Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор
1. Концепция шаперон-ассистируемого сворачивания белков. 3
1.1. Белки теплового шока 6
1.2. Белки семейства hsp60 и hsplO (шаперонины). 7
2. Структура и функция олигомерных белков шаперонной системы клеток E.CoIi GroEL и GroES. 8
2.1. Структура GroEL и GroES по данным электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. 9
2.2. Связывание полипептидных цепей с нежесткой третичной структурой - одно из основных свойств GroEL. 12
2.3. Связывание и гидролиз АТФ - основа реакционного цикла GroEL. 21
2.4. Формирование тройного комплекса GroEL-GroES- полипептид. 23
3. Малоугловое диффузное рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов как метод исследования конформационной изменчивости белков в растворе. 28
3. Материалы и Методы
1. Объекты исследования и материалы. 31
2. Экспериментальное измерение малоуглового рентгеновского рассеяния белков. 31
3. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей в растворе. 33
4. Расчет кривых малоуглового рентгеновского рассеяния белков по данным рентгеноструктурного анализа. 36
5. Расчет кривых малоуглового рентгеновского рассеяния и моделирование структуры олигомерных белков в растворе. 38
4. Результаты и обсуждения
1. Структура GroES в растворе. 39
2. Структура GroEL в растворе. 41
3. Структура комплексов GroEL с АТФ и АДФ в растворе. 44
4. Комплекс GroEL с ненативным белком. 47
5. Комплекс GroEL с GroES. 48
Выводы 51
- Белки семейства hsp60 и hsplO (шаперонины).
- Связывание полипептидных цепей с нежесткой третичной структурой - одно из основных свойств GroEL.
- Экспериментальное измерение малоуглового рентгеновского рассеяния белков.
- Структура GroEL в растворе.
Введение к работе
Олигомерные белки теплового шока - 14-субьединичный "двухкольцевой" GroEL (800Ша) и 7-субъединичный "однокольцевой" GroES (70kDa) играют важную роль в процессах сворачивания и транспорта других белков в клетках E.colU связываясь с ненативными конформационными состояниями белковых цепей и участвуя в их сворачивании. Благодаря этой функции они названы молекулярными шаперонами. Способность GroEL содействовать правильному сворачиванию других белков [Todd et al., 1995, Gray et al., 1991] делает привлекательным его использование в биотехнологии для реактивации вновь синтезируемых белков [Keresztessy et al., 1996]. Однако, сложная олигомерная структура GroEL и наличие ряда лигандов, участвующих в осуществлении его функции [Goloubinoff et al,, 1989, Vitannen et al., 1990] затрудняют выяснение механизма его участия в процессе сворачивания белков. В этой ситуации может помочь исследование структурной организации GroEL в присутствии низкомолекулярных субстратов (ионов К и Mg2+, нуклеотидов АДФ и АТФ) а также при его взаимодействии с GroES и ненативным субстратом. Информацию о структуре белков в растворе можно получить несколькими методами, например ядерным магнитным резонансом (ЯМР), электронной микроскопией, а также рентгеноструктурными исследованиями. Однако эти методы не только очень трудоемки, но, к сожалению не всегда применимы. В частности методом ЯМР невозможно исследовать большие белки. Структура белка, полученная электронной микроскопией, может быть искажена из-за влияния подложки, а для рентгеноструктурных исследований не всегда удается получить кристаллы белков с лигандами. К тому же, неструктурированные субстраты не могут быть исследованы этим методом.
В данной работе мы исследовали структуру GroEL и GroES, а также их комплекса в растворе, используя метод диффузного малоуглового рентгеновского рассеяния. Этот метод позволяет получать информацию об изменении общих размеров белков в растворе (радиус инерции белка). Однако если применить компьютерное моделирование, используя известные из кристаллографии координаты атомов белка, то возможности метода существенно расширяются, и оказывается возможным получить информацию о крупномасштабных изменениях в структуре белка. При моделировании использовались координаты атомов GroEL и GroES известные из данных по рентгеноструктурному анализу этих белков в кристалле. Задача моделирования состоит в том, чтобы рассчитать кривые рассеяния, меняя некоторым образом предполагаемую модель, до получения наилучшего согласия рассчитанных от модели кривых рентгеновского рассеяния с экспериментально измеренными.
Проведенные в работе исследования позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования GroEL как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке. Показан масштаб конформационных изменений, происходящих в структуре GroEL в процессе его функционирования в растворе.
II. Литературный обзор
Белки семейства hsp60 и hsplO (шаперонины).
Термин шаперонины был предложен Элисом [Hemmingsen et al., 1988] при описании белков класса молекулярных шаперонов гомологичных по структуре белкам GroEL и GroES из Е.соїі. В настоящее время представители семейства шаперонинов найдены в прокариотах, а также в митохондриях и хлоропластах эу кар йот. Эти белки представляют собой крупные олигомерные кольцевые структуры, а их функциональная активность связана с взаимодействием с рядом лигандов. Так, например, в Е.соїі функциональная деятельность GroEL в некоторых случаях опосредована его АТФ (или АДФ)-зависимым взаимодействием с другим белком теплового шока - GroES (hsplO) [Hunt et al., 1996]. В отсутствии ненативных белковых мишеней GroES ингибирует АТФ-азную активность GroEL [Chandrasechar et al., 1986]. Митохондрии клеток млекопитающих также содержат полипептид, структурно и функционально гомологичный GroES [Lubben et al., 1990]. В хлоропластах клеток содержится другой представитель семейства шаперонинов - Рубиско связывающий белок (RBP). Этот белок функционально вовлечен в процесс сборки гетеро-олигомерных комплексов Рубиско. В отличие от GroEL (состоящего из 14-ти идентичных субъединиц с молекулярной массой бОкДа каждая), RBP состоит из двух типов субъединиц - а (61 кДа) и [3 (60 кДа), возможно организованных как и в GroEL в две кольцевые структуры по семь субъединиц каждая [Hemmingsen et al., 1988]. Митохондрии из дрожжей, кукурузы, Xenopus, Tetrahymena и клеток человека, также содержат структурно и иммунологически схожие с GroEL белки [McMullin et al., 1987; McMullin et al., 1988]. Митохондриальный гомолог из S. cerevisiae (hsp60) проявляет 54% и 43% гомологии с GroEL и а-субъединицей RBP из хлорошгастов [Reading et al., 1989]. Также как и другие hsp60, митохондриальные белки этого класса принимают участие в процессах сворачивания белков и сборки олигомерных белковых комплексов. 2. Структура и функционирование олигомерных белков шаперонной системы клеток E.coli GroEL и GroES. Шаперонная система GroEL/ES из Escherichia coli наиболее полно изучена как в структурном так и в функциональном аспекте, а механизм ее функционирования часто приводят как пример шаперон-ассистируемого сворачивания белков. Последние исследования структуры и функции GroEL подтверждают, что его роль в клетке заключается в том, чтобы обеспечить несвернутым белкам условия облегчающие их правильное сворачивание.
В частности, GroEL-ассистируемое сворачивание белков разделяют на два этапа: связывание коллапсированного частично структурированного белка и его сворачивание, которое сопровождается связыванием ко-шаперона GroES и расщеплением АТФ. Шаперонин GroEL - олигомерный белок, состоящий из 14 идентичных субьединиц (57кДа), образующих два кольца (по 7 субьединиц в каждом), лежащих друг на друге (рис.1). Закристаллизованная структура GroEL представляет собой цилиндр высотой 145А и 135А в диаметре, с центральным каналом диаметром порядка 45 A (Braig et al., 1994, 1995). Ненативныи белок, по данным электронной микроскопии, связывается в начале центрального канала [Langer et al., 1992; Braig et al,, 1993; Chen et al., 1994; Ishii et al., 1994]. В этой же области сосредоточены гидрофобные аминокислоты, замена которых на полярные, уменьшает связывание полипептидов [Braig et al., 1994; Fenton et al., 1994]. Это позволяет предположить, что основную роль в связывании GroEL с ненативными белками играют гидрофобные взаимодействия. Субъединица GroEL (547 аминокислотных, остатков) состоит из трех четко выраженных доменов (рис.1). Верхний (апикальный) домен формирует концевые части GroEL цилиндра и вовлечен в связывание белковых субстратов и GroES. В первой из двух работ по рентгеноструктурному анализу GroEL [Braig et al., 1994] координаты части атомов этого домена не были получены из-за их высокой подвижности, которая необходима (как предполагается) для обеспечения связывания широкого спектра белковых мишеней. Экваториальные домены формируют основание GroEL цилиндра, обеспечивая основные контакты между субьединицами в кольце и контакты между кольцами GroEL. 25 С- и 5 N- концевых аминокислотных остатков GroEL, входящих в состав экваториального домена, обладают высокой подвижностью и, соответственно, их координаты не решены рентгеноструктурным анализом. Однако, методом электронной микроскопии показано, что в центральном канале GroEL на уровне экваториальных доменов в обоих кольцах наблюдаются плотности, которые можно объяснить расположением этих неструктурированных концевых остатков (рисЛ). Сайт связывания АТФ расположен в верхней части экваториального домена на внутренней поверхности канала GroEL (Рис.2) и включает в себя аминокислотные остатки высоко консервативных петель (а также GDGTT последовательность консервативную для всех шаперонинов). Связывание нуклеотидов с GroEL проанализировано благодаря закристаллизованному комплексу GroEL с ATPyS, в котором GDGTT последовательность посредством связанного Mg2+ взаимодействует с кислородами всех трех фосфатов АТФ [Boisvert et al., 1996], Механизм алостерических изменений GroEL при гидролизе АТФ на структурном уровне пока не ясен. Существует два участка в экваториальных доменах каждой субъединицы, через которые возможно передаются структурные изменения от сайтов расщепления АТФ в противоположное кольцо GroEL: остатки Lysl05, А1а109, Glu434 и Glu461, Ser463, Val464 взаимодействуют с остатками расположенными на двух соседних субьединицах противоположного кольца Ala 109, Glu434 и Arg452, Ser463, Val464, соответственно. Интересно, что участок связывания фосфатов (аминокислотные остатки 87-91) является частью ос-спирали, содержащей аминокислотные остатки Lysl05 и А1а109. Электронно-микроскопические исследования GroEL в присутствии АТФ показывают в этой области уменьшение электронной плотности, что подтверждает возможность передачи "сигнала" от сайта расщепления АТФ через вышеописанные участки к субъединицам противоположного кольца [Roseman et al., 1996]. Средний домен субьединицы GroEL - самый маленький. Он образует связь наподобие шарнирного соединения между верхним и экваториальным доменами. Анализ различных конформаций GroEL методом электронной микроскопии [Roseman et al., 1996] и сравнение кристаллических структур GroEL и комплекса GroEL-GroES подтверждают, что основные изменения структуры GroEL происходят благодаря подвижности среднего и верхнего домена.
Дополнительной возможностью структурных изменений является взаимодействие между средним доменом и верхним доменом соседней субьединицы. Эти контакты, по-видимому, существенны для положительной кооперативности структурных изменений в кольце и отрицательной кооперативности между кольцами GroEL [Yifrach et aL, 1994]. Показано также, что мутации в среднем домене могут частично или полностью подавлять функции GroEL [Fenton et al., 1994]. Ко-шаперонин GroES также является олигомерным белком. Он состоит из 7 идентичных субьединиц по 10 кДа каждая [Hunt et al., 1996; Mande et al., 1996] (рис.3). В присутствии адениловых нуклеотидов (АТФ и АДФ) GroES может связываться с GroEL, что приводит к существенному изменению конформации GroEL [Chandrasekhar et al., 1986; Saibil et al., 1991; Langer et al., 1992; Schmidt et al., 1994b; Chen et al., 1994]. Анализ структуры GroES в кристалле показывает, что GroES представляет собой купол 70-8 О А в диаметре, высотой ЗОА и внутренним углублением с диаметром —30А и глубиной 20А. Структура каждой субьединицы GroES представляет собой р-бочонок с двумя петлями. Одна петля формирует "крышу" GroES купола, а другая участвует во взаимодействии с GroEL при образовании комплекса GroEL-GroES (рис.3 и 4). В свободном GroES петли, контактирующие с GroEL, подвижны и неструктурированны, это показано методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для GroES в растворе [Landry et al., 1993]. GroES связывается с GroEL таким образом, что углубление GroES оказывается продолжением центрального канала GroEL (рис.4). При этом подвижные петли (рис.3) структурируются, что проявляется в уширении их ЯМР сигналов. Эти подвижные петли не видны в кристалле GroES, за исключением одной, которая фиксируется вследствие упаковки молекул белка в кристалле [Hunt et al., 1996]. Существует предположение, что подвижные петли GroES конкурируют с белковой мишенью за одни и те же места связывания на GroEL. Это подтверждается исследованиями с помощью электронной микроскопии [Chen et al., 1994; Roseman et al., 1996]. Также показано, что мутации одних и тех же аминокислот (во внутреннем канале GroEL) в одинаковой степени влияют как на связывание полипептидной цепи, так и на связывание GroES [Fenton et ah, 1994]. 2,2. Связывание полипептидных цепей е нежесткой структурой — одно из основных свойств GroEL.
Связывание полипептидных цепей с нежесткой третичной структурой - одно из основных свойств GroEL.
Поскольку одной из особенностей промежуточных конформационных состояний белков, таких как расплавленная глобула, является повышенная экспонированность гидрофобных участков на растворитель, то, вероятно, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в распознавании GroEL белковых мишеней. Исследования структуры и функции GroEL подтверждают это предположение. Например, поверхность каждой субьединицы GroEL в начале центрального канала, сформированная двумя а-спиралями и петлей, состоит, в основном, из гидрофобных аминокислотных остатков [Braig et al., 1994]. Замена в этой области гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные или заряженные ухудшает связывание полипептидного субстрата [Fenton et al., 1994]. Координаты атомов аминокислотных остатков в этой части GroEL плохо определены (большой b-фактор) из-за их высокой подвижности в кристалле, которая вероятно необходима для лучшего сродства GroEL к различным белкам [Braig et al., 1994; Braig et al., 1995; Boisvert et al., 1996]. Большое количество различных исследований было проведено, чтобы выяснить роль гидрофобных взаимодействий при функционировании GroEL. Так Ричарм с соавторами наблюдали увеличение АТФ-азной активности GroEL в присутствии гидрофобных аминокислот. Этот эффект пропадал при добавлении GroES [Richarme et al., 1994; de Crouy-Chanel et al., 1995]. Ландри и Гираш синтезировали полипептид из 13 аминокислотных остатков, включающий в себя N-концевую часть роданазы (rhodanase), который, как показано методом ЯМР, связывается с GroEL. Интересно отметить, что этот пептид неструктурирован в растворе, но образует а-спираль при связывании с GroEL [Landry et al., 1991]. Другой более гидрофобный пептид vsv-C также формирует а-спираль при связывании с GroEL, однако в растворе этот пептид только частично спиральный [Landry et al., 1992]. Также рядом авторов были проведены исследования по определению влияния различных мутаций небольшого белка (химотрипсинового ингибитора 2) на его связывание с GroEL [Itzhaki et al., 1995]. В этих работах замедление сворачивания белка в присутствии GroEL рассматривалось как мера связывания белка с GroEL. Обнаружена общая тенденция по замедлению сворачивания белка в присутствии GroEL при заменах его гидрофобных аминокислот на аланин или глицин, но обнаруженный эффект очень мал (-10%). Чтобы оценить вклад гидрофобных взаимодействий в стабилизацию комплекса GroEL с белковой мишенью, проводились также исследования с помощью титрующего калориметра [Lin et al. 1995].
Показано, что развернутый вариант субтилизина (BPN1 PJ9) связывается с GroEL с положительным изменением энтальпии (+19.9ккал/моль, т.е. при этом изменяется, в основном, энтропия) и отрицательным изменением теплоемкости (ДСр = -0.85 ккал моль"1 град"1). При связывании а-казеина происходит похожий скачок теплоемкости, подтверждая, что в процессе связывания основную роль играют гидрофобные взаимодействия. Из скачка теплоемкости авторы [Lin et al. 1995] рассчитали, что поверхность субтилизина (BPN PJ9), взаимодействующая с GroEL, составляет около ЗА2 неполярных остатков. Интересно отметить, что гидрофобная поверхность апикального домена GroEL около 4.5A2 [Braig et al., 1995]. Из всего вышесказанного можно заключить, что по отношению к связыванию белковых мишеней GroEL обладает низкой специфичностью к определенным аминокислотным остаткам или сайтами. Для некоторых белков оказывается, что любое из промежуточных состояний обладает сродством к GroEL. Степень экспонированности гидрофобных аминокислотных остатков в белке может определять относительную стабильность комплекса GroEL - белок. В основном, для большинства белков конформации, способные связываться с GroEL, представляют собой коллапсированные, но слабо упакованные, элементы вторичной структуры. Белки в таких конформациях, в большинстве случаев, имеют больше экспонированных гидрофобных аминокислот, чем в нативном (жестком) состоянии. Одним из подходов к определению конформации полипептидных цепей, которые могут распознаваться GroEL, является исследование кинетики ренатурации (сворачивания) белков в присутствии GroEL. После разбавления из денатуранта коллапсированные структуры многих белковых субстратов способны прочно связываться с GroEL. Например, разбавленная из раствора мочевины пре-3-лактамаза связывается с GroEL, и ее сворачивание приостанавливается [Zahn et al., 1992]. Из анализа кинетики ренатурации было обнаружено наличие двух кинетических промежуточных состояний, вероятно, цис-транс пролиновых изомеров, которые взаимодействовали с GroEL. Скорости сворачивания и их рН зависимость, при высвобождении из GroEL этих интермедиатов, оказались подобны их скоростям и рН зависимостям в отсутствии GroEL, из чего было сделано заключение, что путь сворачивания белка в присутствие и отсутствии шаперонина одинаков. Эти интермедиаты имели спектр флуоресценции, подобный нативному белку и существенно отличающийся от спектра денатурированного белка. Таким образом, можно предположить, что в процессе ренатурации белка быстро формируется некая коллапсированная структура, которая и распознается GroEL. Интересно, что при сворачивании из раствора мочевины зрелая Р-лактамаза (без сигнального пептида) не связывается с GroEL, если ренатурирующий буфер не содержит мочевину в концентрации, достаточной, чтобы населить наблюдаемые промежуточные состояния [Zahn et al., 1992; Zahn et al., 1994a]. Однако при повышении температуры ( 37С) зрелая Р-лактамаза разворачивается и приобретает структуру, имеющую высокое сродство к GroEL [Zahn et al., 1994]. Спектр флуоресценции такой структуры похож на спектр пре-р-лактамазы, связанной с GroEL. Последующее более детальное изучение свойств этого интермедиата с использованием как флуоресценции триптофановых остатков так и метода водородно-дейтериевого обмена позволило обнаружить высокую структурированность промежуточного состояния, причем гораздо более высокую, чем в конформации расплавленной глобулы, реализующейся при низких значениях рН [Gervasoni et al., 1996]. Было показано также, что константа диссоциации комплекса GroEL-p-лактамаза уменьшается при увеличении температуры, что указывает, на важную роль гидрофобных взаимодействий в формировании комплекса между р-лактамазой и шаперонином [Zahn et al., 1994].
Независимым способом для анализа, какие структуры узнаются GroEL, является проверка способности предварительно сформированных метастабильных промежуточных состояний белка связываться с GroEL. Исследования а-лактальбумина показали, что относительно компактное промежуточное состояние этого белка типа расплавленная глобула не связывается с GroEL [Hayer-Hartl et al., 1994; Okazaki et al., 1994]. Однако в более поздних исследованиях было показано, что связывание а-лактальбумина в состоянии «расплавленная глобула» с GroEL происходит, но с очень низкой константой ассоциации [Katsumata et al., 1996]. В других (более развернутых) формах сс-лактальбумин довольно хорошо связывается с GroEL, а различие в распознавании зависит, в основном, от количества экспонированных гидрофобных участков в белке [Hayer-Hartl et al., 1994; Murai et al., 1995]. По-видимому, GroEL может распознавать также и интермедиаты, у которых достаточно сформирована вторичная и третичная структура. Так нативноподобный интермедиат окисленной Fab молекулы, в которой сохраняются все нативные контакты в его р-стрендах и даже сохраняется олигомерная структура, хорошо взаимодействует с GroEL [Schmidt et al., 1992; Lilie et al., 1995]. Множество работ посвящено определению конформационного состояния белкового субстрата в комплексе белок-GroEL. В ранних работах было показано, что белок в комплексе с GroEL подвержен расщеплению протеазами, что указывает на отсутствие его жесткой структуры [Martin et al., 1991; Mendoza et al., 1992a]. Из исследований по флуоресценции следует, что триптофановые остатки связанного белка находятся в менее полярном окружении, чем в полностью развернутом белке, но в более полярном, чем в нативном белке [Martin et al., 1991; Mendoza et al, 1992a; Hayer-Hartl et al., 1994; Weissman et al., 1994; Zahn et al., 1994]. Связывание гидрофобного зонда ANS с комплексом полипептид-GroEL также подтверждает наличие экспонированных гидрофобных участков в белковых мишенях [Martin et al., 1991; Mendoza et al., 1992a; Hayer-Hartl et al., 1994].
Экспериментальное измерение малоуглового рентгеновского рассеяния белков.
Измерение экспериментальных кривых малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР) исследуемых растворов производили на рентгеновской установке объединенного центра ядерных исследований г.Дубна (Россия) и на синхротроне г.Цукуба (Япония) [Amemiya et al. 1983]. Расстояние от источника рассеяния (кюветы) до линейного детектора составляло 2.3м, Аргоновый линейный детектор позволял измерять рассеяние рентгеновских лучей в диапазоне значений вектора рассеяния (S=47tsin9/L, где L -длинна волны и 29 -угол рассеяния) от 0.002 до 0.15 А"1. Длина волны рентгеновского излучения составляла 1.5 А. Время накопления составляло 300s (5 60s), Данные обрабатывались пакетом программ SAXSTIM [Glatter et al. 1982, Semisotnov et al. 1996]. Концентрации белков в экспериментах по МРР варьировали от 3 до 15 mg/ml, чтобы контролировать концентрационную зависимость. Интенсивности рассеяния нормировались с учетом концентрации белка и условий эксперимента, а интенсивность рассеяния комплекса GroEL-GroES, кроме нормировки, пересчитывалась согласно следующим формулам: II ILS-CI - № ; (1) CKVL+V6)2/((VL+VS)2-VS2 ); (2) C2=VS2/((VL+VS)2-VS2) ; (3) где: II - интенсивность рассеяния GroEL в конформации близкой к конформации, которую он принимает в комплексе с GroES; ILs - интенсивность рассеяния комплекса GroEL-GroES; 13 - интенсивность рассеяния GroES; VL -объем GroEL; Vs- объем GroES. Такие вычисления позволяют исключить рассеяние GroES из кривой рассеяния комплекса и следить только за изменениями конформации GroEL в комплексе. Экспериментальное значение радиуса инерции (Rg) для GroEL рассчитывали из графика Гинье с помощью программы GNOM [Svergun et al. 1991] и оно составило 67,0 ± 0.5А. Значение Rg для комплекса GroEL-АТФ было оценено как 67.0А. Как в случае свободного GroEL, так и в случае его комплекса с АТФ не наблюдалось зависимости значения Rg от концентрации белка. В тоже время значение Rg, рассчитанное для GroEL в кристалле равно 63 А (и 62.8 A, [Thiyagarajan et al. 1996, Stegman et al. 1998]). Такое отличие может быть объяснено более компактной структурой белка в кристалле. Действительно, удельный парциальный объем, рассчитанный для мономера GroEL методом кубиков [Pavlov et al. 1983], равен 0.707 cm3/g, а рассчитанный по аминокислотному составу [Zamyatnin et al. 1984] - 0.744 cm3/g.
Последнее значение близко к экспериментальному значению удельного парциального объема для глобулярных белков 0.740 cm3/g [Durchschlag et al. 1983]. Заниженное на 5% значение удельного парциального объема для GroEL в кристалле, свидетельствует о его дополнительной по сравнению с раствором компактизации в кристалле. Чтобы избежать неопределенности в компактности белка в кристалле и растворе, мы сравнивали рассчитанные и экспериментальные кривые в координатах S-Rg, в которых кривые рассеяния не зависят от размеров рассеивающей частицы, а зависят только от ее формы. 3. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей в растворе. Взаимодействие волны с веществом можно представить себе следующим образом. Волна взаимодействует со всеми ядрами и электронами, которые становятся источниками рассеяния сферических волн. Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию. Рассеянная волна в свою очередь рассеивается на всех центрах, давая совместно с первичным рассеянием второе приближение и т. д. При не очень сильном взаимодействии первичной волны с отдельными центрами, последовательные приближения сходятся к некоторой результирующей волне. Вычисления этих приближений очень громоздки, и поэтому, как правило, стараются ограничиться первым приближением, что допустимо, если взаимодействие волны с веществом достаточно мало. Волна V/(r), рассеянная полем ср(г), дается решением волнового уравнения [A+k02+vy(r)] V(r) = 0, (4) где ка=\ко\ волновое число, Д - оператор Лапласа, v - параметр, характеризующий силу взаимодействия первичной волны с веществом. Решение этого уравнения ищут в виде степенного ряда по w Свободный член этого ряда - падающая волна, а первый член - соответственно первое приближение к рассеянной волне. В случае, когда можно ограничиться первым приближением, а также если принять, что расстояние от рассеивающей частицы до точки наблюдения много больше линейных размеров объекта, то выражение для волны рассеяния можно представить следующим образом: y0(r) + (г) = А exp(/V) + ASXP/fV) /( ) (5) где: s=k-ko -вектор рассеяния (s=4ir зіп(0)/Я, 2@-угол рассеяния, -длинна волны); Ао - амплитуда падающей волны; f{s) = —f (r )exp(wr ]Jr является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле р(г)- Решение обратной задачи, т.е. нахождение рассеивающего поля го (г) по известной амплитуде рассеянной волны, является весьма сложной задачей. Экспериментально определяют поток рассеянной энергии или поток частиц, пропорциональный квадрату амплитуды рассеяния: !i = Lj/(.y)j2 = _й-.ф), где: fi-телесный угол, а функция I(s) - зависимость интенсивности рассеяния от угла рассеяния. В 1915г. Дебай вывел формулу для усредненной интенсивности рассеяния системы из N идентичных атомов (молекул, ячеек, частиц) с амплитудой рассеяния (формфактором) каждого д п SIT! Sf -- атомаj)(s), если известны их координаты r;: ) = ХХ Л" iJ-, где: r,y=rrr,, а суммирование ведется по всем атомам в частице. Эта формула дает точное выражение для интенсивности малоуглового рассеяния частицей, но решение с ее помощью обратной задачи невозможно. Формулу Дебая используют для расчета интенсивности рассеяния модельными телами. При этом, как правило, задается не атомная, а более грубая модель. Например, молекула может моделироваться совокупностью шаров или параллелепипедов. Сферическое усреднение интенсивности рассеяния, возникающее из-за хаотической ориентации частиц в растворе, приводит к значительной потере информации, содержащейся в дифракционных данных. Поэтому даже в том случае, когда все частицы идентичны и эффектами интерференции можно пренебречь, из кривой изотропного рассеяния удается без привлечения априорной информации определять, как правило, лишь некоторые интегральные характеристики исследуемых частиц.
В 1939г. Гинье вывел формулу, определяющую поведение интенсивности рассеяния I(s) в области малых углов рассеяния 9: l{s) - l(o)exp(-±s2Rg2) , где Rg - радиус инерции частицы; s=4n sin9/X -вектор рассеяния а 1(0) - интенсивность рассеяния при s=0, которая характеризует общее количество рассеивающей материи. Таким образом, весьма удобным является построение экспериментальных данных по рентгеновскому рассеянию в координатах Ln(I(s)) от $ Наклон начального участка такой кривой пропорционален квадрату радиуса инерции, , In If,- In l(s) ,,. определяемого по формуле Rg =3—-—-— . (6) 4. Расчет кривых малоуглового рентгеновского рассеяния белков по данным рентгеноструктурного анализа. При изучении методом диффузного рассеяния рентгеновских лучей ряда объектов (например, биологических макромолекул) зачастую имеется априорная информация о строении рассеивающих частиц, полученная другими методами (электронная микроскопия и различные физико-химические измерения, включая рентгеноструктурный анализ). Учет этой информации позволяет искать более тонкие детали строения частиц (в частности их формы). Поэтому, одним из наиболее часто используемых приемов является построение ряда предполагаемых моделей исследуемых частиц и сравнение кривых рассеяния от этих моделей с экспериментальной кривой. Такой подход, хотя и не гарантирует единственности решения, все же позволяет в ряде случаев подобрать модель, наилучшим образом соответствующую как данным рассеяния, так и априорной информации. Задача моделирования состоит в том, чтобы рассчитать кривые рассеяния, меняя некоторым образом предполагаемую модель до получения наилучшего согласия с экспериментом. Количество моделей, которые приходится рассматривать при таком подходе, как правило, достаточно велико (исчисляется сотнями и тысячами), поэтому основной проблемой является возможность быстрого расчета интенсивности рассеяния для большого количества моделей. Таким образом, метод расчета модельных кривых рассеяния должен удовлетворять двум основным требованиям: во-первых, быстроте расчета и, во-вторых, удобству работы с моделью. Ясно, что с этой точки зрения применение точной формулы Дебая не оправдано.
Структура GroEL в растворе.
На рисунке 11 показаны кривые малоуглового рентгеновского рассеяния GroEL как экспериментально измеренная в растворе так и рассчитанная от кристаллической структуры. График построен в координатах, в которых кривая рассеяния не зависит от общих размеров макромолекулы, т.е. отражает только форму макромолекулы. Видно, что экспериментальная и рассчитанная от кристаллической структуры белка кривые рассеяния различаются в диапазоне значений S Rg от 2.5 до 6.5 (значения вектора рассеяния 0.04-0.1 А"1), что соответствует Бреговским расстояниям 12-40А, Кривые рассеяния в этом районе чувствительны к движениям больших блоков в структуре белка, например, к смещению доменов и субьединиц белка [Glatter et al., 1982]. Отличие кривой рассеяния кристаллической структуры GroEL от экспериментально измеренной кривой рассеяния блка в растворе свидетельствует о том, что форма GroEL частицы в растворе и в кристалле различна. Чтобы устранить это различие кристаллическая структура GroEL подверглась следующим модификациям. Из анализа кристаллографических данных можно сделать несколько заключений, важных для выбора модификаций в кристаллической структуре GroEL. Во-первых, верхний и средний домены GroEL в кристалле обладают повышенной подвижностью. Во-вторых, взаимодействие между субьединицами белка довольно слабое. В-третьих, 5 N- и 25 С- концевых аминокислотных остатков экваториального домена каждой субьединицы GroEL нелокализованы рентгеноструктурным анализом. Исходя из этих наблюдений, при модификации кристаллической структуры GroEL изменялась ориентация верхних и средних доменов с использованием в качестве шарнирных элементов гибкие Gly374 и Gly410 соответственно, а субъединицы белка перемещались и вращались как целое. Кроме того, нелокализованные в кристаллической структуре каждой субьединицы N- и С- концевые аминокислотные остатки моделировались двумя цилиндрами и помещались в центральном канале GroEL частицы на уровне экваториальных доменов. Такое расположение этих остатков подтверждается данными по электронной микроскопии [Xu et al., 1998] и нейтронному рассеянию [Thiyagarajan et aL, 1996, Stegman et al., 1998]. Таким образом, в кристаллической структуре GroEL изменялись следующие параметры (рис.12): 1) ориентация верхних доменов; 2) ориентация средних доменов; 3) ориентация каждой субъединицы, как целого, вокруг оси, параллельной оси центрального канала GroEL; 4) расстояние между кольцами GroEL (dH); 5) радиус GroEL колец (dR). Кроме этого, анализировалось влияние изменения ориентации экваториальных доменов на кривую рассеяния.
Нелокализованные рентгеноструктурным анализом N-и С-концевые аминокислотные остатки моделировались двумя цилиндрами диаметром 40А и толщиной 20А каждый, которые помещались в центральном канале GroEL на уровне экваториальных доменов и расстояние между которыми варьировалось. Для всех вариантов модификации кристаллической структуры GroEL были рассчитаны кривые МРР, и эти кривые сравнивались с экспериментальной кривой рассеяния, используя R-фактор (см. Материалы и методы). Таким образом, поиск модельной структуры GroEL в растворе сводился к поиску минимума R-фактора. Удивительно, но во всем пространстве выбранных параметров был обнаружен только один минимум R-фактора. Это свидетельствует о том, что выбранные изменения структуры GroEL позволяют удовлетворительно описать экспериментальные данные. Как пример, на рисунке 13 представлена зависимость R-фактора от углов поворота верхних и средних доменов. Видно, что минимум R-фактора только один и расположен в области, где верхние и средние домены GroEL повернуты на 10 и -20 соответственно. При этом, остальные параметры были изменены следующим образом: каждая субъединица повернута на 30 вокруг оси Z, радиус GroEL колец уменьшен на 2А и расстояние между центрами масс колец увеличено на 4А. Кроме этого, расстояние между цилиндрами, моделирующими неразрешенные кристаллографией N- и С-концевые остатки, составило 30 А. Кривая рассеяния, рассчитанная от модифицированной кристаллической структуры, с описанными выше изменениями (модельная структура GroEL в растворе), хорошо согласуется с экспериментально измеренной в растворе, в отличие от кривой рассеяния, рассчитанной от немодифицированной кристаллической структуры GroEL (рис. 11). На рисунке 14 представлены атомные модели структуры GroEL в кристалле и ее модифицированного варианта, описывающего предполагаемую структуру GroEL в растворе. Видно, что неразрешенные рентгеноструктурным анализом N- и С- концевые аминокислотные остатки даже при их достаточно плотной (как в состоянии "расплавленной глобулы") упаковке занимают значительную часть внутренней полости GroEL. Более того, модельная структура GroEL в растворе характеризуется приблизительно в два раза меньшим отверстием в верхней части цилиндра GroEL. Эти данные плохо согласуются с представлениями о сворачивании белковой мишени во внутренней полости GroEL [Fenton et al., 1997] и наводят на мысль, что механизм GroEL-ассистируемого сворачивания белков может быть отличным от предполагаемого в настоящее время. Возможно также, что условия кристаллизации белка приводят к изменению положения лабильных элементов в структуре GroEL (доменов и субъединиц) или фиксация макромолекул в кристалле ограничивает масштаб возможных движений больших структурных блоков, что может приводить к искажению реальной структуры белка в растворе. 3. Структура комплексов GroEL с АТФ и АДФ в растворе. Адениловые нуклеотиды, такие как АТФ и АДФ, в основном, уменьшают взаимодействие шаперонина GroEL с ненативными белками [Ellis et al., 1996; Xu et al., 1998; Goloubinoff et al., 1989]. Причиной такого эффекта могут быть конформационные изменения в структуре GroEL, возникающие вследствие связывания нуклеотидов с шапероном [Boisvert et al, 1996; Surin et al., 1997; Ranson et al., 2001]. Чтобы выяснить существуют ли широкомасштабные конформационные изменения структуры GroEL в растворе при взаимодействии с нуклеотидами, были измерены кривые малоуглового рентгеновского рассеяния комплексов GroEL с АТФ и АДФ. Эти кривые сравнивались с кривой рассеяния свободного GroEL в растворе. На рисунке 15 представлены разностные кривые рассеяния комплекса GroEL с нуклеотидами и свободного GroEL. Видно, что взаимодействие с АДФ не приводит к существенным изменениям в структуре GroEL, которые повлияли бы на кривую рассеяния белка. Напротив, взаимодействие с АТФ изменяет кривую рассеяния и она отличается от кривой свободного GroEL в области значений вектора рассеяния от 0.03 А" до 0.1 А"1. Несмотря на то, что это отличие небольшое оно измеряется с высокой достоверностью, поскольку после 12 часов инкубации АТФ расщепляется до АДФ вследствие АТФ-азной активности GroEL [Ellis et al., 1996] и различие между кривыми рассеяния исчезает (рис. 15). Влияние гидролиза АТФ на структуру GroEL и GroEL-ассистируемое сворачивание белка пока неясно.
Существует много данных, из которых следует, что АТФ и АДФ по-разному влияют на конформацию GroEL и на связывание белковой мишени с GroEL [Surin et al., 1997; Cliff et al., 1999; Makio et al., 2001; Inobe et al., 2001; Ranson et al., 2001]. Самые популярные модели GroEL-зависимого сворачивания [Xu et al., 1998; Shtilerman et al., 1999; Ranson et al., 2001] предполагают, что АТФ и АДФ связываются кооперативно в разных кольцах GroEL, а между кольцами существует антикооперативность, т.е. пока в одном кольце GroEL не произойдет расщепление АТФ до АДФ, противоположное кольцо не связывает АТФ. Поэтому необходимо проанализировать симметричный и несимметричный комплексы GroEL с АТФ. Под симметричным подразумевается комплекс, в котором молекулы АТФ связаны с обоими кольцами GroEL и конформация колец GroEL при этом меняется одинаковым образом. Несимметричный комплекс подразумевает, что молекулы АТФ связаны только с одним из колец GroEL, в то время как другое либо свободно, либо занято молекулами АДФ. В этом случае предполагается, что конформация кольца, связанного с АТФ, изменяется, а противоположное кольцо остается практически без изменений. При моделировании структуры комплекса GroEL с АТФ изменялись те же параметры, что и при моделировании свободного GroEL в растворе (рис.12). На рисунке 16 (А и Б) представлены зависимости R-фактора от поворотов верхних и средних доменов для симметричной и несимметричной моделей комплекса GroEL с АТФ, Видно, что в обоих случаях существует только один минимум R-фактора, соответствующий оптимальной ориентации верхних и средних доменов. Следующие изменения в кристаллической структуре GroEL позволяют получить хорошее согласие между рассчитанной от модели и экспериментальной кривыми рентгеновского рассеяния.
