Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Фотосинтетический метаболизм углерода ..12
1.1.1. Образование первичных продуктов фотосинтеза 12
1.1.2. Синтез конечных продуктов фотосинтеза 16
1.1.2.1. Синтез транспортных продуктов фотосинтеза 16
1.1.2.2. Синтез компонентов структуры фотосинтегического аппарата растения .17
1.2. Транспорт ассимилятов 18
1.2.1. Транспорт ассимилятов внутри фотосин тезирующей клетки 18
1.2.2. Выход ассимилятов из клетки и загрузка их в проводящую систему 19
1.2.3. Дальний транспорт ассимилятов 25
1.2.4. Разгрузка флоэмы в органах-акцепторах ассимилятов 26
1.2.5. Роль донорно-акцепторных отношений между фотосинтетическим аппаратом и потребляющими органами в регуляции фотосинтеза 29
1.3. Связь азотного и углеродною метаболизма при фотосинтезе 32
1.3.1. Восстановление нитрата 32
1.3.2. Образование азотсодержащих веществ 36
1.3.3. Влияние уровня азотного питания на фотосиніез 38
1.3.3.1. Влияние уровня азотного питания на интенсивность фотосинтеза 38
1.3.3.2. Влияние уровня азотного питания на фотосинтетический метаболизм углерода 40
1.3.4. Влияние азотного питания растений на транспорт ассимилятов из листьев 42
1.4. Физиологическая роль апопласта 44
1.4.1. Кислотность апопласта 46
1.4.2. Ферментативная активность апопласта 49
II. Объекты и методы исследований 52
2.1. Объекты исследований 52
2.2. Методы исследований 53
2.2.1. Введение в растение экзогенных веществ с транспирационным током воды 53
2.2.2. Изучение газообмена побега льна-долгунца 54
2.2.3. Введение в растения меченого углерода 55
2.2.4. Изучение ассимиляции 14С02 растением льна-долгунца при изменении состава апопластной жидкости 57
2.2.5. Изучение распределения меченых продуктов фотосинтеза по растению льна-долгунца 59
2.2.6. Получение радиоавтографов целых листьев 61
2.2.7. Исследование ультрастуктуры листьев 61
2.2.8. Введение меченой глюкозы в побег льна-долгунца 62
2.2.9. Выделение С-ассимилягов и их хроматограф и чес кий анализ 63
2.2.10. Изучение распределения 14С среди фракций меченых веществ, разделяемых по растворимости 63
2.2.11. Изучение влияния дефолиации или удаления точек роста на состав меченых продуктов фотосинтеза в листьях и пасоке фасоли 64
III. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Влияние введения в апопласт воды или сахарозы на фотосинтез льна-долгунца 66
3.1.1. Ассимиляция І4СОі побегом льна-долгунца 66
3.1.2. Распределение ЫС среди продуктов фотосинтеза листьев льна-долгунца 71
3.2. Влияние введения в апопласт азотсодержащих веществ на фотосинтез льна-долгунца 74
3.2.1. Изменения СОї-газообмена 74
3.2.2. Распределение С среди меченых продуктов фотосинтеза в листьях при введении в апопласт азотсодержащих веществ 79
3.2.2.1. Зрелые листья-доноры ассимилятов 79
3.2.2.2. Молодые листья 93
3.3. Влияние введения в апопласт азотсодержащих веществ на постфотосинтетические превращения и транспорт меченых ассимилятов в растениях льна-долгунца 94
3.3.1. Ассимиляция С средней частью побега льна-долгунца 95
3.3.2. Распределение "С-ассимилятов по растению 98
3.3.3. Включение С в низкомолекулярные продукты фотосинтеза 100
3.3.4. Включение 14С в высокомолекулярные соединения в тканях стебля 108
3.3.5. Влияние введения в апопласт нитратов на динамику отгока ассимилятов из подкормленного ,4СОэ участка побега 110
3.3.6. Влияние введения в апопласт нитратов на динамику распределения ,4С среди низкомолекулярных меченых соединений в донорных листьях 112
3.3.7. Влияние введения в апопласт нитратов на локализацию меченых ассимилятов в листе 113
3.3.7.1. Распределение 4С-ассимилятов внутри целого листа-донора 113
3.3.7.2. Ультраструктурные изменения клеток листа при введении в апопласт раствора нитратов 115
3.4. Влияние введения в апопласт нитратов на метаболизм экзогенной С-глюкозы 118
3.5. Влияние дефолиации или удаления точек роста на состав меченых продуктов фотосинтеза в листьях и пасоке фасоли 120
Заключение 128
Выводы 131
Список литературы 133
- Выход ассимилятов из клетки и загрузка их в проводящую систему
- Влияние уровня азотного питания на фотосинтетический метаболизм углерода
- Изучение ассимиляции 14С02 растением льна-долгунца при изменении состава апопластной жидкости
- Влияние введения в апопласт нитратов на динамику отгока ассимилятов из подкормленного ,4СОэ участка побега
Введение к работе
Накопленные к настоящему времени данные о взаимодействии азотного и углеродного метаболизма в растении свидетельствуют о ею ключевой роли в регуляции жизнедеятельности растения. Показано, что соотношение азота и углерода в растении регулирует фотосинтез, прорастание, старение, морфогенез (Martin et al., 2002; Paul, Pellny, 2003; Paul, Foyer, 2001; Malamy, Ryan, 2001). В то же время механизмы, лежащие в основе этой регуляции, до сих пор не выяснены.
С появлением современных молекулярно-генетических методов было обнаружено, что нитрат влияет на экспрессию множества генов и активность ферментов, в первую очередь связанных с фотосинтезом, углеродным и азотным метаболизмом (Scheible et al., 1997а; Wang et al., 2000). При этом было замечено, что многие гены и ферменты, регулируемые нитратом, одновременно регулируются сахарами (Lejay et al., 1999; Matt et al., 2001; Sehtiya, Goyal, 2000; Stitt et al., 2002; Ortiz-Lopez et al., 2000), а продукты восстановления нитрата оказывают противоположное действие (Paul, Foyer, 2001). Это привело к возникновению представления о том, что для регуляции экспрессии многих ключевых генов углеродного и азотного метаболизмов важно определенное соотношение углерода и азота (Coruzzi, Bush, 2001; Foyer et al., 2003). Для выяснения механизмов такой регуляции необходимо рассмотрение всех точек соприкосновения азотного и углеродного метаболизма в растении.
В связи с этим особый интерес представляют сведения о том, что азотный метаболизм не только вовлекает продукты фотосинтеза в клеточный метаболизм, но и влияет на транспорт ассимилятов в растении. Известно (Тарчевский и др., 1973), что в условиях усиленного азотного питания тормозится транспорт ассимилятов из листьев-доноров.
Ранее предполагалось, что торможение оттока связано с поступлением большого количества азота в листья, которое приводит к активизации
образования азотсодержащих веществ. Поэтому меньше синтезируется транспортных продуктов - Сахаров, в результате чего уменьшается отток ассимилятов к репродуктивным и запасающим органам растения.
Исследованиями, проводимыми в нашей лаборатории, было показано, что негативное влияние усиленного азотного питания на экспорт Сахаров из листа связано, прежде всего, с использованием нитратов (Чиков, 1987). Было обнаружено, что корневая подкормка нитратами приводит к усилению гидролиза сахарозы в апопласте (Chikov et al., 2001), который у многих растений является промежуточным компартментом на пути движения сахарозы к флоэме (Курсанов, Бровченко, 1969). Известно, что образующиеся при гидролизе сахарозы глюкоза и фруктоза не могут загружаться во флоэму (Туркина и др., 1999), и, следовательно, отток ассимилятов из листьев будет снижаться. Таким образом, было предложено новое объяснение механизма торможения оттока ассимилятов в условиях повышенного азотного питания.
В то же время при исследовании на целом растении оставалось непонятным, связано ли усиление гидролиза сахарозы при подкормке нитратами с поступлением самого нитрат-иона в апопласт листьев или же с метаболизацией нитрата в корнях.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было выяснение того, являются ли изменения фото синтетического метаболизма углерода и торможение оттока ассимилятов, наблюдаемые при повышенном азотном питании растений, следствием поступления нитрат-иона в апопласт листа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние введения в апопласт листа раствора сахарозы, как основного транспортного продукта фотосинтеза, на фотосинтетический метаболизм углерода.
Оценить влияние введения в апопласт раствора KNO-} на С02-
газообмен и ассимиляцию 14С02 побегом льна-долгунца.
Проанализировать распределение |4С среди меченых продуктов фотосинтеза в листьях в присутствии окисленного или восстановленного азота в апопласте.
Проследить посгфотосинтетическую динамику распределения |4С-ассимилятов между разными органами растения в присутствии окисленного или восстановленного азота в апопласте.
Определить постфотосинтетические изменения в распределении 14С среди меченых низкомолекулярных соединений в зрелых листьях-донорах при введении в апопласт побега окисленного или восстановленного азота.
Научная новизна работы В модельных опытах впервые установлено, что изменения хлоропластных процессов ассимиляции СОг (снижение фиксации ССЬ, уменьшение синтеїа сахарозы и сильная активация гликолатного метаболизма), наблюдавшиеся ранее при повышенной подкормке растений нитратами, связаны с поступлением нитрат-иона в апопласг листьев. Впервые установлено, что введение нитратов в апопласт приводит к торможению экспорта сахарозы и ее накоплению в листьях. Показано, что эти изменения связаны непосредственно с присутствием нитрат-иона и не обнаруживаются при поступлении в апопласт восстановленного азота в составе мочевины.
Впервые обнаружено, что присутствие в апопласте нитрат-иона приводит к появлению вакуоли в сопровождающих клетках флоэмы, что может свидетельствовать о торможении транспорта ассимилятов по флоэме в присутствии нитратов в апопласте листа.
Установлено, что возникновение в растении избытка или дефицита ассимилятов вызывает противоположное изменение соотношения синтеза аминокислот из новообразованных продуктов фотосинтеза в корнях и листьях. Эти изменения наблюдаются лишь в пределах одного фотопериода.
*
Практическая значимость работы
Получены экспериментальные данные, указывающие на наличие нового лимитирующего звена в транспорте ассимилятов из листа. Это являєіся основой для поиска принципиально новых путей управления продукционным процессом растения, повышения эффективности использования азотных минеральных удобрений, а также снижения загрязнения природы нитратами.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на V съезде общества физиологов растений России "Физиология растений -основа фитобиотехнологии" (Пенза, 2003), итоговых научных конференциях Казанского научного центра РАН (2003, 2004, 2005), Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2004, 2006), Международной конференции «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2004), Международной научной конференции «Вопросы общей ботаники - традиции и перспективы» (Казань, 2006), IX (I) Международной конференции молодых ботаников (Санкг-Петербург, 2006), Втором международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), XV Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (Lyon, 2006).
+
Благодарности
Автор выражает огромную благодарность д.б.н., проф. Владимиру Ивановичу Чикову за неоценимую помощь в постановке задач и обсуждении полученных результатов, к.б.н., с.н.с. Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН Фариту Агитовичу Абдрахимову за помощь в проведении электронно-микроскопического анализа, всем сотрудникам лаборатории биохимии апопласта, а также студентам и выпускникам Казанского государственного университета М.Б. Лукманову, Л.И. Грищенко, B.C. Булдакову, Н.И. Ананьевой, О.В. Ворончихиной, Р.А. Савукинайте за помощь в проведении исследований.
Выход ассимилятов из клетки и загрузка их в проводящую систему
В 1930 году Мюнх впервые подразделил гранспортные пуги, служащие для передвижения веществ по растению, на апопластическое и симпластическое пространство (Munch, 1930).
Симпластная система образуется из протопластов соседних клеток, соединенных плазмодесмами и ограниченных плазмшіеммой. Движение по плазмодесмам не имеет ограничений для веществ, молекулярная масса которых не превышает 1.5 кДт (Terry, Robards, 1987). Скорость симпластического транспорта - 2-4 см/ч (Гамалей, 1990).
В отличие от симпласта, апопласт (АП) (или свободное пространство) расположен вне цитоплазмы. К нему относят все, что находится с внешней стороны плазмалеммы. Эта транспортная система включает в себя целлюлозный скелет клеточных стенок, водную фаіу, омывающую плазмалемму и пропитывающую мицеллы и фибриллы клеточных стенок, и газообразную фазу межклетников. Так как в растении клеточные стенки образуют целостный скелет, то можно говорить о целостности и непрерывности всею апопласга растения. Размер интерфибриллярных и интермицеллярных пространств составляет 3.5 - 5 нм (Sattelmacher, 2001), полому целлюлозно-гемицеллюлозная сеть клеточных стенок не представляет серьезного барьера для диффузии небольших молекул. Рыхлость клеточных стенок может изменяться в ходе онтогенеза (Titel et al., 1997) и дифференцировки клетки (Lynch and Staehelin, 1995). Скорость транспорта по апопласту составляет до 10 м/ч (Чиков, Бакирова, 2004). Доля меченых ассимилятов, находящихся в АП, оказалась весьма чувствительной к условиям протекания фотосинтеза. Внезапное увеличение количества образующихся ассимилятов (в результате повышения освещенности или концентрации СОІ) вызывало их накопление в АП (Чиков, Бакирова, 2004).
Загрузку флоэмы ассимилягами обеспечивает специализированный отдел флоэмы, находящийся в контакте с фотосинтегической тканью, 20 терминальная флоэма листа (Гамалей, 1990). Флоэма покрытосеменных включает в себя несколько типов клеток: ситовидные элементы (СЭ), сопровождающие клетки (СК) и наренхимные клетки флоэмы (Kiihn, 1999). После деления их общей материнской клетки СЭ и СК остаются в тесном симпластном контакте и ведут себя как единая функциональная единица, что привело к возникновению термина "комплекс ситовидный элемент -сопровождающая клетка" (КСЭСК) (Kiihn, 1999). Плазмодесмы (ПД), соединяющие СЭ и СК, ветвятся на стороне, обращенной к СК, и получили название «поро-плазмодесменные единицы». Они свободно пропускают вещества с молекулярной массой 3-20 кДа (Oparka, Turgeon, 1999).
Для классификации видов растений на основании механизма загрузки флоэмы были использованы анатомические черты (Гамалей, 1990; Flora and Madore, 1996). В соответствии с частотой плазмодесм между КСЭСК и окружающими клетками растения можно разделить на три группы: виды, имеющие мелкие жилки открытого типа имеют множественные ПД между КСЭСК и флоэмной паренхимой, обкладкой сосудистых пучков или мезофильными клетками. СК часто видоизменены в промежуточные клетки (ПК), (по: Fischer, 1884), и полагают, что загрузка флоэмы происходит симпластически. Это современные тропические виды и виды тропического происхождения (Гамалей, 1990). У этих видов главными транспортными сахарами являются галактоз ильные олигосахариды, такие как стахиоза, раффиноза и вербаскоза, хотя у некоторых видов в качестве основных транспортируемых веществ встречаются сахароза или сахароспирты (Гамалей, 1990; Kiihn, 1999). В условиях стресса состав транспортируемых по флоэме соединений углерода может изменяться (Туркина и др., 1999).
У мелких жилок, относимых к группе примитивного закрытого типа 2а (например, Nicotiana tabacum), симпластная связность КСЭСК может быть от низкой до средней, в то время как у продвинутого закрытого типа 26 (например, Vicia faba) КСЭСК практически симпластно изолирован от окружающих клеток, делая необходимым включение апопластноіо этапа в процесс загрузки флоэмы. У видов с доминирующим апопластным путем загрузки ведущей транспортной формой Сахаров является сахароза (Гамалей, 1990). У ряда «апопластных» видов, основными транспортными углеводами являются сахарные спирты, такие как манитол и сорбигол (Loescher, 1987). Апопластньте виды часто показывают видоизменения либо СК, либо паренхимных клеток мелких жилок в передаточные клетки (по: Pate, Gunning, 1969), для которых характерно наличие протуберанцев оболочки, при этом площадь поверхности плазмалеммы может увеличиваться до 20 раз (Kiihn, 1999).
Считают, что виды, принадлежащие к группе переходного типа 1-2а, обладают симпластной и апопластной загрузкой одновременно (например, Catharanihus rosens) (Kiihn, 1999).
Появление особенностей строения СК связано с достижением листом экспортной зрелости (Гамалей, 1998). Полагают, что у симпластных растений системой канализированного транспорта ассимилятов может быть ЭР (Гамалей, 1990). Первый этап на пути симпластической загрузки ассимилятов - компартментация продуктов фотосинтеза в вакуолях клеюк мезофилла. Учитывая данные о непрерывности элементов ЭР и вакуолей, возникло предположение, что именно этот континуум является каналом симпластического оттока ассимилятов ("эндопласт"). Однако вопрос, что является транспортным каналом в плазмодесмах: внешний цитоплазматический аннулус или внутренняя трубочка ретикулума до сих пор еще не решен. У С4 растений хлоренхимная обкладка пучка имеет многочисленные плазмодесменные поля на стенке, обращенной к мезофиллу. В то же время, у большинства С4 растений клетки обкладки не имеют прямых симпластических контактов со спутниками СЭ, т.е. дальнейший путь ассимилятов должен проходить через апоиласт. (Гамалей, 1990). Важный и наименее ясный аспект транспорта - механизм аккумуляции Сахаров в СК. Подъем концентрации Сахаров в спутниках - 50-100-кратный относительно апопласта (Курсанов, 1984) и только 4-кратный относительно симпласта (Гамалей, 1990). Для симпластической загрузки предложены две модели сфинктеров, регулирующих диамеїр пропускного отверстия плазмодесм: 1) белковый, состоящий из сократительных фибрилл, расположенных в цитоплазматическом кольце и пережимающих ретикулярный канал (Evert et al., 1977); 2) глюкановый, основанный на обратимых трансформациях каллозной обкладки вокруг плазмодесм, перекрывающих цитоплазматическое кольцо (Olesen, 1979). Turgeon предложил гипотезу полимеризационной ловушки (polymerization trap) (Turgeon, Oparka, 1999), которая основывается на ингибировании диффузии раффинозы и стахиозы, синтезируемых из сахарозы после симпластной загрузки в ПК, обратно в область обкладки сосудистого пучка/мезофилла из-за сужения ПД на конце, обращенном к ПК. Ферменты, участвующие в синтезе раффинозы или стахиозы, были иммунолокализованы в переходных клетках (Holthaus and Schmitz, 1991; Beebe and Turgeon, 1992). Согласно модели, предлагаемой Гамалеем (Гамалей, 1985), поддержание низкого концентрационного градиента между цитоплазмой мезофильных клеток и флоэмными клетками могло бы быть возможным просто путем внутриклеточной компартментализации транспортируемых Сахаров.
Влияние уровня азотного питания на фотосинтетический метаболизм углерода
На первый взгляд, данные литературы о действии азотного питания на транспорт ассимилятов противоречивы. Например, в одних публикациях отмечается, что дополнительное азотное питание тормозит отток ассимилятов из листьев (Ваклинова и др., 1958; Захарчишина, Пилипенко, 1965; Кудрявцев, Роктанен, 1965), в других отмечается обратная закономерность (Анисимов, 1959; Приступа, Курсанов, 1957; Hartt, 1970).
Было показано (Чиков, 1987), что очень важен период онтогенетического развития растений, в котором проводится опыт. Подкормка азотом голодающих по этому элементу ювенильных растений, у которых система донора и акцептора ассимилятов состоит из листьев и корней, приводит к резкой интенсификации притока ассимилятов к корням для активной метаболизации минерального азота, и эти результаты, по-видимому, будут истолкованы как активизация азотной подкормкой транспортных процессов. С другой стороны, азотные удобрения у взрослых растений с оформившимися донорно-акцепторпыми отношениями обычно приводят к относительному торможению оттока ассимилятов из листьев в потребляющие их органы.
Ранее предполагалось, что торможение оттока и разрастание листьев связано с тем, что при поступлении большого количества азота в листьях активируется образование азотсодержащих веществ с использованием углерода, фиксированного в ходе фотосинтеза, и поэтому меньше образуется транспортных продуктов фотосинтеза - Сахаров. Позднее было показано {Чиков, 1987), что негативное влияние усиленного азотного питания на экспорт Сахаров из листа связано, прежде всего, с нитратным питанием. Было обнаружено (Chikov et al., 2001), что корневая подкормка нитратами приводит к усилению гидролиза сахарозы в апопласте, который у многих растений является промежуточным компартментом на пути движения сахарозы во флоэму. Извес гно, что гексозы не могут загружаться во флоэму (Туркина и др., 1999), и, следовательно, отток ассимилятов из листьев будет снижаться.
Наблюдаемое усиление поступления углерода в процессе фотосинтеза в аминокислоты при повышении уровня азотного питания является результатом активизации ростовых процессов и связанных с этим синтетических процессов в самом листе-доноре ассимилятов (Чиков, 1987). И сахароза, и глюкоза индуцируют экспрессию генов циклинов cycD2 и сусОЗ (Riou-Khamlichi et al., 2000). Также есть примеры образования более крупных толстых листьев у растений, выращенных при повышенном С02, (Магосо et ah, 2002) и восприятие сахарозы было замешано в регуляции формы листа (Hanson etal., 2001).
Одной из причин относительной задержки ассимилятов в листьях могут быть морфологические изменения растений. Так, И. В. Мосолов (1969) наблюдал уменьшение доли проводящих тканей, приходящейся на единицу массы органоидов клеток мезофилла листьев у растений удобренных вариантов. При применении различных форм азотных удобрений (аммониевой или нитратной) наблюдаются значительные отличия в реакции растения на подкормку азотом. Подкормка высокими концентрациями нитрата приводит к предпочтительной стимуляции роста побега и ингибированию роста корней и задерживает цветение и старение (Sheible et al., 1997а). Таким образом, условия экспорта ассимилятов значительно меняются под действием уровня азотного питания, причем это находит отражение и в изменении направленности фотосинтетического усвоения ССЬ. Торможение экспортной функции при повышении уровня азотного питания сопровождается усилением неуглеводной направленности фотосинтетического усвоения углекислоты. В случае завершения листом собственно ростовой функции эти изменения снижают интенсивность фотосинтеза и его эффективность. Мюнх полагал, что единственной функцией апопласта является транспорт воды и растворенных веществ. В настоящее время стало очевидным, что функции апопласта гораздо многочисленнее, и было предложено рассматривать апопласт как внутреннюю физиологическую окружающую среду растений, поддержание гомеостаза в которой имеет существенное значение {Sattelmacher, 2001). Во многих случаях стимулы окружающей среды воспринимаются не напрямую клеткой, а через изменения в этой внутренней среде. В качестве примера можно привести ответ на фитогормоны, такие как ауксин {Tsurusaki et al., 1997) или на атаку патогенов (Kibaetal., 1997). Физико-химические свойства клеточных стенок влияют на минеральное питание растений, так как питательные вещества не просто движутся по апопласту к плазмалсмме, но могут адсорбироваться или фиксироваться компонентами клеточных стенок. Физические и химические свойства клеточных стенок зависят от ряда параметров, включающих онтогенез, такие факторы как температура, осмотический стресс, свет, тяжелые металлы и обеспеченность питательными веществами (Sattelmacher, 2001). Поскольку пектиновые вещества (полиуроновые кислоты) клеточных стенок в своем составе содержат карбоксильные группы, клеточные оболочки приобретают свойства катионообменников и могут концентрировать положительно заряженные вещества. Катионообменная способность (КОС) растительной ткани регулируется такими ферментами, как пектинметилэстераза, которая деметилирует пектины с образованием пектиновых кислот и таким образом увеличивает КОС. На пектинметилэстеразу могут влиять полиамины в апопласте (Messiaen et al., 1997), а, следовательно - азотное питание растений (Gerendaset al., 1993).
Апоиласт корня является тем компартментом растения, который первым сталкивается с неблагоприятными химическими условиями почвы, такими как высокие концентрации Na1" или АГ. Поэтому условия в апопласте корня определяют ответную реакцию всего растения (Sattelmacher, 2001). Клеточные стенки участвуют в детоксикации алюминия (Maison and Bertsch, 1997). Было показано, что форма азотной подкормки (NCV или NHV) оказывает большое влияние на устойчивость к токсическому действию алюминия (Grauerand Horst, 1990).
Осмотический потенциал апопластного содержимого на 75% определяется сахарами и неорганическими ионами (главным образом калием, натрием и хлоридом) (Чиков, Бакирова, 2004). По данным работы (Muhling, Sattelmacher, 1995) концентрации кальция и калия в АП колеблются от 0.3 до 0.8 и от 1.3 до 4.5 тМ соответственно. По другим данным (Shabala, 2003) концентрация калия может составлять до 26 мМ, и сильно зависит от изменения освещенности или засоленности. Было показано, что свет вызывает уменьшение апопластного Кт в листьях, сопряженное с повышением активности ЬГ-АТФазы плазмалеммы (Muhling, Lauchli, 2000). Апопластная концентрация К сильно коррелирует с жилкованием листа (Shabala et al., 2002). В адаптированных к свету листьях активности калия и кальция в апопласте подустьичной полости составляют 2.59 мМ и 64 мкМ, соответственно (Felle et al., 2000).
Изучение ассимиляции 14С02 растением льна-долгунца при изменении состава апопластной жидкости
Наличие ферментативной активности в АП установлено уже давно. И одной НІ первых в АП была обнаружена инвертаза (Бровченко, 1970), оптимум которой лежит в кислой области рН. Активность кислой инвертазы в АП снижается по мере распускания листьев (Huber, 1989), что находится в обратной корреляции с развитием их экспортной функции.
В апопласте был обнаружен ряд ферментов, осуществляющих окислительно-восстановительные реакции. Помимо ферментов, непосредственно присутствующих в апопласте, большое влияние на апопластную среду оказывают окислительно-восстановительные системы ПМ, способные передавать электроны от внутриклеточных доноров на внеклеточные акцепторы (Vuletic et al., 2005). В клеточной стенке обнаружена НАДН-оксидаза 1, связывающий сайт которой локализуется на апопластной стороне плазматической мембраны (Моггё, Brightman, 1991). В ПМ обнаружена суперокиедсинтаза (Murphy, Auh, 1996; Vuletic et al., 2003), которая, как полагают (Menckhof f, Liithje, 2004), переносит электроны от цитозольного НАД(Ф)Н на кислород в апопласте с образованием супероксидрадикалов. В последние годы во внеклеточном пространстве была обнаружена супероксиддисмутаза (Vuletic et ai., 2003; Streller, Wingsle, 1994; Ogawa et al., 1996), катализирующая образование H202 из супероксида.
Роль активных форм кислорода в метаболических процессах апопласта, обычно обсуждается в связи с их участием в синтезе компонентов клеточной сгенки, развития патологических процессов (Vianello, 1991) и так называемого "окислительного взрыва" (Bowell, 1995).
Есть мнение (Чиков, Бакирова, 2004), что свободно-радикальные процессы, влияя на жидкую среду АП (например, супероксиддисмутаза, связывающая суиероксид с протоном), могут, по-видимому, изменять и рН среды, а, следовательно - активность апопластных ферментов, некоторые из которых, вполне вероятно, участвуют в транспорте сахарозы. Активность антиоксидан їньїх систем апопласта коррелирует с устойчивостью растений к засолению (Hernandes et al., 2001).
Помимо внутриклеточной формы нитратредуктазы, небольшая доля конститутивной нитратредуктазы ассоциирована с плазматической мембраной, выделенной из корней и побегов различных высших растений {Ward et al., 1988; Ward et al., 1989; De Marco et al., 1994; Stohr, Ullrich, 1997). Активность связанной с плазматической мембраной HP составляет 1.7% от общей в клетках моркови, около 20% в корнях кукурузы и около 4% в корнях ячменя. В корнях была обнаружена особая форма HP ПМ, которая может принимать электроны не только от НАДН и НАДФН, но и от сукцината (Stohr, Ullrich, 1997). В ПМ корней была обнаружена также нитрит-NO-редуктаза, участвующая в образовании NO-радикала из нитрита (Stohr, Ullrich, 2002). Эти авторы полагают, что нитрит-ЫО-редуктаза и сукцинат-зависимая HP жестко ассоциированы друг с другом на апопластной поверхности ПМ корней. Ни один из этих двух ферментов не был найден в побегах растений или цитозоле.
У ряда видов растений обнаружено (Angelini, Federico, 1990), что ди- и полиаминооксидаіьі, а также пероксидаїьі, локализованные в АП, участвуют в деградации полиаминов. Сопутствующим продуктом при этом является НіОі. Перекись водорода, как и сами полиамины, имеющие положительный заряд, также, вероятно, влияет на АП среду, в результате чего может измениться и активность АП ферментов, в том числе, например, инвертаїьі.
Освобождающийся в АП при деградации полиаминов аммиак участвует в формировании NHj-компенсационной концентрации в межклетниках. Если концентрация аммиака во внешней среде оказывается ниже, то он теряется и, наоборот, если выше - то он усваивается (Husted, Schjoerring, 1996). Усвоение растением газообразного а юта может достшать существенных значений (Farouchar et al., 1980).
Таким образом, движение ассимилятов во флоэму и из нее, по крайней мере, у части растений, происходит через апопласт - метаболически очень активную среду. Следовательно, любые факторы, влияющие на апопластную среду, могут воздействовать на распределение ассимилятов по растению. Еще в 1984 году АЛ. Кургановым была высказана мысль, что дальний транспорт ассимилятов в значительной мере направляется и контролируется теми явлениями, которые происходят на старте этого пуш - в доноре и на его финише- в акцепторе ассимилятов (Курсанов, 1984).
Накопленные в литературе данные указывают на существование сложной взаимосвязи между азотным и углеродным метаболизмом в растении. Сходное влияние пониженною транспорта ассимилятов и повышенного азотного питания на фотосинтез и фотосинтетический метаболизма углерода позволяет предполагать существование общего механизма регуляции фотосинтеза этими факторами. Было обнаружено, что при повышенной подкормке растений нитратами усиливается гидролиз сахарозы в апопласте (Chikov et al., 2001). В то же время, оставалось неизвестным, связано ли действие высоких доз нитратных удобрений с метаболизмом нитрата или с присутствием ионов нитрата в апопласте.
Наши исследования проводились на растениях льна-долгунца (Limtm usitatissimutn L.) сорта Новоторжский и растениях фасоли (Phaseolus vulgaris L.). Оба этих объекта относятся к видам с апопластной загрузкой флоэмы: по классификации Ю.В. Гамалея лен относится к продвинутому закрытому типу 26, а фасоль- к примитивному закрытому типу 2а (Гамалей, 1990).
Лен культурный является важной технической культурой и используется для получения ценных сортов масла, а также текстильного волокна. Лен-долгунец представляет собой достаточно удобный объект для изучения донорно-акцепторных отношений. При достаточно большой высоте, к концу периода быстрого роста достигающей 60-70 см, это растение но всей длине побега имеет многочисленные, равноценные, завершившие рост листья, выполняющие роль типичных экспортеров ассимилятов. При этом потребляющими ассимиляты органами являются корни и хороню выраженная, активно растущая верхушка.
Опыты проводились на вегетационной площадке Казанского института биохимии и биофизики. Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в сосудах емкостью 7 кг воздушно сухой серой лесной почвы по методике описанной Э.Н. Журбицким (1968). Преимущество вегетационного опыта заключается в возможности поддержания оптимальной влажности почвы в сосудах.
Влияние введения в апопласт нитратов на динамику отгока ассимилятов из подкормленного ,4СОэ участка побега
Наиболее прямым методом определения интенсивности оттока ассимилятов из листьев является метод меченых атомов (Полимбетова, Мамонов, 1967; Тарчевский, Биктемиров, Иванова, 1973), Он имеет ряд преимуществ перед другими методами. Во-первых, он позволяет непосредственно судить об интенсивности процесса оттока свежеобразованных ассимилятов, а во-вторых, в сочетании с другими методами - хроматографией и радиоавтографией - этот метод позволяет проследить за образованием и передвижением отдельных продуктов фотосинтеза, таких как сахара, аминокислоты и ряд других.
Морфологические особенности льна-долгунца не позволяют изучать интенсивность фотосинтеза и распределение ассимилятов по растению, используя традиционные методы (когда фотосинтетическая камера одевается на отдельный лист), т.к. на растении льна-долгунца за сезон вырастает до 80-100 очень мелких, функционально, по-видимому, равнозначных листьев. Поэтому в нашей лаборатории был разработан метод изучения распределения ассимилятов по растению, когда в фотосинтетическую камеру помешают средний участок побега с завершившими рост листьями (Аввакумова, 1999).
Для выяснения того, как влияет введение в апопласт различных форм азота на транспорт ассимилятов по растению, в целый срезанный под водой побег льна-долгунца с транспирационным током воды вводили растворы мочевины (0.15%), КЖЬ (0.5%), NH4N03 (0.2%) (рис.4). Все вводимые растворы были выровнены по содержанию азота. Контролями служили растения, в которые вводили дистиллированную воду. Через 1 час после начала введения растворов среднюю часть растения экспонировали в НС02 в течение 3 мин (рис.66). Фотосинтетическая камера представляла собой термостатируемую листовую камеру-при щепку с мягкой резиновой прокладкой, аналогичную описанной (Оя, Расулов, 1981). Участок побега, помещаемый в камеру, имел множество (до 10) мелких листьев, что обеспечивало хороший фотосинтез этого участка. Эта часть далее служила донором меченых ассимилятов для всего остального растения. После этого у одной группы растений подкормленный участок побега расчленяли на листья и стебель и фиксировали кипящим (80%) этанолом. Другую группу растений оставляли для изучения дальнейшего постфотосинтетического распределения метки по растению. Часть побега, находившуюся в листовой камере, отмечали цветными нитками.
Через 30 минут или 3 часа после экспонирования в ,4С02 растения разрезали на три части: верхнюю (выше иС-донорной), "С-донорную и нижнюю (ниже ,4С-донорной части побега). Донорную часть делили на листья и стебель. Верхнюю часть делили на верхушку (участок выше «точки слома»), зрелые листья, луб и древесину, а нижнюю - на зрелые листья, луб и древесину. Все части растения фиксировали в кипящем (80%) этаноле. При фиксации из ,4С-донорного участка каждого растения брали по одному листу для изучения распределения 14С внутри листа с помощью радиоавтографии.
После определения радиоактивности зафиксированных проб, рассчитывали распределение ассимилятов по растению в процентах от суммарной радиоактивности всех анализируемых частей. В полученном зафиксированном материале определяли распределение !4С среди меченых низкомолекулярных веществ. Зафиксированные луб и древесину нижней части растения, взяїьіе через 3 часа после экспонирования средней части в 4СС 2, использовали для изучения распределения 14С среди фракций меченых веществ, разделяемых по растворимости. Радиоавтографы целых листьев получали по методике, описанной в » работе (Franceschi, Tarlyn, 2002), с некоторыми изменениями. Срезанные листья заворачивали в толстую хроматографическую бумагу и высушивали как гербарий. Высушенные листья приклеивали клеем на бумагу нижней стороной листа вверх, к которой прижимали рентгеновскую пленку с помощью пресса. Пленку проявляли через 24 часа экспонирования при -10С. Полученные радиоавтографы сканировали с помощью сканера Hpson Исследования проводились совместно с к.б.н., с.н.с. Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН Ф.А. Абдрахимовым. В апопласт растения льна-долгунца с транспирационным током воды вводили раствор KNO3 (0.5%). Для электронно-микроскопического анализа через 1 час после начала введения раствора отсекали донорные листья и фиксировали их 2.5% глутаровым альдегидом в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2), при комнатной температуре в течение 12 ч, а затем 1% Os04 в том же буфере с добавлением сахарозы (34 мг/мл) в течение 2 ч. Далее образцы дегидратировали в возрастающих концентрациях этанола (30, 40, 50, 60, 70, 96 %), ацетоне и окиси пропилена. Образцы заливали эпоксидной смолой (Энон-812, "Serva", Германия). І Іолимеризовали в течение трех суток в термостате при температуре 37(1С, 45С и 60"С. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-11I ("LKB", Швеция), последовательно контрастировали 1.5% водным раствором уранилацетата при 60С (30 мин) и цитратом свинца при комнатной температуре (10 мин). Препараты просматривали в электронном микроскопе Jem-1200 EX (Япония). Исследование метаболизации 14С-глюкозы в донорных листьях льна-долгунца проводили в период быстрого роста побега, когда его длина достигала 50 см. Использовалась меченая по С2 D-глюкоза отечественного производства с исходной удельной радиоактивностью препарата - 5.6 ГБк/л и массовой концентрацией - 0.58 г/л. Конечная концентрация 14С-глюкозы в растворе составляла 1.73-10"" г/л.
