиц — белковых кластеров в водных растворах альбумина в присутствии ионов тяжелых металлов свинца и кадмия.
Обнаружено, что присутствие молекул хелата европия в растворах БСА приводит к увеличению времени корреляции вращательной подвижности частиц, что, по-видимому, связано с образованием белковых кластеров.
Независимо методами интегрального светорассеяния и фотонно-корреляционной спектроскопии подтверждено образование наночастиц в растворах альбумина, содержащих ионы хелата европия.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: International Conference ALT-03 (Silsoe, 2003), Четвертая Всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии» (Москва, 2004), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004», «Ломоносов 2005» (Москва, 2004, 2005), II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии (Москва, 2005), International Conference ICONO/LAT 2005 (St. Petersburg, 2005), Конференция молодых ученых в рамках всемирного дня физики в МГУ, (Москва, 2005), ежегодная научная конференция «Ломоносовские Чтения» 2006 (Москва, 2006), Photonic West, Diagnostics and Sensing VI (San-Jose, USA, 2006).
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 05-02-17838 и Университеты России 01.03.077.
Публикации
По материалам диссертационной работы имеется 13 публикаций, в числе
которых 3 статьи в российских и международных научных журналах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, содержащего 90 наименований. Объем работы составляет 173 страницы, включая 98 рисунков и 18 таблиц.
Теория взаимодействия молекул в растворах электролитов
Существует большое число физических методов исследования динамики молекулярных частиц и их комплексов в растворах. Ультразвуковая спектроскопия, ядерный магнитный резонанс, рассеяние медленных нейтронов, спектроскопия диэлектрической релаксации, рэлеевское и комбинационное рассеяние света, люминесцентная спектроскопия — позволяют получать сведения о взаимодействиях и движениях молекул в конденсированных средах.
Люминесцентные методы исследования нашли широкое применение в химии, биологии, медицине, технике. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и дают уникальные возможности изучения структуры и свойств сложных химических и биологических объектов.
Люминесцентные методы включают в себя исследования с использованием флуоресценции и фосфоресценции. Наиболее широко люминесцентные измерения используются как методы анализа и контроля за протеканием химических и биохимических реакций, а также для кинетических исследований быстрых реакций электронно-возбужденных молекул.
Применение люминесценции для аналитических целей включает широкую область их использования для идентификации веществ, для обнаружения малых концентраций веществ, для контроля изменений, происходящих с веществом, для определения степени чистоты веществ. Высокая чувствительность метода позволяет фиксировать малую степень превращения веществ, иногда по люминесценции промежуточных состояний удается установить механизм химической реакции.
Люминесцентные методы активно используются для исследования структуры белков методом флуоресцентных меток и зондов.
Флуоресцентная спектроскопия — эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь со временем жизни возбужденных состояний. Абсорбционная спектроскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те молекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику.
В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до ЮОА от флуорофора. Хотя может показаться, что 10нс — слишком короткий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению со временем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффузия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.
Метод поляризованной флуоресценции основан на измерении компонент интенсивности излучения различных биологических жидкостей, в частности растворов белков. Флуоресцентный анализ отличается чрезвычайной простотой, универсальностью, сравнительно высокой чувствительностью и точностью.
Метод относится к «неразрушающим»: для диагностики необходимо взятие оптической биопсии исследуемой ткани или клетки, размер которой определяется используемыми оптическими системами (как правило, наименьший объем биопсии порядка Xі) [39]. Однако, из-за сложности составов реальных физических объектов, различий в составе и характеристиках отдельных проб, с помощью оптических методов зачастую удается получить лишь качественную информацию о составе вещества, примесей. Поэтому наиболее эффективным является использование методов лазерной спектроскопии для анализа искусственно приготовленных проб, исследуя которые можно делать выводы о процессах, происходящих в живых организмах.
Флуоресцентный метод анализа характеризуется также повышенным отношением сигнала к шуму и пропорциональностью сигнала флуоресценции концентрации исследуемого вещества при малой интенсивности флуоресценции [39, Гл.4, 1, с.96, 2, с.ЮО, 3, с.113].
Флуоресценция характеризуется рядом параметров, изменение которых несет определенную информацию о структуре объекта, причем эти данные могут взаимодополнять друг друга.
Это — интенсивность флуоресценции, измеренная на определенной длине волны /(V); спектр испускания 1(КСп) — зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны испускания при возбуждении на постоянной длине волны \036=const; спектр возбуждения Д) озб) — при фиксированном излучении \,cn=const; квантовый выход флуоресценции 0 — отношение числа излучаемых квантов к числу поглощенных за то же время [Гл. 2, 2, с. 41]; время затухания флуоресценции 7фЛ [Гл. 2, 2, с. 50]; поляризация Р и анизотропия г флуоресценции, несущие информацию о статических и динамических параметрах молекул исследуемых растворов [Гл. 2, 2, с. 45].
В практической медицине возможно применение метода лазерного флуоресцентного анализа для изучения внутриклеточного транспорта, диагностики рака (путем мечения раковых клеток различными красителями) и ишемии сердечной мышцы [40, 41, 42], сопровождения операции на сердце (контроль метаболизма сердечной мышцы [39]).
Описание экспериментальных установок
Необходимо отметить, что уравнение выведено в предположении, что, во-первых, кинетика затухания флуоресценции после возбуждения описывается одноэкспоненциальным законом; во-вторых, частицы по форме приближены к сферическим, а их окружение гомогенно; в-третьих, время корреляции вращательной подвижности флуорофора зависит от вязкости среды, температуры раствора и объема вращающейся области (33).
Если молекула не симметрична, то ее вращение вокруг разных осей нельзя считать одинаковым, это также будет оказывать влияние на вращение соседних молекул. Тушение флуоресценции.
Как уже упоминалось, за период времени между поглощением молекулы кванта возбуждающего света и его испусканием в растворе происходит ряд процессов, которые могут приводить к ослаблению наблюдаемых спектральных характеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с тушителями флуоресценции, вращательная и поступательная диффузия, концентрационное тушение, миграция энергии между частицами, образование комплексов с растворителями и растворенными веществами, изменение дипольного момента молекулы, также приводящее к переориентации. Эти динамические процессы изменяют времена затухания флуоресценции, ее интенсивность, и как следствие квантовый выход свечения.
Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые приводят к уменьшению интенсивности флуоресценции исследуемого вещества. К тушению могут приводить реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов и тушение при столкновениях [43]. Если причиной тушения становится контакт флуорофора с тушителем, то выявить это наверняка поможет исследование системы тех же веществ в вязкой среде, где диффузия замедляется и тушение ослабевает.
Основная часть исследований проводилась на оптической установке с Аг-лазером ILA-120 и фотоэлектрической регистрацией излучения (Рис. 17). Измерялись перпендикулярно и параллельно поляризованные компоненты интенсивности флуоресценции образца в зависимости от задаваемых параметров, которыми могут быть концентрация раствора, его рН, длина волны возбуждения.
Источником возбужденного излучения служит ионный у4г-лазер ILA-120, работающий на длинах волн Х=5145, 4880, 4762 и 4579А с вертикальной плоскостью поляризации и диаметром пучка 1,5мм1.
При исследовании методом поляризации флуоресценции использовалась самая короткая длина волны перестраиваемого лазера, на которой интенсивность излучения минимальна. В экспериментах мощность в пучке лазера на 457,9 нм не превышала 15 мВт.
Луч модулируется механическим прерывателем (Пр, Рис. 17), смонтированным на реле РП-5 и соединенным с генератором сигналов. На специально подобранную частоту (78Гц) прерывателя настроен резонансный усилитель (У2-6, Рис. 17), работающий в узком диапазоне частот, чтобы отделить сигнал от внешней засветки и усилить его с максимальной амплитудой.
С помощью линзы (Лі) луч фокусируется на образец вещества (Обр, Рис. 17). Флуоресценция наблюдается под прямым углом к падающему на образец лучу, таким образом, не учитывается вклад возбуждающего и рассеянного излучения, которое могло бы попасть на фотодетектор.
Для выделения флуоресценции используется светофильтр (Сф, Рис. 17), представляющий собой плоскую кювету с водным раствором соли К2СГ2О4 концентрации 1.5-10 г/см , пропускающим свет с длинами волн 500нм. Спектр пропускания Сф приведен на Рис. 18. Полоса пропускания раствора хромпика, используемого в качестве светофильтра.
Поляроид (Г-Т, Рис. 17), в качестве которого используется призма Глан-Томсона, позволяет измерять перпендикулярно и параллельно поляризованные компоненты интенсивности флуоресценции.
Приемником флуоресценции является фотоэлектронный умножитель (ФЭУ, Рис. 17).
Возможные ошибки при измерении интенсивности флуоресценции были проанализированы в работе [89]. К основным причинам погрешностей могут быть отнесены влияние двулучепреломления, анизотропии локального электрического поля, а также процессы перепоглощения и переизлучения. Эти факторы могут дать погрешность в определении анизотропии флуоресценции не более 8%. Расчет погрешностей при измерениях флуоресценции на данной экспериментальной установке показал, что полная относительная ошибка определения степени поляризации Р не превышает 5%.
Спектры флуоресценции измерялись с помощью фирменных спектрофлуориметров «Хитачи» и «Перкин Элмер».
Источником возбуждения в спектрофлуориметре «Перкин Элмер» LS50-В служит специальная ксеноновая импульсная лампа, дающая яркий короткий импульс. Лампочка, расположенная вблизи источника возбуждения, поддерживает равновременной запуск ксеноновой лампы
Хелат европия
Как было показано ранее [см. Таб. 7, с.69], флуоресценция белков происходит в ультрафиолетовой области, поэтому специально подбирают флуорофоры, которые имеют лучшие спектральные свойства и флуоресцируют в видимой части спектра — флуоресцентные зонды [62, 63]. Подобные соединения используются также и в медицине для диагностики различных заболеваний флуоресцентными лазерными методами.
Использование связывающихся с различными компонентами клетки флуоресцентных красителей для регистрации флуоресценции имеет ряд преимуществ. Во-первых, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна количеству красителя (при малых концентрациях). Во-вторых, измерение флуоресценции позволяет регистрировать очень малые количества красителя в клетке1. В-третьих, при взаимодействии внутри живых клеток, красители могут изменять свои флуоресцентные свойства под действием ферментов, изменении количества Са или других ионов. В-четвертых, флуоресцентные красители можно использовать при конструировании молекулярных зондов - соединений, способных связываться с определенными молекулярными группами или участками биополимеров2. 1 меньше 1000 молекул на клетку, [64]. 2 Обычно, флуоресцентные зонды связываются с боковыми аминогруппами аминокислот: лизина, аргинина и др. или с серными группами цистеина и метионина [65]. Флуоресцентные зонды — соединения, которые добавляются к системе извне; не образуя с поверхностью белка ковалентной связи, они обладают высокой поглощательной способностью в видимой части спектра, интенсивно флуоресцируют, причем из параметров этой флуоресценции можно извлечь определенную информацию о структуре белка. С помощью зондов можно изучать заряд белковой поверхности и другие параметры.
Тепловое вращение свободного зонда в водном растворе зависит от Г и коэффициента трения %- Это вращение характеризуют коэффициентом вращательной диффузии D и временем вращательной релаксации1 твр (33). кТ D = (35) X Твр 2D (36) Согласно Стоксу % зависит от вязкости т\ и радиуса зонда Ъ. В случае сферической молекулы зонда: X = ЪщЪъ = 6TJV (37) D = кТ 6TJV (38) где V — объем молекулы зонда. В результате вращательного движения излучаемая зондом флуоресценция оказывается деполяризованной. Яблонский получил следующую зависимость (39). Здесь знаки «-» используются, если возбуждение происходит поляризованным светом, а «+» — если неполяризованным [4]. Из (39) можно легко получить формулу Левшина-Перрена2. р з 1+І Р V 1+ фл вр J кТ 1 +—г фя (39) то же, что и время корреляции вращательной диффузии [Гл.2, 2, с.50]. 2 См. (34), Гл.2, 2, стр. 51. Для анизотропии, в случае поляризованного возбуждения получаем следующее (40). - = - \ +—тфл[, (40)
Поскольку зонды имеют Тфл обычно от 0,1 до 100нс, то времена релаксации, которые можно измерить, находятся в интервале 10" -40" с [62, 63].
Скелет молекул красителей плоский, строится из сочетаний шестичленных бензольных (СбЯ6), пиридиновых {CsH5N)y азиновых ф// ) и других колец, которые соединяются между собой посредством центральных атомов С, N, или линейной цепи из атомов, соединенных сопряженными связями. Флуоресцеин
Широко используются в качестве красителей для белков изоцианаты и изотиоцианаты флуоресцеина и родамина. Эти вещества обычно выбирают из-за высоких квантовых выходов и устойчивости к фото обесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (\=400- 700нм, [43]), в экспериментах можно не учитывать влияние фоновой флуоресценции биологических образцов. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей 1-40 не [43], а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень подходят для количественного определения степени ассоциации небольших меченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции. Флуоресцеин реагирует с аминами, образуя ковалентную связь, достаточно стабильную в воде. Его молярная масса 389Д; максимум испускания 520нм; квантовый выход флуоресценции зависит от рН, при нейтральных рН принимает значения около 0,8.
Структура молекулы флуоресцеина приведена на Рис. 29. Рис. 29. Молекула флуоресцеина Флуоресцентный краситель TNS
Нафтиламинсульфоновые кислоты, \,S-ANS или ANS1, 2,6NS или TNS1 и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при растворении в неполярных растворителях, либо когда они связаны с макромолекулами. Низкий квантовый выход в водной фазе позволяет во многих случаях не учитывать эту часть флуорофора, что упрощает эксперименты. Подобные флуорофоры связываются с сывороточными альбуминами, липопротеинами, апомиоглобином, иммуноглобулинами и липидными бислоями. Структурная формула молекулы красителя TNS приведена на Рис. 30. ( уУ80з" Na+ CH3_ Q_NHJ J Рис. 30. Молекула 2,6NS. Молярная масса TNS: М=335,35г/моль. Максимум поглощения находится на длине волны 374 нм, испускания — 454 нм, 0=0,27 при присоединении к мембранам и 0=0,72 на белках [78].
Исследование спектров и поляризованной флуоресценции растворов белка при добавлении красителя tns
Для изучения флуоресценции растворов в видимой области спектра необходимо использование флуоресцентных красителей [гл.З, 3, с.80]. Была поставлена задача — подобрать такие флуоресцентные зонды, которые флуоресцировали бы в видимой области спектра и имели максимум возбуждения вблизи 479А, на длине возбуждения Лг-лазера [см. описание экспериментальной установки: гл.2, 3, с.52]. При выборе флуоресцентного зонда необходимо также учитывать, чтобы спектры флуоресценции красителя не перекрывались со спектрами поглощения ароматических групп белка для избежания вторичного поглощения, которое может повлиять на конечный результат измерения интенсивности флуоресценции.
Спектры поглощения и флуоресценции водного раствора красителя флуоресцеина [Гл.З, 3, с.82] приведены на Рис. 36. Максимум поглощения для флуоресцеина расположен на длине волны 495 нм, испускания — 516 нм. Один максимум в спектре поглощения зонда свидетельствует о том, что в молекуле флуоресцеина происходит один электронный переход при возбуждении квантом света.
Была проведена т.н. калибровка красителя. Сняты зависимости интенсивности флуоресценции раствора в зависимости от концентрации зонда, рассчитаны значения степени поляризации флуоресценции в каждой точке. Результаты показаны на Рис. 37.
Видно, что при данных значения концентраций, до 1,7мг/мл, интенсивность флуоресценции раствора флуоресцеина растет линейно с ростом концентрации, тушения не наблюдается.
В литературе встречаются данные о способности зондов солюбилизироваться различными растворителями [62]. Солюбилизация не означает, что зонд образует истинный раствор: часто зонд находится в виде ассоциатов, размер которых может изменяться со временем, так что зонд постепенно растворяется, либо выпадает в осадок. В нашем эксперименте сначала степень поляризации Р растет с ростом концентрации зонда (Рис. 37), это свидетельствует о росте твр [см. формулу Левшина-Перрена: Гл.2, 2, с.50], связанном возможно с процессом растворения зонда; затем Р постоянна (при с =Ф,8-Ч,4мг/мл, Рис. 37).
Были созданы образцы с концентрацией БСА СБСА=5,56-10"6М И образцы такой же концентрации белка при содержании соли CCISOA Ccd=3,3-10" М. В обоих случаях концентрация флуоресцеина менялась от 0 до 1,27мг/мл (Рис. 38).
Полученные кривые (Рис. 38) подтверждают теорию Ленгмюра [Гл.5, 3, с. 155], которая позволяет произвести оценку количества центров сорбции заряженных ионов на поверхности молекулы белка. Присоединяющими группами в белке являются NH и ОК. Соль кадмия в растворе диссоциирует на катионы и анионы. Тяжелый Cd крепко связывается с группами NH3+ на поверхности белка. рН растворов 6-6.5 единиц, среда кислая, на поверхности белка преобладают отрицательные заряды (т.к. рНсредь рІБСлУ, мест присоединения для отрицательно заряженного флуоресцеина на белке меньше, чем для положительно заряженных ионов Ccf+. За счет присоединения Cd к белку, происходит экранировка зарядов на его поверхности, его поверхностный заряд приближается к нейтральному, чем облегчается взаимодействие молекул альбумина друг с другом в воде. Заряд-зарядное взаимодействие между молекулами белков переходит диполь-дипольное, и макромолекулы могут сближаться на максимально близкие расстояния (в соответствии с (10), с. 17). В первом случае концентрационное тушение растворов начинается при СфЛ=0.8мг/мл (кривая 1, Рис. 37), во втором раньше - СфЛ=0.4мг/мл (кривая 2, Рис. 37). Возможно, при кластеризации, уменьшается количество посадочных мест для флуоресцеина, в растворе появляется свободный флуоресцеин (кривая 2, Рис. 37), который участвует во вторичном поглощении, т.о. также вызывая тушение. Тушение, вероятно, происходит из-за перераспределении энергии между акцептором (БСА) и донором (флуоресцеин). Мы же наблюдаем флуоресценцию в видимом диапазоне, поэтому интенсивность флуоресценции, наблюдаемая экспериментально, соответствует только флуоресценции зонда. В случае агрегации частиц, когда молекулы раствора находятся на близком расстоянии друг от друга, вероятность миграции энергии очевидно возрастает. Объяснение основывается на теоретических работах Вавилова [81, 82], Перрена [83] и др., которые предположили, что за безызлучательный перенос энергии при концентрационном тушении ответственны индуктивно-резонансные взаимодействия возбужденной и невозбужденной молекул [86]; а также в экспериментах Галанина и Левшина [85], которые показали, что величина тушения флуоресценции посторонними поглощающими веществами пропорциональна коэффициенту поглощения тушителя, и не зависит от ТфЛ донора [85].
На фирменном спектрофлуориметре «Хитачи» были сняты спектры ряда флуоресцентных красителей с целью выяснения их люминесцентных свойств и выбора наиболее подходящего для исследуемых растворов БСА. На следующем рисунке (Рис. 39) представлены экспериментальные спектры испускания и возбуждения красителя 2,6NS, нафтиламинсульфоновой кислоты [Гл.З, 3, с.83].
