Введение к работе
Актуальность проблемы. В физиологии почки и в клинической практике вопрос о регуляции реабсорбции натрия остается одним из наиболее актуальных и дискуссионных. В собирательных трубочках почки транспорт Na является важнейшим механизмом поддержания электролитического и водного гомеостаза и, следовательно, кровяного давления. Концентрация натрия в плазме определяет объем крови и регулируется путем изменения транспорта Na через эпителий почки. Исследование механизмов, опосредующих реабсорбцию натрия, является интенсивно развивающимся направлением современной физиологии, клеточной биологии и медицины. Ведущую роль в поддержании функциональной способности эпителиальных тканей почки и ряда других органов играют различные транспортные процессы с участием ионных каналов клеточных мембран. Согласно современным представлениям, Na пассивно входит в клетку по эпителиальным натриевым каналам (ENaC), расположенным в апикальной мембране, и удаляется из клетки при помощи Na /К -АТФазы, локализованной в базолатеральной мембране эпителиальных клеток. Нарушение регуляции транспорта Na через ENaC приводит к различным патологическим состояниям (1-4). Разработка метода локальной фиксации потенциала (пэтч-кламп), позволяющего в реальном масштабе времени наблюдать элементарные события - одиночные открывания ионных каналов в участке плазматической мембраны (5), позволила существенно продвинуться в изучении ионных каналов, и ENaC, в частности. Кроме того, в 1994 году была определена нуклеотидная последовательность ДНК, определяющая образование ENaC (6,7), что позволило использовать различные модельные объекты для исследования механизмов транспорта натрия через ENaC.
Роль малых GTP-связывающих белков (малые G-белки) в различных клеточных процессах таких, как контроль клеточного роста, реорганизация цитоскелета, пролиферация и дифференцировка, не вызывает сомнения (8). Малые G-белки также вовлечены в различные сигнальные каскады в дифференцированных клетках. Недавно было установлено, что малые G-белки играют существенную роль в регуляции активности ионных каналов. Ионные каналы являются финальными эффекторами для различных малых G-белков (9).
Однако, несмотря на интенсивные исследования, в том числе и с использованием метода пэтч-кламп, до наших работ ничего не было известно о механизмах регуляции эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками, а также о вовлечении фосфатидилинозитидов в эту регуляцию.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении функциональных свойств, структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов. Основное внимание было уделено исследованию механизмов регуляции этих каналов малыми G-белками и вовлечению фосфатидилинозитидов в данный процесс. Отдельная часть работы посвящена исследованию стехиометрии канала и сайтов связывания фосфатидилинозитидов с субъединицами канала.
В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:
Зарегистировать и охарактеризовать реконструированные в клетки млекопитающих эпителиальные натриевые каналы и нативные амилорид-чувствительные натриевые каналы в клетках собирательной трубочки почки.
Разработать новые методические подходы, использующие флуоресцентную микроскопию, с помощью которых будет возможно исследовать как формирование новых каналов в живых клетках, так и транс локацию каналов к плазматической мембраны и от нее.
Определить субъединичный состав функционального канала и смоделировать структуру ENaC на базе протон-чувствительного канала, входящего в семейство Deg/ENaC.
Идентифицировать малые G-белки, участвующие в регуляции ENaC.
Изучить сигнальные пути и механизмы регуляции ENaC малыми G-белками.
Исследовать возможную роль фосфатидилинозитидов в работе ENaC и в регуляции канала малыми G-белками.
Идентифицировать сайты связывания канала с фосфатидилинозитидами. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработанные нами новые методические подходы, включая регистрацию ENaC в нативных клетках и экспрессированного в клетки
млекопитающих, а также использование современных флуоресцентных методов микроскопии, позволяют исследовать структуру и функции ENaC в условиях приближенных к физиологическим.
Определена стехиометрия канала, показывающая, что ENaC является тримером и содержит равное количество а-, Р- и у-субъединиц. На основе протон-чувствительного канала cASICl смоделирована структура ENaC и идентифицированы потенциально важные для регуляции канала домены и сайты.
Функционирование ENaC регулируется малыми G-белками, входящими в семейства Ras, Rho и Rab. При этом малые G-белки вовлечены как в модуляцию воротных свойств канала, так и в изменение количества функционально активных каналов в плазматической мембране. Детально описаны механизмы регуляции ENaC малыми G-белками.
Показано, что фосфатидилинозитиды Р1(4,5)Р2 и Р1(3,4,5)Р3 вовлечены в регуляцию ENaC малыми G-белками. Эффект опосредован прямым связыванием указанных фосфатидилинозитидов с Р- и у-субъединицами канала. Идентифицированы сайты связывания ENaC с Р1(4,5)Р2 и Р1(3,4,5)Р3.
Научная новизна полученных результатов. Работа представляет собой первое комплексное исследование структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов, выполненное с применением современных электрофизиологических методов и микроскопии. Полученные в процессе выполнения работы результаты обладают несомненной новизной, так как исследование эпителиальных натриевых каналов в плазматической мембране клеток млекопитающих до наших работ практически не проводилось и роль малых G-белков и фосфатидилинозитидов в регуляции ENaC не была изученной.
В настоящей работе разработаны электрофизиологические и микроскопические методы регистрации реконструированного ENaC в клетках млекопитающих и в нативных клетках, позволяющие изучать структуру и функции канала. Приоритетными являются данные по определению стехиометрии канала, которые показали, что ENaC является тримером, и опровергли существующие ранее теории о тетрамерной и нонамерной
организации канала. На основе протон-чувствительного канала смоделированы вторичная и третичная структуры ENaC, необходимые для дальнейшего изучения функций канала. Впервые идентифицированы малые G-белки, участвующие в регуляции ENaC, и показаны механизмы их действия. Установлено, что малые G-белки участвуют как в модуляции воротных свойств канала, так и в сигнальных механизмах, приводящих к изменению количества функциональных каналов в плазматической мембране. Особый интерес представляют результаты, показывающие, что фосфатидилинозитиды принимают участие в регуляции активности канала малыми G-белками. Впервые определены сайты связывания ENaC с Р1(4,5)Р2 и Р1(3,4,5)Р3.
Теоретическое и практическое значение работы.
Результаты работы имеют большое теоретическое значение для понимания роли малых G-белков в регуляции ENaC и реабсорбции Na в эпителиальных клетках почки, а также роли этих каналов в поддержании необходимого уровня натрия в физиологических условиях и при различных патологиях. Полученные результаты позволяют расширить представление о эпителиальных натриевых каналах и механизмах их активности. Большое практическое значение работы состоит в определении стехиометрии канала, что позволяет более точно определить структуру и, соответственно, функции канала. В клетках почки абсорбция Na приводит к увеличению объема плазмы и повышению кровяного давления. В связи с этим повышенная активность ENaC вызывает гипертонию, а пониженная - гипотонию (2-4). Мутации генов, кодирующих субъединицы ENaC, приводят к ряду тяжелых наследственных заболеваний, таких как синдром Лиддла и псевдогипоальдостеронизм типа I (10-12). Таким образом, исследование сигнальных механизмов регуляции ENaC необходимо для понимания физиологических и патофизиологических процессов, участвующих в регуляции реабсорбции натрия.
Полученные важные данные о регуляции ENaC малыми G-белками и фосфатидилинозитидами могут быть полезны для изучения различных типов ионных каналов, включая другие каналы, входящие в семейство Deg/ENaC. Полученные результаты способствуют выяснению общих принципов
организации ионных каналов плазматических мембран в контексте их участия во внутриклеточной сигнализации.
Разработанная в процессе исследований новейшая технология, включающая в себя совместное использование флуоресцентных методов микроскопии (TIRF, FIR и FRAP), обладает уникальными возможностями для регистрации распределения функциональных каналов в плазматической мембране живых клеток. Данные по действию различных агентов на функциональные характеристики ENaC могут быть применены при разработке и тестировании фармакологических препаратов. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по клеточной биологии, физиологии и биофизике.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 6 Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2001), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии «Трансляция генома» (Вашингтон, США, 2004 и 2007), 37 съезде Американского Нефрологического общества (Сэнт-Луис, США, 2004), совместной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии и 35 международного съезда по Физиологическим наукам (Сан Диего, США, 2005), 49 международном съезде Биофизического общества (Лонг Бич, США, 2005), 5 международном Биофизическом конгрессе (Монпелье, Франция, 2005), 3 ежегодной конференции Центра Биомедицинских Нейронаук (Сан Антонио, США, 2005), 38 и 41 съезде Американского Нефрологического общества (Филадельфия, США, 2005 и 2008), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Франциско, США, 2006), 51 международном съезде Биофизического общества (Балтимор, США, 2007), национальном съезде Фонда по болезням почек (Орландо, США, 2007), 6 международном симпозиуме «Альдостерон и ENaC: от гена к болезням», 40 съезде Американского Нефрологического общества (Сан Франциско, США, 2007), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Диего, США, 2008), Пекинской совместной конференции по физиологическим наукам (Пекин, Китай, 2008), 53 международном съезде
Биофизического общества (Бостон, США, 2009), научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Нью Орлеан, США, 2009), международном конгрессе по Нефрологии (Милан, Италия, 2009) на семинарах кафедр физиологии, фармакологии или медицины (Научного центра здоровья Университета Техаса в Сан Антонио, Университета Калифорнии в Сан Франциско, Университета Флориды в Гэйнсвилле, Научного центра здоровья Государственного университета Луизианы в Новом Орлеане, Медицинского центра университета Рочестера, Аризонского университета, Университета Айовы, Университета Ла Лагуны и Медицинского колледжа Висконсина), а также на научных семинарах Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 363 публикации. Работа изложена на 218 страницах машинописного текста и иллюстрирована 69 рисунками и 4 таблицами.
