Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Особое внимание ученых привлекает участие ионов кальция в передаче внешних сигналов внутрь клетки [Магтое, 1985; Rasmussen et al„ 1990]. Ключевую роль в этом процессе занимает цитоплазматическая мембрана, поскольку под действием внешних стимулов концентрация кальция в цитоплазме увеличивается за счет пассивного поступления ноиов кальция в основном, из внешней среды. Показано, что электрохимический градиент этих ионов на плазмалем-ме может достигать 4 порядков. На основании электрофизиологнческнх экспериментов с клетками харовых водорослей было сделано предположение о том, что основная роль в увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция при физиологических реакциях растений на действие факторов внешней среды принадлежит потенциалзависимым Са-каналам плазмалеммы, через которые кальций входит в клетку [Hepler, Wayne, 1985]- Это предположение подтверждается тем,' что Са-проннцаемость плазмалеммы клеток высших растений, в частности колеоптилей кукурузы, также чувствительна к ингибиторам Са-каналов [Медведев и др„ 1989]. В работе, выполненной на встроен* ных в искусственную мембрану фрагментах плазмалеммы из корней пшеницы электрофизиологическим методом показано, что Са-каналы открываются при потенциалах, намного более отрицательных, чем пороговый потенциал по-тенциалзависнмых Са-каналов животных клеток [Pineros, Tester, 1995], Однако эти данные носят единичный характер. С помощью определения Са-зависимоЙ АТФ-гидролиэутощей активности н изотопных методов' показано, что на плазматической мембране имеются Са-АТФазы, способные осуществлять тонкую коррекцию уровня ионов кальция в клетке [Kubowicz et at., 1982; Dieter, Marme, 1983; Robinson et a!.. 1988; Graf, Weller, 1989; Zocchi, Rabotti. 1993]. Высказано также предположение о том, что удаление кальция из цитоплазмы клеток растений с помощью Са-АТФаз плазмалеммы осуществляется
непрерывно [Briskin
АТФазах плазмалем|іьНрасїнВД1ьвМЄЛИвґШНАмфощиеся в литературе, промоет. .-\ль::.'о ;'' а-садемии и.л. й. А. іимирнзем,
-і990}т-ТпкимдЯЕудЦ. снижения о Са-каналах и Са
тиворечивы, а участие систем мембранного транспорта ионов кальция в реализации гормонального сигнала до сих пор-еще не выяснено. Цель ц задачц исследования . Целью данной работы было оценить участие Са-АТФаз и различных типов кальциевых каналов плазматической мембраны клеток высших растений в мембранном транспорте ионов кальция. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
На основе мебранных везикул и флуоресцентных кальциевых зондов разработать модельную систему, позволяющую анализировать процессы активного и пассивного транспорта нонов кальция через клеточные мембраны растений.
-
Изучить АТФ-зависимый транспорт ионов кальция в мембранных везикулах колеоптилей кукурузы. ..-..
-
Выяснить зависимость транспорта нонов кальция в мембранных везикулах от величины мембранного потенциала.
-
Исследовать действие ионофоров, ингибиторов транспортных АТФаз, и блокаторов ионных каналов на транспорт нонов кальция в везикулах плазма-леммы из клеток растений. ..''.;' -.'.'*
-
Изучить влияние ИУК и механических воздействий на нонную проницаемость плазмалеммы колеоптилей кукурузы.
Научная новизна. Впервые на одной модельной системе - загруженных флуоресцентным зондом везикулах плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы показано функционирование двух типов мембранного транспорта ионов кальция. Проанализирована зависимость работы Са-каналов от мембранного потенциала. Установлено, что система пассивного транспорта нонов кальция плазмалеммы колеоптилей кукурузы представлена потенцналзавнсимыми Сакам аламн, аналогичными потенциалзависимым Са-каналам L-типа животных клеток, а также рецептор управляемым и н механочувствнтельными каналами. Система активного транспорта ионов кальция представлена Са-АТФазоЙ.
Практическая значимость. Проведенные исследования вносят существенный вклад в понимание функционирования ионтранспортнрующих систем (Са-
каналов и Са-АТФаз), локализованных в плазмалемме клеток растений. Раз
работанный экономичный метод загрузки везикул кальциевым зондом с ис
пользованием малых объемов среды загрузки может быть использован при
спектрофлуориметрическом изучении мембранного транспорта ионов в раз
личных объектах. ,
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Третьем Съезде Всесоюзного общества физиологов растений (С.-Петербург,' 1993 г.), Втором Съезде Украинского Общества физиологов растений {Киев, 1993), чтениях, посвященных 160-летию И-АХтебута (С.-Петербург, Пушкин, 1994), Девятом и Десятом Съездах Федерации Европейских обществ физиологов растений (FESPP) (Брно, 1994 г.; Флоренция, 1996), Международном Симпозиуме по биологии мембран растений (Л унд, 1994 г.), Десятой международной школе по биологии мембран растений (Регензбург, 1995 г.), ГордоновскоЙ научной конференции по гравитационной биологин (Иью-Лондон, І996). По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 109 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Список цитированной литературы включает 220 наименований, в том числе 180 на иностранных языках.
