Содержание к диссертации
Оглавление
Список сокращений 3
Глава 1. Введение 4
Глава 2. Методы предсказания структуры G-белоксопряжённых рецепторов, оценки
качества упаковки белковых цепей и моделирования взаимодействий белокли ганд (обзор литературы) 8
2.1. Применение пространственных моделей белков на практике 8
2.II. Распространенные методы моделирования GPCR-рецепторов 12
2.11.1. Общая информация о GPCR-рецепторах 12
2.11.2. Методы моделирования ab initio 13
2.11.3. Методы моделирования на основании гомологии с родопсином
Возможные пути оптимизации моделей GPCR 19
Существующие методы оценки качества упаковки белков 20
2.IV. Моделирование белок-лигандных взаимодействий 23
2.V. Методы количественной оценки гидрофобных взаимодействий 26
2.VI. Объект исследования: рецепторы мелатонина MTj и МТ2 28
Глава 3. Результаты и обсуждение 30
3.1. Молекулярное моделирование рецепторов мелатонина MTj и МТ2 30
3.1.1. Построение «стартовых» моделей рецепторов 30
3.1.2. Анализ и оптимизация «стартовых» моделей 31
3.1.3. Выбор оптимального угла вращения а-спирали ТМЗ 35
3.1.4. Структурные различия сайтов МТХ и МТ2, модель селективности 36
3.1.5. Выводы (I) 40 З.Н. Разработка нового метода оценки качества упаковки трансмембранных
а-спиральных доменов белков 41
3.11.1. Подготовка и характеристика набора структурных данных 41
3.11.2. «Оценивающая функция для мембранных белков» 45 З.Н.З, Тестирование метода 48
3.11.4. Выводы (II) 57
ЗЛИ. Новый подход к улучшению результатов докинга 58
ЗЛИЛ. Комплементарность гидрофобных свойств в кристаллографических комплексах белок-лиганд 58
3.III.2. Применение численной оценки гидрофобного соответствия для улучшения результатов докинга 59
З.Ш.З. Выводы (III) 64
Глава 4. Заключение, выводы и перспективы 65
Глава 5. Методы и алгоритмы 68
5.1. Молекулярноемоделированиерецепторов мелатонина MTt и МТ2 68
5.II. Метод «оценивающей функции для мембранных белков» 71
5.III. Применение метода МГП-комплементарности для улучшения результатов
докинга 77
Список литературы 79
Введение к работе
Двадцать первый век часто называют «веком биологии» и предрекают, что многие проблемы, веками отягощавшие жизнь человечества (неизлечимые болезни, порог продолжительности жизни и другие), будут разрешены именно в XXI столетии. «Золотой» юбилей открытия структуры ДНК, отмечавшийся всего несколько лет назад, и практически законченные работы по секвенированию человеческого генома, равно как и геномов многих других организмов, знаменуют наступление новой, «постгеномной», эры в биологии. Интерес исследователей во многом сместился с того, как наследственная информация кодируется в молекулах ДНК, на выяснение роли и функций других макромолекул, содержащихся в клетках живых организмов, — РНК и белков. Особенно важным представляется понимание механизмов взаимодействия белковых молекул с другими макромолекулами и низкомолекулярными соединениями — в том числе, с лекарствами.
Человечество уже довольно давно использует лекарственные препараты — как естественного, так и искусственного происхождения. Новые подходы современной молекулярной биофизики привносят совершенно новые возможности в области создания новых лекарств, основываясь, как правило, на изучении молекулярных механизмов заболевания и структурных особенностей взаимодействия лекарства со своей биологической мишенью. Наличие пространственных структур белков-мишеней для терапии определенного заболевания является одним из ключевых аспектов в данной области. Однако по сравнению со многими современными молекулярно-биологическими методами, поставленными «на поток», определение пространственной структуры белков до сих пор является очень сложной и трудоёмкой задачей, не имеющей универсального решения. Эта проблема стоит особенно остро для большинства мембранных белков, в большинстве случаев слишком крупных для определения их структуры методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и находящихся в клетке в слишком малом количестве, чтобы можно было получить белковый кристалл, пригодный для исследования методом рентгеноструктур-ного анализа (РСА).
Мембранные белки (МБ) — объекты исключительной биологической и биомедицинской важности, среди функций которых можно назвать рецепцию сигналов, транспорт веществ, создание и поддержание трансмембранных (ТМ) потенциалов и др. МБ составляют не менее трети всех синтезируемых клеткой белков (Wallin & von Heijne, 1998), и без них невозможно существование ни многоклеточных, ни одноклеточных существ. Одним из важнейших классов МБ являются так называемые G-белоксопряжённые рецепторы1, составляющие 1-5% всех кодируемых белков в геномах множества организмов. Об их чрезвычайной фармакологической важности говорит тот факт, что более половины всех выпускаемых в настоящее время лекарственных препаратов действует на эти рецепторы (Klabunde & Hessler, 2002). С их дисфункцией связано большое число заболеваний (Schoneberg etal, 2004), и их терапевтический потенциал, по сути, только начинает осваиваться. К сожалению, как уже было сказано, возможности экспериментальных методов определения пространственной структуры МБ пока крайне ограничены и не могут полностью удовлетворить запросов
1 Английское название этих рецепторов (которые также называют рецепторами, чьё действие опосредовано G-белками) — G-protein coupled receptors (GPCR). Эта общепринятая аббревиатура в дальнейшем будет использоваться для их обозначения. Полный список сокращений и аббревиатур дан в начале работы. фармацевтической индустрии. На сегодняшний день только для одного белка из семейства GPCR известна пространственная структура высокого разрешения — фоторецептора родопсина, выделенного из сетчатки быка (Palczewski etal, 2000; Palczewski, 2006). В условиях отсутствия структур других GPCR молекулярное моделирование может помочь найти выход из сложившейся ситуации.
К настоящему моменту известно всего два типа укладки ТМ сегментов в МБ2: «пучки» а-спиралей и «бочонки» В-структур (Cowan & Rosenbusch, 1994). С фармакологической точки зрения наибольший интерес представляют белки первой группы, так как МБ эука-риот принадлежат исключительно к ней. Рецепторы GPCR также относятся к этому классу: их ТМ область представлена консервативным структурным мотивом, состоящим из семи ТМ а-спиралей, плотно упакованных приблизительно ортогонально плоскости мембраны (Lefkowitz, 2004; Pierce etal, 2002). Предложенная гипотеза двухстадийного сворачивания МБ в мембране (Popot & Engelman, 1990) с участием транслокационного комплекса (Hessa etal, 2005) подразумевает поочередное сворачивание в мембране индивидуальных ТМ а-спиралей (самих по себе довольно устойчивых с термодинамической точки зрения) и их последующую ассоциацию в нативный «пучок». Согласно этой гипотезе, построение теоретических моделей а-спиральных МБ может сводиться к аналогичному двухстадий-ному процессу: конструированию отдельных ТМ спиралей и их «сборке», что на первый взгляд выглядит существенным облегчением процесса предсказания их пространственной структуры. Однако методы так называемого аЪ initio моделирования (т.е., не использующие при построении моделей структур родственных белков) еще не достигли той степени зрелости, чтобы предсказывать многочисленные функциональные особенности этих объектов, даже основываясь на априорных знаниях об их топологии.
В случае если доступна трехмерная структура родственного белка, она может использоваться в качестве «шаблона» при моделировании по гомологии. Основным предположением этого подхода является то, что пространственная структура белка более консервативна, чем его последовательность (Lesk & Chothia, 1986). В случае GPCR-рецепторов единственным шаблоном является родопсин, гомология которого с другими членами семейства Может быть невелика, однако высокая консервативность пространственной организации ТМ домена все же позволяет получать модели GPCR, пригодные для практических применений, например, для изучения взаимодействия с лигандами (Archer et al, 2003). В то же время, «качественные» модели во многих случаях позволяет получить лишь интуиция ученого, учитывающего множество факторов при оптимизации моделей, полученных при непосредственном применении методов молекулярного моделирования (например, моделирования по гомологии). Очевидно, что требуются независимые способы оценки качества получаемых моделей, указывающие также возможные пути их оптимизации. Причем необходимо, чтобы эти методы были разработаны с учетом особенностей строения МБ, т.к. серьезные различия в физико-химических свойствах сред, в которых локализованы растворимые глобулярные и мембранные белки, несомненно, приводят к существенным различиям в их организации.
Отдельной, не менее сложной задачей является моделирование взаимодействия МБ
2 Недавно получена структура нового МБ — транслокатора молекул гликокаликса внешней мембраны Е. coli (Dong etal, 2006), для которого постулируется новый тип ТМ укладки: а-«бочонок». с лигандами. Фундаментальным ограничением современных алгоритмов докинга, предназначенных для этой цели, является корректный учёт конформационной подвижности белка и оценка свободной энергии связывания лиганда со своей мишенью.
Основной целью данной работы является разработка ряда новых подходов для моделирования структуры ТМ домена GPCR-рецепторов и взаимодействия с лигандами, связывающимися в ТМ области. Эти подходы призваны улучшить качество моделей, получаемых на основании гомологии, и увеличить предсказательную способность алгоритмов докинга в задачах идентификации корректных структур комплексов рецептор-лиганд.
В процессе работы был разработан новый метод оценки качества упаковки полипептидных цепей в ТМ доменах мембранных белков. Предложенный метод базируется на описании белок-мембранного окружения отдельных аминокислотных остатков в терминах классов окружения, основанных на степени экспонированности остатка в мембрану и на полярности его ближайшего белкового окружения. Анализ представительного набора кристаллографических структур МБ высокого разрешения позволил численно определить предпочтения каждого типа остатков к тому или иному классу окружения, открывая возможность оценки «качества» трехмерных структур МБ. Кроме того, предложен метод численной оценки гидрофобного/гидрофильного соответствия в сайтах связывания рецептор-лиганд, на основании которого предложена методика улучшения предсказательной силы одного из популярных алгоритмов докинга. Согласованное использование разработанных методов позволит конструировать реалистичные модели пространственной структуры МБ (в частности, GPCR-рецепторов) и изучать связывание этих белков с лигандами.
