Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИНТЕРПРЕТАЦИЙ КРИВЫХ ДИФФУЗНОГО РЕНТГЕНОВСКОГО И НЕЙРОННОГО РАССЕЯНИЯ ШОПОЛЙМЕРОВ В РАСТВОРЕ 13
1.1. Методы решения "обратной задачи" диффузного, рентгеновского и нейтронного рассеяния ... 14
1.1.1. "Метод сферических гармоник" Щтурманна 15
1.1.2. Анализ разрешимости обратной задачи. . 16
1.1.3. Решение "обратной задачи" в работах Щтурманна 18
1.1.4. Метод Свергуна, Фейгина и Щедрина . . 23
1.2. Методы структурной интерпретации кривых
рассеяния, основанные на решении "прямой
задачи" большеуглового диффузного рассеяния . 27
1.2.1. Вывод основных соотношений для учета влияния растворителя 28
1.2.2. "Метод Лэнгриджа" и "метод шаров". . . 31
1.2.3. "Метод кубиков" 33
1.2.4. Метод Штурманна. 36
ЧАСТЬ П. КРУПНОМАСШТАБНЫЕ КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ В ФЕРМЕНТАХ 38
.І. Гексокиназа из дрожжей 39
2. Конформационные перестройки в фосфоглицераткиназе 42
З. Алкогольдепщрогеназа из печени лошади . . . 48
4. Цитратсинтаза 50
ГЛАВА I. НОВЫЙ МЕТОД КУБИКОВ 53
1.1. Алгоритм метода 56
1.2. Расчет кривых рассеяния 60
1.3. Сравнение кривых рассеяния, рассчитанных "новым" и "модифицированным" методами
кубиков 61
1.4. Объем, молекулярная и доступная
поверхности биополимеров 67
1.5. Выводы .73
ГЛАВА II. ВЛИЯНИЕ СВЯЗАННЫХ МОЛЕКУЛ ВОДЫ И ПОВОРОТНОЙ ИЗОМЕРИЗАЦИИ БОКОВЫХ ГРУПП НА КРИВЫЕ РАССЕЯНИЯ ГЛОБУЛЯРНЫХ ЕЕЖОВ В РАСТВОРЕ 75
.І. Влияние фиксированных молекул воды на кривые рассеяния белков в растворе 76
2. Оценка влияния поворотной изомеризации боковых групп на кривые рассеяния белков . . 85
2.І. Расчет статистических весов различных конформаций молекулы белка, отличающихся поворотными изомерами боковых цепей 86
2.2. Анализ конформаций боковых поверхностных групп ряда глобулярных белков 90
2.3. Усреднение интенсивности рассеяния . . 94
2.4. Усредненные кривые рассеяния глобулярных белков. Обсуждение результатов. . 96
З.Выводы 106
ГЛАВА III. ОПРЕІДЕЛЕНИЕ ВЗАИМНОГО ПОЛОЖЕНИЯ ДОМЕНОВ БЕЖОВ В РАСТВОРЕ ПО ДАННЫМ РЕНТГЕНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ . . 108
І. Метод определения взаимного положения доменов 109
2. Определение взаимного положения доменов в апо и холо-формах фосфоглицераткиназы в растворе . . ИЗ Ш.2.І. Взаимное положение доменов в апо-форме фосфоглицераткиназы в растворе 117
2.2. Взаимное положение доменов в холо-форме фосфоглицераткиназы в растворе . . 120
З. Чувствительность кривых рассеяния белков к смещениям доменов типа "охлопывания" и
"скольжения" 124
4. Взаимное положение доменов в апо- и холо-формах
алкогольдегидрогеназы из печени лошади .... 127 Ш.4.І. Расчет кривых рассеяния субъединичных
белков 132
4.2. Экспериментальные кривые апо~ и холо-
форм алкогольдегидрогеназы лошади . . . 134 Ш.4.3. Возможность конформационных перестроек типа "охлопывания" доменов при переходе алкогольдегидрогеназы из кристалла в
раствор 141
5. Заключение 145
6. Выводы 147
ГЛАВА ІV. СТРОГИЙ РАСЧЕТ КРИВЫХ Б0ЛЫ11ЕУГЛ0В0Г0 ДИФФУЗНОГО
РАССЕЯНИЯ А- и В-ФОРМ ДНК В РАСТВОРЕ 149
І. Метод расчета кривых рассеяния сильно вытянутых частиц 151
.2. Расчет кривых рассеяния и геометрических характеристик ДНК "новым методом кубиков" З. Зависимость кривых рассеяния от длины ДНК и от связанных с ДНК молекул воды 161
ІУ.4. Сравнение экспериментальных и теоретических
кривых рассеяния ДНК 165
5. Выводы 170
ГЛАВА V. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НЕЙТРОННОГО РАССЕЯШШ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУР БИОПОЛИМЕРОВ В РАСТВОРЕ 172
1. Учет дейтерообмена при расчете кривых нейтронного рассеяния биополимерами в
растворе 175
2. Сравнение кривых большеуглового нейтронного и рентгеновского рассеяния глобулярных
белков в растворе 180
З. Сравнение кривых большеуглового нейтронного
и рентгеновского рассеяния ДНК в растворе . . 194
4. Выводы 197
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 202
ЛИТЕРАТУРА 207
- Методы решения "обратной задачи" диффузного, рентгеновского и нейтронного рассеяния
- Гексокиназа из дрожжей
- Алгоритм метода
- Влияние фиксированных молекул воды на кривые рассеяния белков в растворе
- Метод определения взаимного положения доменов
Введение к работе
Одним из основных направлений исследований в молекулярной биологии является установление пространственных структур биологически важных макромолекул, таких как белки, гормоны, нуклеиновые кислоты. Именно пространственная структура определяет взаимное расположение функциональных групп в молекулах белков, важное для формирования центров связывания субстратов и каталитических центров. Конформации, которые может принимать молекула ДНК, также могут быть связаны с ее биологическими функциями /I/.
Большой вклад в определение пространственных структур биологических макромолекул внес рентгеноструктурный анализ. Этот метод позволяет установить структуру макромолекулы в кристалле на уровне координат атомов и дает таким образом исчерпывающее описание ее строения. Особый интерес представляет сравнение конформации молекулы белка в различных лигандных состояниях. Это сравнение позволяет приписать функциональный смысл изменению пространственной структуры белка при связывании им лигандов и, таким образом,дает ответ на фундаментальный вопрос о связи структуры белка с его функцией.
К сожалению, в кристалле присутствие прочно связывающихся с белком ионов и сильные межмолекулярные взаимодействия часто искажают масштаб и характер конформационных перестроек белков, вызванных связыванием лигандов /2/. Эти взаимодействия могут также явиться причиной различий пространственной структуры биополимеров в кристалле и в растворе. Поэтому необходим метод, позволяющий изучать структуру биологических макромолекул непосредственно в растворе.
Таким методом является метод большеуглового диффузного рентгеновского рассеяния, позволяющий получать информацию о распреде- лении рассеивающей плотности внутри макромолекулы. Этот метод был развит в нашей лаборатории и применялся для определения структурных перестроек в белках при их переходе из кристалла в раствор /3, 4/. В том случае, когда структура белка в кристалле известна на уровне координат атомов, метод болыпеуглового диффузного рассеяния дает возможность прямой структурной интерпретации экспериментальных кривых рассеяния /3, 4/. Это осуществляется путем перебора большого количества различных модификаций кристаллической структуры белка с целью выбора такой модификации, теоретическая кривая рассеяния для которой наилучшим образом согласуется с экспериментальными данными. Наличие такого согласия служит основанием для отождествления структуры белка в растворе со структурой этой наиболее "удачной" модификации.
Очевидно, что надежность структурной интерпретации обычно небольших различий между экспериментальными и теоретическими кривыми рассеяния биополимеров существенным образом зависит от точности расчета теоретических кривых. Однако даже наиболее совершенный из предложенных ранее методов расчета кривых рассения /5-9/ - "модифицированный метод кубиков" /9/ - во многих случаях, например, в случае частиц с сильно изрезанной поверхностью, не обеспечивал необходимой точности расчетов. Это не позволяло, в частности,провести количественную оценку влияния на кривую рассеяния таких факторов как поворотная изомеризация боковых групп в глобулярных белках, связывание молекул воды или ионов на поверхности биополимеров и т.п. Ясно, что неучет этих факторов может приводить к искажению структурной интерпретации экспериментальных кривых болыпеуглового диффузного рассеяния.
Поэтому цель диссертации состояла прежде всего в разработке возможно более строгого метода расчета кривых рассеяния, при- годного для определения профилей кривых рассеяния макромолекул со сложной топографией молекулярной поверхности. Создание такого метода ("нового метода кубиков") впервые позволило: а) получить достаточно точные кривые рассеяния глобулярных белков с фиксированными на их поверхности молекулами воды и, таким образом, оценить влияние связанной воды на кривые рассеяния белков; б) оценить влияние поворотной изомеризации боковых групп на кривые рассеяния белков; в) строго рассчитать кривые рассеяния А-и В-форм ДНК; г) оценить влияние связанной воды на кривые рассеяния ДНК; д) рассчитать "молекулярные" поверхности белков, тРНК и ДНК.
С другой стороны, решение задачи точного расчета кривых рассеяния для предполагаемых структур биополимера отнюдь не решает проблему определения структуры биополимера в растворе. Хотя число стереохимически разумных и существенно различных модификаций кристаллической структуры биополимера не может быть слишком большим, поиск таких модификаций и расчет кривых рассеяния для них представляет чрезвычайно трудоемкую задачу /3, 4/. Большое значение имеет, таким образом, любое видоизменение метода "проб и ошибок", позволяющее в конкретных случаях упростить и ускорить процедуру поиска конформации, которую биополимер принимает в растворе.
Изучение доменной подвижности в двухдоменных белках является именно тем случаем, когда видоизменение метода "проб и ошибок" позволяет за разумное время осуществить практически полный перебор взаимных положений доменов в белке и определить те их положения, которые наилучшим образом согласуются с экспериментальной кривой рассеяния. Разработка метода определения вза- имного положения доменов в двухдоменных белках, основанного на "новом методе кубиков", и его применение к конкретным белкам составляет вторую основную задачу диссертационной работы. диссертация состоит из Введения, Литературного обзора и пяти глав, в которых излагаются результаты,полученные в работе.
Методы решения "обратной задачи" диффузного, рентгеновского и нейтронного рассеяния
Рентгеновское диффузное рассеяние является прямым аналогом рентгеноструктурного анализа для случая неупорядоченных частиц, в частности, для случая разбавленных растворов биополимеров. Данные рентгеновского диффузного рассеяния, так же как и данные рентгеновской кристаллографии, содержат информацию о форме и распределении электронной плотности молекул биополимеров. Основная задача теории метода диффузного рентгеновского рассеяния состоит в извлечении этой информации из экспериментальных кривых рассеяния (т.е. из зависимости интенсивности рассеяния раствором биополимеров от угла, под которым наблюдается это рассеяние).
Имеются два принципиально различных пути решения этой задачи: первый заключается в решении "обратной задачи" диффузного рассеяния, второй - в применении метода "проб и ошибок".
Первый путь предполагает возможность восстановления формы и распределения электронной плотности рассеивающей частицы исходя из экспериментальной кривой рассеяния и дополнительной информации общего характера, например: максимального размера частицы, ее симметрии и т.п.
Второй путь основан на переборе и расчете кривых рассеяния для большого количества предполагаемых структур молекулы биополимера. При этом та структура, для которой рассчитанная кривая рассеяния совпадает с экспериментальной кривой (или наиболее близка к ней), отождествляется со структурой молекулы биополимера в растворе. В нашей лаборатории был развит подход к использованию метода "проб и ошибок", основанный на расчете кривых рассеяния биополимеров в растворе, исходя из координат их атомов /3, 4/. Ясно, что в этом подходе определяющее значение имеет точность расчета теоретических кривых рассеяния, от которой, в конечном счете, зависит правильность структурной интерпретации экспериментальных данных.
Гексокиназа из дрожжей
Гексокиназа представляет собой аллостерически регулируемый фермент с молекулярным весом 5І кдт в мономерной форме /33,34/. Фермент функционирует также и в димерной форме, где его активность на порядок выше /34/, и катализирует первую реакцию гликолиза -фосфорилирование глюкозы по 6 положению за счет У -фосфата АТФ /35/.
Именно при изучении гексокиназной реакции Кошландом была выдвинута гипотеза о том, что связывание глюкозы должно индуцировать конформационные перестройки в молекуле фермента /36/. Необходимость таких перестроек вытекала из того, что киназы должны каким-то образом устранять воду из активного центра в момент переноса фосфатной группы от донора к акцептору. В противном случае легко будет идти побочная реакция - гидролитичесше отщепление этой фосфатной группы /36/. Гексокиназа была первым ферментом, структуру которого удалось расшифровать как для апо- так и для холо-формы /37, 29/. Оказалось, что мономер гексокиназы состоит из малого и большого доменов (причем в большой входит две трети аминокислотных остатков), разделенных узкой щелью /37/. Детальное сравнение конформаций фермента в апо- и холо-формах действительно продемонстрировало значительные изменения взаимного расположения его доменов после посадки глюкозы /29/. Эти изменения заключались в повороте малого домена гексокиназы на угол 12 относительно большого, что приводило к максимальным смещениям атомов на 8 8. В результате молекула глюкозы оказывается спрятанной внутри фермента, в расщелине между его доменами, и лишь ее б -гидроксильная группа остается доступной для атакующего у -фосфата АТФ /29/. Таким образом можно считать, что в случае гексокиназы гипотеза Кошланда полностью подтверждается.
Ценность полученного результата несколько снижает тот факт, что координаты атомов апо-формы гексокиназы были получены для В-изозима фермента,а координаты комплекса с глюкозой - для А-изо-зима /29/.
Интересно, что вымачивание кристаллов В-изозима в низких концентрациях глюкозы также приводит к небольшим перестройкам структуры фермента /38/. Происходящие при этом изменения конформации очень похожи на те, что наблюдаются при переходе от структуры апо-формы (В-изозима) гексокиназы к холо-форме (А-изозима), но гораздо меньше по амплитуде. Авторы /2/ считают, что причина подобного неполного проявления конформационных изменений кроется в наличии сил кристаллической решетки. При повышении концентрации глюкозы, эти силы уже не могут более удерживать гексокиназу от перехода в "холо-конформацию", несовместимую с данной кристаллической упаковкой, что и приводит к наблюдаемому разрушению крис - 41 таллов В-изозима при больших концентрациях глюкозы /29/. Поэтому изучение конформационных перестроек в ферментах при связывании ими субстратов, проводящееся путем вымачивания кристаллов апо-формы в растворах этих субстратов может давать совершенно иной масштаб и даже характер конформационных изменений, чем это имеет место в действительности. Более надежный (но трудноосуществимый) путь состоит, по мнению авторов работы /2/, в независимом выращивании кристаллов как апо- так и холо-форм фермента.
Влияние фиксированных молекул воды на кривые рассеяния белков в растворе
Как уже отмечалось во Введении, применение метода "проб и ошибок" для интерпретации различий между экспериментальными и теоретическими кривыми диффузного рентгеновского рассеяния в структурных терминах требует использования строгих методов расчета теоретических кривых рассеяния. Определение профилей кривых рассеяния биополимеров, находящихся в растворителе с ненулевой средней электронной плотностью, основано на формуле :
представляет собой амплитуду рассеяния от объема V , занимаемого макромолекулой в растворе ("исключенного" или "архимедова" объема макромолекулы). Значок ) означает усреднение по всем возможным ориентациям макромолекулы. Если "исключенный" объем каким-то образом описан, то расчет амплитуды рассеяния (49) не представляет принципиальных трудностей /II/. На самом деле, основную проблему представляет определение этого "исключенного" объема, исходя из известных координат атомов биополимера.
Строгий метод расчета, обеспечивающий необходимую точность определения профиля кривой рассеяния макромолекулы в среде с ненулевой средней электронной плотностью, может быть разработан лишь путем дальнейшего совершенствования"метода кубиков" (см.Литературный обзор, раздел 1.2.3). Действительно, только кубики обеспечивают плотную упаковку и, следовательно, однородную плотность внутри заполняемого ими объема. Очевидно также, что значительное увеличение точности расчетов по формуле (48) (по сравнению с предыдущими вариантами "метода кубиков" /8, 9/) может быть достигнуто только за счет максимально строгого и детального описания поверхности "исключенного объема" макромолекулы. Для этого необходимо, во-первых, существенно уменьшить ребро кубика, и,во-вторых, учесть, что атомы макромолекулы имеют различные ван-дер-Ваальсовые радиусы - ни то, ни другое нельзя было осуществить, оставаясь в рамках алгоритма наиболее строгого в то время "модифицированного метода кубиков" /9/.
Описываемый ниже новый метод расчета, оставаясь методом кубиков, в значительной степени основан на идеях Ли и Ричардса /66/ и Ричардса /67/. Эти авторы предложили алгоритм для вычисления доступной поверхности макромолекулы посредством "прокатывания" шарика, имитирующего молекулу воды, по поверхности частицы. Согласно Ли и Ричардсу доступную поверхность частицы составляет совокупность точек, в которых могут находиться центры молекул воды в условиях плотного контакта этих молекул с ван-дер-Ваальсо-вой поверхностью частицы (см. рис. I). Поверхность, по которой "катятся" шары, имеющие центр на доступной поверхности, называют, вслед за Ричардсом, молекулярной поверхностью. Объем, ограниченный молекулярной поверхностью, есть искомый молекулярный объем, не доступный для растворителя.
Метод определения взаимного положения доменов
Наличие значительного количества связанных с поверхностью белка молекул воды было продемонстрировано рентгеновской кристаллографией для многих белков /70, 89-91/. Расположение этих молекул таково, что они часто образуют мостики между полярными группами и прочно связываются в мелких расщелинах на поверхности белка, образуя кластеры небольших размеров /91/. Считается даже, что молекулы воды, связываясь в карманах на поверхности белка, образованных полярными боковыми группами, могут стабилизировать конформации последних /91/.
Для того, чтобы оценить влияние фиксированной на поверхности белка воды, для ряда белков "новым методом кубиков" /65/ были рассчитаны кривые рассеяния с учетом и без учета этой связанной воды. Сравнение этих кривых, рассчитанных по координатам атомов рибонуклеазы /92/, лизоцима куриного яйца /71/ и парваль-бумина карпа В /70/, представлено на рисунках 8, 9 и 10, соответственно. Как видно из рисунков 8 и 9, для первых двух белков учет связанной воды не приводит к заметным (более Ъ%) изменениям кривых рассеяния. Однако для парвальбумина карпа В (см. рис.10) кривая, рассчитанная с учетом 138 молекул воды, которые являются фиксированными в кристаллах этого небольшого белка /70/,значительно отличается от кривой, рассчитанной без учета этих молекул.
Самое простое и вероятное объяснение различной степени влияния связанной воды на кривые рассеяния представленных здесь белков состоит в том, что отношение q = \ /Мр (где \ - суммарная масса связанной воды, а М р - масса белка) для этих белков различно. Значение этого отношения в ряду: рибонуклеаза ,ли-зоцим куриного яйца и парвальбумин карпа В составляет 0,061, 0,122 и 0,216, соответственно.
Ван-дер-Ваальсовый радиус связанной воды в этих расчетах был выбран равным 1,625 А, исходя из значения радиуса гидроксиль-ной группы (см. таблицу I или работу /69/). При таком выборе ван-дер-Ваальсова радиуса средняя электронная плотность связанной воды оказывается очень близка к средней электронной плотности водного растворителя, о чем свидетельствует близость интенсивности рассеяния на "нулевой угол" белка и комплекса белка со связанной водой (см. рис.Ю) -суммарные избыточные заряды белка и комплекса оказываются в этом случае очень близки. Однако, как показано на примере парвальбумина карпа В, влияние небольших изменений радиуса связанных молекул воды затрагивает только самую малоугловую область кривых рассеяния и не сказывается на кривых в области больших углов рассеяния (см. рис. 10). Здесь следует особо подчеркнуть, что надежные кривые рассеяния для комплексов белков со связанной водой могут быть получены только при использовании "нового метода кубиков" /65/, который позволяет достаточно точно описать чрезвычайно изрезанную молекулярную поверхность этих комплексов.
class5 СТРОГИЙ РАСЧЕТ КРИВЫХ Б0ЛЫ11ЕУГЛ0В0Г0 ДИФФУЗНОГО
РАССЕЯНИЯ А- и В-ФОРМ ДНК В РАСТВОРЕ class5
Метод расчета кривых рассеяния сильно вытянутых частиц
Диффузное рентгеновское рассеяние является одним из наиболее мощных физических методов для изучения крупномасштабных перестроек, происходящих с белками в растворе в процессе их функционирования. Для нескольких белков, например, гексокиназы /39/, фосфоглицераткиназы /52, 53/, а также для арабинозсвязывающего белка /109/ этим методом было показано, что связывание субстратов приводит к значительным конформационным перестройкам, которые проявляются в заметном уменьшении радиусов инерции этих белков. Судя по имеющимся рентгеноструктурным данным /2, 32, НО/ (см. также Введение и раздел 1.3 Литературного обзора) в указанных белках крупномасштабные конформационные перестройки сводятся скорее всего к изменению взаимного расположения доменов, которое можно описать как "охлопывание", сопровождающееся значительным, изменением расстояния между центрами инерции доменов и формы молекулы белка.
Если вывод о "охлопывании" доменов можно сделать уже на основании уменьшения радиусов инерции этих двухдоменных белков /39, 52, 109/, то информацию о деталях изменения взаимного расположения доменов в белке можно получить только из кривой рассеяния измеренной в широком диапазоне углов рассеяния. Как уже указывалось во Введении, структрная интерпретация кривых рассеяния белков в растворе в настоящее время может быть получена лишь при использовании метода "проб и ошибок", да и то для белков, конформация которых в кристаллическом состоянии известна на уровне координат атомов /3, 4/. Этот метод предполагает перебор большого количест - 109 ва различных модификаций "кристаллической" структуры белка с целью выбора такой модификации, теоретическая кривая рассеяния для которой наилучшим образом согласуется с экспериментальными данными. Важно отметить, что в методе "проб и ошибок" для определения конформации белка в растворе и в апо- и в холо-формах достаточно знать только одну исходную ("базисную") конформацию белка в кристалле.
Для случая двухдоменных белков можно предложить подход,позволяющий рассчитать теоретические кривые рассеяния для всех возможных положений доменов в молекуле белка и выбрать те положения, которые наилучшим образом согласуются с экспериментальной кривой. Таким образом, этот вариант метода "проб и ошибок" может в каком-то смысле рассматриваться как метод решения обратной задачи для двухдоменных белков. Ниже будет дано подробное изложение этого подхода, а также его применение к определению взаимного положения доменов в апо- и холо-формах фосфоглицераткиназы. Большое внимание при этом будет уделено оценке степени точности, с которой можно определить взаимное положение доменов белка в растворе исходя из его экспериментальной кривой рассеяния.
Похожие диссертации на Большеугловое диффузное рассеяние развитие теории метода и его применение к определению взаимной ориентации доменов в белках
