Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Физические основы 9
1.1. Сжимаемость раствора. Скорость ультразвука.. 9
1.2. Поглощение ультразвука. Связь со скоростью.. II
1.3. Температурная зависимость объема и сжимаемости воды. Модель Холла 13
1.4. Аддитивность кажущегося объема по атомному составу 19
1.5. Аддитивность кажущейся сжимаемости по атомному составу 25
1.6. Сжимаемость и гидратация. Модель сплошной среды 27
1.7. Сжимаемость и гидратация. Дискретная модель 32
1.8. Локальность гидратационныЗС изменений 36
1.9. Заключение 37
Рисунки к главе 39
Глава 2. Комплекс приборов и методик для прещзионных акустических исследований 46
2.1. Выбор метода измерения скорости и поглощения ультразвука. Краткий обзор литературы 46
2.2. Акустические резонаторные ячейки интерферометра 49
2.3. Дифференциальный ультразвуковой интерферометр 52
2.4. Технические характеристики интерферометра... 55
2.5. Другой вариант ультразвукового резонаторного интерферометра 57
2.6. Измерение кажущегося объема растворенного вещества 58
2.7. Капиллярный дилатометр 59
2.8. Измерение рН среды в акустической ячейке... 61
2.9. Дозирование порошков и жидкостей 62
2.10.Определение влажности препаратов 64
2.11.Методики измерения концентрационных, температурных и рН-зависимостей скорости ультразвука 65
Рисунки к главе 69
Глава 3. Связь ультразвука и сжимаемости растворов аминокислот с химической природой отдельных групп 76
3.1. Обзор литературы 76
3.2. Материалы 84
3.3. Результаты 85
3.4. Гомологические ряды. Взаимодействие алифатического радикала с функциональной группой. Вклад(Br, группы в сжимаемость 91
3.5. Связь сжимаемости с площадью поверхности молекулы. Гидратация алифатических и ароматических атомных групп 94
3.6. Полярные атомные группы 97
3.7. Боковые группы метионина и цистеина 100
3.8. Косжимаемость 101
3.9. Вклады концевых групп пептида и остатка глицина в сжимаемость 101
3.10.Сжимаемость заряженных групп 102
3.11.Эффекты ионизации атомных групп 104
3.12.Вклады аминокислотных остатков в сжимаемость 106
3.13.Аддитивность кажущейся сжимаемости низкомоле кулярных соединений по атомному составу... 107
3.14. Заключение 109
Таблицы и рисунки к главе III
Глава 4. Связь сжимаемости со структурой белка 152
4.1. Обзор литературы 152
4.2. Материалы и методы. 158
4.3. Результаты 159
4.4. Сравнение кажущейся сжимаемости и кажущегося объема белков 162
4.5. Связь кажущейся сжимаемости белка с удельной поверхностью. Усредненная сжимаемость глобул 163
4.6. Расчет кажущейся сжимаемости по аддитивной схеме. Сжимаемость глобулы индивидуальных белков 167
4.7. Температурные зависимости Л, срК и (сводка данных) 172
4.8. Денатурация глобулярных белков 174
4.9. Заключение 185
Таблицы и рисунки к главе 187
Заключение 209
Основные результаты и выводы 210
- Температурная зависимость объема и сжимаемости воды. Модель Холла
- Выбор метода измерения скорости и поглощения ультразвука. Краткий обзор литературы
- Гомологические ряды. Взаимодействие алифатического радикала с функциональной группой. Вклад(Br, группы в сжимаемость
- Связь кажущейся сжимаемости белка с удельной поверхностью. Усредненная сжимаемость глобул
Введение к работе
Актуальность темы. Адиабатическая сжимаемость среды экспериментально определяется из скорости ультразвука и плотности среды. Интерес к сжимаемости растворов белков обусловлен двумя причинами.
Различные процессы с изменением структуры и гидратации белка в растворе сопровождаются изменением сжимаемости раствора и, следовательно, могут быть зарегистрированы с помощью измерений скорости ультразвука.
Особый интерес представляет определение сжимаемости белка как микрофазы, механические свойства которой могут быть существенной характеристикой состояния и могут, вероятно, играть определенную роль в функционировании белков (Ю.И.Хургин, Д.С.Чернавс-кий и С.Э.Шноль /56,57/; Л.А.Блгоменфельд /3/).
Однако до 70-х годов исследования белков с помощью измерений скорости ультразвука проводились лишь эпизодически (работы А.Г.Па-сынского /32,34/ в СССР и работы Б.Якобсона /124/, Ю.Мияхары /148/, Л.Кесслера и Ф.Данна /131/ за рубежом). Информативность их была низка. Сделать скорость ультразвука и сжимаемость более информативными характеристиками невозможно без систематического исследования большого числа соединений, от низкомолекулярных до биополимеров, в различных физико-химических условиях (температура, рН и др.). Необходимо выявить различные вклады в сжимаемость раствора белка, определить связь между сжимаемостью раствора (скоростью ультразвука) и структурой молекулы. Совокупность таких данных должна составить эмпирическую базу для молекулярной интерпретации измеряемых величин. В свою очередь для систематических исследований необходимо создание адекватной измерительной техни-к и, позволяющей измерять скорость ультразвука с высокой точно- стью в небольшом количестве исследуемого материала - без такой техники невозможны исследования веществ, доступных в небольших количествах.
Задача создания прецизионной ультразвуковой измерительной техники для регистрации малых гидратационных возмущений в растворе белка была поставлена С.Э.Шнолем в 60-х годах,и А.П.Сарвазян разработал основные принципы измерения, позволяющие сконструировать адекватный прибор.
К началу настоящей работы (1973г) не было ни необходимой техники, ни систематических данных по скорости ультразвука и по сжимаемости растворов биологических веществ. И работа начиналась с конструирования прецизионного измерителя, предназначенного для исследования биологических соединений.
Параллельно с ходом нашей работы в 70-80-х годах другими авторами также был проведен ряд систематических исследований белков (С.Я.Никитин /24,25,155/; К.Гекко и Х.Ногучи /102/) и нуклеиновых кислот (В.А.Букин /5-7,72/). Метод исследования физико-химических свойств растворов с помощью измерений скорости ультразвука получил недавно название ультразвуковой велосиметрии (А.П.Сарвазян /42/).
Цель работы состоит в создании эмпирической базы для молекулярных исследований белков в растворе с помощью измерений скорости ультразвука и сжимаемости раствора.
Основные задачи: I) провести анализ физических основ ультразвуковой велосиметрии и возможности аддитивного описания растворов сложных молекул через вклады компонентов молекулы; 2) создать установку для прецизионного измерения скорости ультразвука в малом объеме жидкости и разработать методики прецизионных измерений; 3) исследовать разбавленные растворы аминокислот и органичес- ких кислот с целью количественного анализа вкладов отдельных атомных групп в объемно-упругие свойства раствора; 4) исследовать растворы белков с целью выявления связи акустических и объемно--упругих свойств раствора с состоянием белка.
Научная новизна: I) создан резонаторний ультразвуковой ве-лосиметр с уникальным сочетанием точности измерения скорости ультразвука (10~уо), малого объема измеряемого образца жидкости (менее I см3) и высокого временного разрешения регистрации быстрых изменений скорости ультразвука (1(Г3 с); 2) впервые с высокой точностью измерены сжимаемости и плотности разбавленных растворов более 20 аминокислот и органических кислот в широком интервале температур (15*70С) и количественно проанализированы вклады важнейших атомных групп белков в сжимаемость раствора; 3) впервые выявлены эмпирические закономерности, связывающие сжимаемость раствора со структурой белка (глобула,"расплавленная" компактная глобула, развернутая полипептидная цепь, фибрилла) и с химической природой атомных групп (неполярные, полярные, заряженные); 4) количественно проанализированы доли гидратационного вклада и вклада собственной сжимаемости белка в измеряемые объемно-упругие характеристики раствора; 5) показано наличие состояния компактной "расплавленной" глобулы у денатурированных химотрипсиногена и миогло-бина.
Научно-практическая ценность: I) сконструированный прибор может быть полезен в биохимических и физико-химических лабораториях для рутинного анализа: определение концентраций практически любых веществ по скорости ультразвука, исследование кинетики химических процессов и др.; 2) изготовление электронной части прибора доступно лабораториям, не имеющим специальной подготовки, т.к. в ней использованы, главным образом, стандартные промышлен-
8 ные электронные узлы; 3) результаты проведенного систематического исследования растворов могут служить основой для широкого применения измерений скорости ультразвука в физико-химических исследованиях растворов органических соединений, биополимеров, клеточных суспензий и биологических тканей; 4) полученные экспериментальные результаты по скорости ультразвука,сжимаемости и плотности растворов аминокислот могут войти в соответствующие справочные таблицы.
Структура диссертации. Разбивка материала на главы произведена в соответствии с решаемыми задачами: анализ физических основ, разработка и конструирование техники измерений, исследование низкомолекулярных соединений, исследование белков. В первой главе, посвященной физическим основам, обсуждаются главным образом литературные данные. Собственный вклад автора заключается в критическом анализе и в формулировке авторской позиции. Каждая из последующих, экспериментальных глав имеет свой обзор литературы, выделенный в отдельный, первый параграф, и свои разделы с описанием экспериментальных результатов. Такая структура - без выделения обзора литературы в отдельную главу - представляется целесообразной по той причине, что решаемые в каждой главе задачи достаточно автономны, и круг вопросов, подлежащих обсуждению по литературным данным, четко очерчен в соответствии с задачей главы.
В конце каждой главы помещены сначала все таблицы, затем все рисунки, относящиеся к данной главе.
В конце диссертации, после списка литературы помещено Приложение, в котором приведен список принятых обозначений и аббревиатур и таблица справочных физических величин, используемых в работе.
Температурная зависимость объема и сжимаемости воды. Модель Холла
По современным, так называемым, континуальным представлениям жидкая вода представляет собой сплошную сеть водородных связей с широким сплошным спектром распределения связей по углам и длинам и соответственно по энергиям (см.обзоры /10,12/). Широкое распределение по углам возможно благодаря уникальной гибкости валентных связей молекулы воды /12/. В результате сеть водородных связей жидкости представляет собой сильно флуктуирующую по плотности среду с нарушенным дальним порядком.
Континуальная модель согласуется с существующими экспериментальными структурными данными (рентгеновское и нейтронное рассеяние), со спектроскопическими и термодинамическими данными /10,153, 160,188/. Однако математический аппарат для описания термодинамических свойств на основе континуальной модели не развит.
В описании поведения термодинамических свойств жидкой воды большие успехи продемонстрировали дискретные или "смешанные" модели - термин, обозначающий, что в этих моделях вода рассматривается как равновесная смесь молекул разных сортов, в простейшем случае двух сортов. Модель двух состояний была впервые предложена Холлом для описания акустических свойств воды (см.монографию /21/), а затем распространена и на другие термодинамические свойства (см.,например, /37/).
В качестве предполагаемых состояний предлагались те или иные конкретные структуры. У Бернала и Фаулера это квазикристаллические состояния типа тридимита и типа кварца и третье состояние - расплавленное (без водородных связей). У Холла это ажурное льдопо-добное состояние и плотноупакованное состояние (без водородных связей). У Самойлова это ажурная структура льда I с пустотами, часть которых заполнена молекулами воды с разорванными водородными связями. У Немети и Шерраги это смесь из молекул пяти сортов, различающихся числом водородных связей. (См.монографии /12,21,41/.)
Ни одно из этих конкретных структурных представлений не согласуется с прямыми структурными данными (рентгеновское и нейтронное рассеяние) /153,160/. Во всех моделях предполагается большее или меньшее, но существенное количество разорванных водородных связей, что противоречит данным колебательной спектроскопии /10,188/.
Однако успехи смешанных моделей не случайны и отражают существенную особенность воды - лабильное равновесие между различными конфигурациями сети водородных связей. Модель двух состояний не противоречит континуальной концепции, если рассматривать два состояния как эффективное описание двух полюсов сплошного распределения молекул (или водородных связей) по состояниям. Такое эффективное описание тем более оправдано, что распределение водородных связей по состояниям на самом деле имеет бимодальный характер - это проявляется, например, в форме колебательных спектров воды /188/.
Релаксационный вклад в сжимаемость вода составляет больше половины полной ее сжимаемости /85,95/. Поэтому р вносит определяющий вклад в особенности поведения температурной зависимости сжимаемости. Равновесие между состояниями существенно также и для температурной зависимости объема. Если ввести предположение, что ( 1=/ т0 температурные зависимости V ,( . и их второй про х Это упрощение не обязательно, оно лишь делает более наглядным существенность именно релаксационного члена уравнения (I.I6) изводной по температуре имеют вид, представленный сплошными линиями на рис.1.4 и 1.5 (на рисунках показан лишь качественный ход температурной зависимости после приближенной подгонки параметров модели под эксперимент - здесь преследуется задача продемонстрировать только качественные особенности уравнений Холла).
При различных воздействиях на состояние воды (например, при растворении какого-либо вещества) могут происходить те или иные смещения равновесия состояний, и это будет приводить к характерным изменениям температурных зависимостей. Возможны, например, следующие случаи. 1. Равновесие сдвигается глубоко в сторону одного из двух состояний или возникает некое третье термодинамически стабильное состояние. Релаксационный вклад становится пренебрежимо малым. В результате сжимаемость упадет, а температурные зависимости объема и сжимаемости станут линейными, как у нормальных жидкостей (см. линии 2 на рис.1.4 и 1.5). Такая ситуация возможна, например, вблизи ионов благодаря их сильному электрострикционному действию на воду. 2. Равновесие частично сдвигается в сторону высокотемпературного состояния. Тогда сжимаемость упадет и уменьшится кривизна температурных зависимостей объема и сжимаемости.
Выбор метода измерения скорости и поглощения ультразвука. Краткий обзор литературы
Наиболее существенной особенностью описанных ниже акустических резонаторных ячеек является жесткое крепление пьезопреобразо-вателей, что обеспечивает необходимую стабильность расстояния между преобразователями. При этом технология изготовления обеспечивает высокую степень их параллельности и высокую добротность резонатора55.
На рис.2.2 показана конструкция акустических резонаторов с к Идея жесткого крепления принадлежит А.П.Сарвазяну. минимальными объемами рабочей камеры 0,15 и 0,75см . Два пьезо-преобразователя (7,8) прижаты к параллельным плоскостям при помощи пружин (4) и прижимных шайб (5). Силиконовая прокладка (6) служит для герметизации рабочей камеры (12). Жидкость из термостата подается в термостатирующую рубашку (II) через штуцера (10). В ячейке объемом0,75 см3 предусмотрена возможность использовать магнитную мешалку (12).
Необходимая параллельность опорных плоскостей, к которым прижаты приемный и излучающий пьезокристаллы, обеспечивается следующей технологией изготовления ячеек. Торцы отфрезерованной заготовки ячейки шлифуются на плоскошлифовальном станке, далее путем притирки на шлифовальном столике параллельность плоскостей доводится до I класса точности - 0,25 мкм на базе в 25 мм. Последующая токарная обработка позволяет полученную параллельность сохранить и для опорных плоскостей, к которым прижимаются пьезокристаллы. Это достигается благодаря специальной оправке, установленной в цанговом патроне токарного станка. Ее торцевая поверхность обрабатывается резцом, затем к поверхности жестко притягивается заготовка своим шлифованным торцом, и после этого обрабатывается опорная плоскость заготовки. Та же операция повторяется на противоположной стороне заготовки. Обе операции производятся на одной и той же оправке, не снимая ее со станка между операциями: тем самым сохраняется заданная торцами заготовки параллельность3 . Контролем точности механической обработки является экспериментально наблюдаемая форма амплитудно-частотной характерис-тики собранного резонатора: добротность не хуже, чем 0,3 10 на рабочей частоте, и отсутствие сателлитов.
Выполнение ячейки в виде цельного металлического блока, в котором протекает термостатирующая жидкость, минимизирует температурные градиенты в рабочей камере. Для обеспечения химической пассивности ячейки изготовлены из инертного металла: из титана или нержавеющей стали.
Пьезопреобразователи изготовлены из монокристалла ниобата лития. Толщина 0,35 мм, диаметр 10 мм, собственная частота 10 МГц. Электрод, обращенный в исследуемую жидкость, получен напылением золота в вакууме, наружный электрод - напылением серебра. Хорошая адгезия напыленного слоя на поверхности кристалла обеспечивалась тем, что, во-первых, напыление производилось на матовую поверхность, во-вторых, сначала на подготовленную (очищенную спиртом) поверхность кристалла напылялся в качестве подло?кки тонкий (полупрозрачный) слой нихрома, имеющего хорошие адгезивные свойства, и лишь затем - слой золота или серебра .
Перед сборкой ячейки гнёзда кристаллов тщательно счищались от пыли, опорные плоскости покрывались тонким слоем вакуумной смазки (для герметизации камеры) и после этого к ним прижимались пьезокристаллы. Собранная ячейка выдерживалась при температуре 80-гЮ0С в течение часа (избыток расплавленной смазки при этой температуре легко выдавливается из-под кристалла). После этой процедуры рабочая камера ячейки промывалась органическими растворителями.
Точность измерения скорости ультразвука резонаторным методом прямо связана с добротностью резонатора. Зависимость добротности от частоты немонотонна в реальном акустическом резонаторе (рис. 2.3): на высоких частотах добротность падает в результате Все операции по изготовлению преобразователей из монокристалла и по напылению электродов производил А.И.Умнов.го возрастания коэффициента поглощения в жидкости, на низких же частотах начинают сказываться потери из-за дифракционного расхождения ультразвукового луча. В результате добротность резонатора 0,75 мл оказывается максимальной в области частот 6-9 МГц. Поскольку дисперсия скорости ультразвука в водных растворах незначительна, то выбор зоны рабочих частот должен основываться на условии максимальной добротности. Для работы в указанном диапазоне частот собственная частота преобразователей выбрана равной 10 МГц, чтобы уменьшить погрешности, возникающие при отражении волны от преобразователя (см. 2.1).
Крышки ячеек изготовлены из алюминия и одеты в теплоизоляционный кожух из эбонита. Это обеспечивает быстрое выравнивание температуры между ней и камерой после заливки образца, благодаря чему уменьшается выделение испарины на крышке и связанное с этим изменение концентрации вещества при высоких температурах.
Гомологические ряды. Взаимодействие алифатического радикала с функциональной группой. Вклад(Br, группы в сжимаемость
Автоматические пипетки фирмы "GLLson" (Франция) и Ленинградского производственного объединения. Пипетки калибровались по весу воды при комнатной температуре. Среднеквадратичный разброс был +0,5%.
Микрошприц с диспенсером фирмы "HamiUon (США). Полный объем микрошприца 25 мкл, диспенсер обеспечивает возможность дробных добавок с равным шагом: 50 шагов на весь объем шприца. Средний объем шага определен по весу воды на 30 шагов диспенсера. Во- j да для взвешивания вливалась из шприца в стакан с жидким маслом для исключения испарения. Полученный средний объем равен 0,498+ +0,002 мкл на один шаг. Воспроизводимость объема на каждый шаг проверялась по изменению скорости ультразвука при добавлении спирта из шприца в акустическую ячейку, заполненную водой. Воспроизводимость была не хуже +0,001 мкл (0,2%). 3. Шприц с микрометрической насадкой. Этот дозатор сконстру ирован из шприца типа "Рекорд" объемом 5 мл, корпус которого сое динен с корпусом микрометрической насадки. Центральный шток наса дки толкает стеклянный поршень шприца, для чего в задний конец поршня вклеен магнит, который отшлифованным торцом прилипает к штоку микровинта, обеспечивая этим стабильное положение поршня в шприце. Цена деления определена по весу воды и равна 0,608 мкл на 0,01 мм микрометрической насадки. Воспроизводимость +0,1 мкл. Степень увлажненности препаратов определялась по модифицированному методу Фишера /172/. Титрование реактивом Фишера производилось в герметичной стеклянной ячейке, заполненной метанолом в качестве реакционной среды. Конечная точка титрования определялась полярографически встроенными в ячейку платиновыми электродами. Водный эквивалент реактива Фишера определялся титрованием известного количества воды в реакционной ячейке.Исследуемый порошок взвешивался в тех же условиях атмосферной влажности, в которых приготовлялись растворы для экспериментов. Затем порошок ссыпался в реакционную ячейку, заполненную безводным метанолом, и проводилось титрование. Из-за неидеальной герметичности ячейки наблюдался медленный дрейф - увлажнение реакционной среды атмосферной влагой. Скорость этого дрейфа определялась каждый раз дополнительным тированием в течение некоторого времени после достижения точки эквивалентности. Затем производилась экстраполяция дрейфа к моменту засыпки порошка. Кроме того, во время засыпки в камеру попадало заметное количество атмосферной влаги. Для учета этой погрешности процедура засыпки была по возможности стандартизована, и отдельно было измерено увлажнение ячейки при имитации засыпки.
Еще одним источником ошибки было то, что сульфгидрильная группа цистеина взаимодействует с реактивом Фишера, расходуя дополнительно 1/2 эквивалентов HgO на каждую SH группу. Этот эффект учитывался. Влажность порошков была измерена с точностью +0,3%. Все порошки аминокислот оказались сухими в пределах указанной точности. Влажность белков была от 3 до 1%. Концентрационная зависимость скорости ультразвука и, соответственно, величины акустического инкремента измерялись двумя методиками, которые мы будем называть "методикой заливок" и "методикой добавок".
Методика заливок заключается в том, что растворы для измерения готовятся предварительно, а потом заливаются для измерения в ячейку. Всякий раз до и после измерения раствора измеряется скорость ультразвука в растворителе. Это позволяет учесть возможные дрейфы прибора. Ячейка перед каждым новым раствором тщательно промывается водой и просушивается, либо предварительно ополаскивается порцией измеряемого раствора. Результатом измерения является разность между показаниями в растворе и в растворителе.
Методика добавок заключается в следующем. Измерительная камера заполняется точно отмеренной порцией растворителя. Снимаются показания прибора. Затем в заполненную ячейку добавляется исследуемое вещество в виде концентрированного раствора (микродозатором) или в виде навесок сухого порошка и размешивается с помощью магнитной мешалки. Снимаются показания прибора.
Методика добавок имеет существенное преимущество перед методикой заливок, потому что исключается невоспроизводимость, связанная со сменой образца в ячейке. Такая невоспроизводимость бывает обусловлена, например, залипанием мельчайшего пузырька воздуха в углах акустической ячейки около пьезокристаллов. Кроме того,методика позволяет легко получать концентрационные зависимости в одной пробе без большого расхода вещества. Однако она не всегда бывает удобной. Например, некоторые гидрофобные вещества при низких температурах очень долго растворяются, плавая на поверхности, и это может приводить к погрешностям из-за испарения за время растворения. Методика заливок в этом случае предпочтительна, так как позволяет применять интенсивные методы размешивания в более герметичных условиях вне ячейки.
Опорная ячейка всегда заполнена растворителем при работе как по первой, так и по второй методике.
При высоких температурах наблюдается частичное испарение воды в течение опыта. При таких измерениях вводилась поправка путем экстраполяции дрейфа показаний к моменту заливки раствора в ячейку. Учитывалась также поправка на дополнительное испарение, вызванное открыванием крышки в момент засыпки вещества.
Температурные зависимости измерялись по точкам. При каждой новой температуре производилось измерение с помощью одной из вышеописанных методик. Попытки проводить измерения плавным сканированием температуры в ячейках, заполненных исследуемым и контрольным (опорным) растворами, не увенчались успехом, так как механические напряжения, возникающие в ячейке при изменении температуры, не позволяли получать воспроизводимой базовой линии.
Связь кажущейся сжимаемости белка с удельной поверхностью. Усредненная сжимаемость глобул
Резюме и постановка задачи. Анализ литературных данных позволяет увидеть некоторые общие различия между классами электролитов и неэлектролитов, между заряженными и незаряженными, полярными и гидрофобными молекулами. Однако этих данных недостаточно для удовлетворительного описания гидратации и сжимаемости белков по ряду причин, среди которых наиболее существенны следующие: 1) отсутствуют данные, из которых можно было бы определить кажущиеся сжимаемости ряда важных белковых атомных групп, например, боковых групп цистеина и тирозина; 2) многие данные требуют проверки, так как были получены либо при высоких концентрациях, либо условия эксперимента описаны недостаточно полно; 3) мало данных, полученных в широком интервале температур, большинство измерений проведено только при 25С; 4) при выделении вкладов групп не учитывалось взаимодействие между частями молекулы и не учитывался кинетический вклад в сжимаемость - косжимаемость; 5) интерпретация данных в терминах гидратации базировалась на не вполне корректных предположениях о сжимаемости гидратного комплекса. Отсюда следует необходимость нового систематического исследования аминокислот, их производных и аналогов, содержащих все важнейшие атомные группировки белков, с целью количественного определения вкладов этих групп в сжимаемость раствора. Исследование должно быть проведено на разбавленных растворах, и анализ данных должен проводиться в рамках более корректных представлений о сжимаемости гидратного комплекса, изложенных в 1.7. Большинство препаратов аминокислот были изготовлены фирмой "SiamcL" (США). Использовались без дополнительной очистки. Бути-рин (Ы. -аминомасляная кислота) и лизин«НС1 фирмы "Rean " (Венгрия) перед использованием перекристаллизовывались из спирта. Все аминокислоты были в t-стереоизмерной форме, кроме тирозина (d ) и лизин.HCI ( (к Д ). Соляная, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты фирмы "Реахим" квалификации "хч", использовались без дополнительной очистки. Масляная кислота Новочеркасского завода синтетических продуктов, исходная чистота 97%, использовалась после ректификации при температуре 160С при атмосферном давлении. Едкое кали фирмы "СЬетароГ (Чехословакия) с красной полосой, использовалось без дополнительной очистки. Растворы приготовлялись на дважды дистиллированной воде. В случае необходимости (при работе с высокими температурами) вода дегазировалась кипячением или выдерживанием при пониженном давлении (до 0,1 атм). Акустический инкремент аминокислот Акустический инкремент ;# аминокислот измерялся при температурах от 15 до 70С. Измерения производились по методике добавок ( 2.II). Медленно растворяющиеся аминокислоты (тирозин, триптофан, лейцин, норлейцин и изолейцин) при температурах 15 и 25С измерялись, кроме того, с помощью методики заливок (см. 2.11), для исключения возможной ошибки из-за испарения. Обе методики давали одинаковые результаты в пределах погрешности измерений. Концентрации растворов большинства аминокислот 3 мг/мл, приборная погрешность приготовления оценивается величиной не выше 1%. Концентрация раствора тирозина 0,2 мг/мл, погрешность - не выше 4,2$. Концентрация раствора триптофана 1,5 мг/мл, погрешность не выше 2%. Приборная погрешность в определении акустического инкремента большинства аминокислот оценивается в 1,3% (для тирозина 7%, для триптофана 2,5%). Для определения каждого значения проводилось не менее четырех независимых измерений. Среднеквадратичное отклонение в выборке не превышало 1,0% для большинства аминокислот. Результаты с указанием среднеквадратичного отклонения среднего значения представлены в табл.3.1. Концентрационная зависимость акустического инкремента по абсолютной величине не превышает 0,1 см3/моль на I мг/мл /144/ (за исключением триптофана). Следовательно, значения . , полученные при концентрации 3 мг/мл,отличаются от значений при бесконечном разбавлении не более чем на 0,3 см3/моль. Отличие поглощения ультразвука в растворах аминокислот от поглощения в воде не превышало погрешности измерения. Кажущийся объем аминокислот Плотность растворов для определения кажущихся объемов измерялась на денсиметре ДМА-60. Методика описана в 2.6. Концентрация растворов 3 мг/мл. Диапазон температур от 15 до 55С. Растворы приготовлялись по весу. Точность приготовления концентрации не хуже +0,. Погрешность определения кажущегося объема составляла для всех аминокислот не более +0,2% при температурах от 15 до 40С и не более +0,3% при температуре 55С. Проводилось от двух до шести независимых измерений кажущегося объема. Разброс результатов не превышал приборной погрешности.
