Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Проблема прогрессирующего загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами ставит перед современной биологией ряд задач теоретического и практического характера. Одна из важнейших среди них - установление механизмов воздействия тяжелых металлов на растительный организм.
Изменения в свойствах биомембран считаются на сегодняшний день наиболее вероятным механизмом токсических эффектов ионов тяжелых металлов на живую клетку как in vitro, так и in vivo /De Vos and Schat, 1991/. Предполагается, что модификация плазматических мембран, происходящая при взаимодействии ионов тяжелых металлов с клеткой, в дальнейшем запускает комплекс реакций, вызывающих патологические изменения во многих физиологических процессах. Однако до сих пор механизмы первичных эффектов тяжелых металлоз на плазматическую мембрану до конца не расшифрованы. Имеется ряд исследований, в которых при помощи косвенных методов было показано, что под действием тяжелых металлов растет проницаемость плазмалеммы /De Vos et al. 1989; Strange and Macnair, 1991/, но не установлено, с чем связан данный эффект, и как можно предохранить от него мембрану. Следует также отметить, что экспериментальный материал, касающийся механизмов действия тяжелых металлов на плазматические мембраны растений, получен в основном для условий in vitro, в то время как, для мембран животных, грибов и микроорганизмов показано, что эффекты тяжелых металлов in vitro отличаются от эффектов, регистрируемых in vivo /Kiss and Osipenko, 1994/.
Очевидно, что взаимодействие тяжелых металлов с плазмалеммой может проявляться во влиянии на конкретные процессы трансмембранного переноса веществ. Таким образом, для идентификации механизмов первичного действия этих токсикантов на растительную клетку необходимо изучить вызываемые ими изменения в функционировании отдельных ион-транспортных систем плазмалеммы.
В последние годы установлено, что процессы транспорта ионов через плазмалемму растительной клетки в основном реализуются посредством следующих систем: светостимулируемой электрогенной Н*-АТФазной помпы, К*-каналов, быстрых возбудимых Са2*- и СГ-каналов, неселективной ионной утечки, а также специализированных систем транспорта N03", РО43" и СГ, активирующихся в особых условиях /Tester, 1990; Юрин с со-авт., 1991; Tyermann, 1992/. На сегодняшний день данные о действии тяжелых металлов на большинство из вышеприведенных систем отсутствуют.
Среди тяжелых металлов наибольший интерес с точки зрения физиологии растений и агротехнологии представляют поливалентные металлы, относящиеся к микроэлементам. Показано, что такие физиологически важные катионы как медь (Си2*), железо (Fe3* (при рН выше 3.0 этот ион представлен оксо- и гидроксоформами), Fe2*), цинк (Zn2*) и никель (Ni ') в повышенных дозах токсичны для растения /Bergmann, 1992/. Значительный интерес представляют также некоторые тяжелые металлы, не являющиеся необходимыми для роста и развития растений, но содержание которых в окружающей среде постоянно возрастает в результате техногенного загрязнения. Примером металлов такого типа может
служить кадмий (Cd2*), особый интерес к которому в последнее время вызван е чрезвычайно высокой токсичностью для растений, животных и микроорганизмов постоянно растущим содержанием его в среде.
Учитывая приведенные выше факты, исследование влияния ионов тяжелых металлі (Си2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2*, Cd2*) на системы ионного транспорта плазмалемм представляется важными и актуальными.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Настоящ: работа является составной частью научно-исследовательских тем Министерсті образования и науки Республики Беларусь: «Исследование взаимодействия тяжель металлов с плазматическими мембранами растений» (№ госрегистрации: 1996210' «Изучение регуляции протонных АТФаз плазматических мембран растительных клеток» (I госрегистрации: 19962100), «Исследование взаимодействия микроэлементов с системал ионного транспорта плазматических мембран растений» (№ госрегистрации: 19962099).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявлена механизмов модифицирующего действия тяжелых металлов на свойства плазмалеми/ клеток Nitella flexilis путем исследования их влияния на функционирование отдельнь систем ионного транспорта.
Для достижения поставленной цели необходимо было решит следующие основные задачи:
-
Разработать методические приемы и экспериментальные условия, позволяющие изучи действие тяжелых металлов на отдельные транспортные системы плазмалеммы клет Nitella flexilis с помощью электрофизиологических методов.
-
Выявить влияние ионов тяжелых металлов на неспецифическую ионную проводимост ионные каналы и электрогенную Н*-АТФазную помпу плазмалеммы. *
-
Установить характер эффектов тяжелых металлов на плазмалемму в услови: воздействия на клетку различных экзогенных факторов.
Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервь продемонстрированы и проанализированы эффекты Си2*, Fe3*, Fe2*, Zn2*, Ni2*, Cd2* і транспортные свойства плазмалеммы растений на уровне их воздействия на отдельнь системы ионного транспорта in vivo на одном объекте. Показано, что в основе первично токсического действия ионов меди и трехвалентного железа на растительную клетку лежі вызываемый ими рост неспецифической ионной проводимости, блокирование СГ-каналов ингибирование электрогенной Н*-АТФазной помпы плазмалеммы. Показано, что эффею роста проводимости и блокирования СГ-каналов могут быть предотвращены введением среду повышенных уровней Са2*, других поливалентных катионов и антагонистов Са' каналов. Получены свидетельства в пользу того, что вызываемые медью и трехвалентнь железом рост проводимости и блокирование СГ-каналов не связаны с процессаи свободнорадикального окисления липидов. Установлено, что в отличие от Си2* и оксс гидроксоформ иона Fe3*, ионы Zn2*, Ni2*, Cd2* и Fe2* не проявляют бьістроразвивающейі цитотоксичности, опосредованной изменением транспортных свойств плазмалеммы, Ч' свидетельствует о том, что первичный механизм токсичности этих металлов в растении і
связан с нарушением свойств плазмалеммы, а, по-видимому, обусловлен изменениями внутриклеточного метаболизма.
Практическая значимость полученных результатов. Знание закономерностей первичного модифицирующего действия тяжелых металлов на транспортные свойства плазмалеммы создает базу для целенаправленной селекции видов, толерантных к избытку тяжелых металлов, и позволяет обосновать ряд агротехнических подходов, направленных на предотвращение и ослабление эффектов этих токсикантов (например, известкование и т.д.). Апробированные в настоящей работе методические схемы, позволяющие провести быстрое детальное изучение влияния тяжелых металлов на плазмалемму, могут быть применены для анализа первичного действия различных токсических соединений на растительный организм.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Индуцируемое Си2* и оксо-, гидроксоформами Fe3* увеличение проницаемости плазмалеммы растений вследствие роста ее неспецифической ионной проводимости, ингибирование электрогенной І-Ґ-АТФззной помпы и блокирование СГ-каналов являются первичными токсическими реакциями, вызываемыми ионами меди и трехвалентного железа в растительной клетке.
Эффект роста неслецифической ионной проводимости, вызываемый ионами меди и трехвалентного железа, предотвращается под действием повышенных уровней Са2*, Zn2*, Ni2\ Cd2*, Fe2*, H*, антагонистов Са2*-каналов, при понижении температуры, ионной силы раствора и уровня фиксируемого на плазмалемме напряжения, но не изменяется при добавлении ферментативных антиоксидантов, аскорбата и гидроперекиси.
Действие на транспортные свойства плазмалеммы ионов Zn2*, Ni2*, Cd2* и Fe2* проявляется в блокировании К*- и СГ-каналов и ингибировании Н*-АТФазной помпы; цитотоксичность этих тяжелых металлов не связана с прямым мембранотропным эффектом.
Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал, представленный в настоящей работе, получен при решающем участии автора. Обработка результатов экспериментов и их анализ также выполнены непосредственно автором работы.
Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на 51-ой научной конференции зтудентов БГУ (октябрь 1995г.), научной конференции сотрудников биологического факультета БГУ (май 1996г.), научной конференции, посвященной 75-летию БГУ (ноябрь 1996г.), научной конференции, посвященная 70-летию биологического факультета БГУ [ноябрь 1997г.), 2-ом съезде Белорусского общества физиологов растений (Минск, октябрь
-
г.), 2-ом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков. (Минск, июнь
-
г.), практическом курсе Европейского общества молекулярной биологии (ЄМВО) «Сигнальная трансдукция и структура клеточной поверхности» (Венгрия, август 1995г.), 5-ом международном Конгрессе по трейс-элементам в медицине и биологии (Франция, февраль 1996г.), практическом курсе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) «Химия металлов в биологических системах» (Бельгия, май 1996г.), съезде Международного
общества бионеорганической химии (SBIC) «Гомеостаз металлов / Металлы медицине» (Бельгия, май 1996г.), съезде Европейского Железного Клуба (ЕІС) (Испані сентябрь 1996г.), на летней школе Общества чистой и прикладной биофизики (IUPA «Биофизика мембранного транспорта» (Польша, май 1997), лекционном курсе Федерац европейских биохимических обществ (FEBS) «Свободные радикалы, оксидативныи стресс антиоксиданти. Патологическая и физиологическая значимость» (Турция, май-июнь 1997 и других научных мероприятиях.
Опубликованность результатов. Результаты работы по теме диссертац представлены в 10 статьях и 11 тезисах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общ характеристики работы, пяти глав, выводов, списка использованных источников. Спис цитируемой литературы включает 254 литературных источника. Работа изложена на 1 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 38 рисунков.
