Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Влияние цитоплазматического натрия на активность сигнальных систем в клетке
2. Механизмы пассивного транспорта натрия в невозбудимых клетках
2.1. Натриевые каналы реабсорбирующих эпителиев
2.2. Потенциал-независимые натриевые каналы в клетках неэпителиального происхождения
3. Актиновые филаменты и клеточный кортекс
3.1. Структура и полимеризация актина
3.2. Семейство кэпирующих белков
3.3. ADF/кофилин
3.4. Гельзолин
3.5. Белки, связывающие глобулярный актин
3.6. Комплекс Агр2/3
3.7. Белки семейства WASP
3.8. G-белки и актиновый цитоскелет
3.8.1. Структурно-функциональная организация G-белков
3.8.2. G-белки семейства Rho: регуляция и роль в реорганизации актинового цитоскелета
3.8.3. Передача сигнала от Rho-белков на актиновый цитоскелет
3.9. Модель регулируемой полимеризации актина
ЗЛО. Связь примембранного актинового цитоскелета с клеточной поверхностью
4. Роль цитоскелета в регуляции ион-транспортирующих белков плазматической мембраны
4.1. Пространственная локализация ион-транспортирующих белков .
4.2. Модуляция активности ионных каналов
Материалы и методы 42
1. Клеточная культура 42
2. Электрофизиология 42
3. Растворы 44
4. Белки 45
5. Полимеризация актина 45
6. Обработка результатов 46 Результаты 47
1. Влияние цитохалазинов Д и Б на активность натриевых каналов в экспериментах на изолированном мембранном фрагменте
2. Влияние G-актина на активность натриевых каналов 49
2.1. Влияние различных видов актина на активность натриевых каналов
3. Регуляция активности натриевых каналов при участии кэпирующего белка CapZ
4. Влияние активаторов G-белков на активность натриевых каналов 63
4.1. Влияние G-актина на активность натриевых каналов, вызванную действием GTPyS
4.2. Блокирующее действие фаллоидина 65
4.3. Эксперименты с GTPyS и Са-актином 69
Обсуждение 71
1. Регуляция натриевых каналов клеток К562: роль микрофиламентов 71
2. Кэпирование актиновых филаментов вовлечено в регуляцию активности натриевых каналов
3. G-белки модулируют активность натриевых каналов посредством перестроек в системе микрофиламентов
Выводы 80
Список литературы
- Механизмы пассивного транспорта натрия в невозбудимых клетках
- ADF/кофилин
- Передача сигнала от Rho-белков на актиновый цитоскелет
- Влияние цитохалазинов Д и Б на активность натриевых каналов в экспериментах на изолированном мембранном фрагменте
Механизмы пассивного транспорта натрия в невозбудимых клетках
Вход ионов натрия в цитозоль из наружной среды имеет важное значение для регуляции многих внутриклеточных процессов. Активность ряда сигнальных систем в клетке ключевым образом зависит от концентрации ионов натрия в цитоплазме ([Nai+]).
Цитоплазматический натрий играет важную роль в регуляции активности ионных каналов. На миоцитах морской свинки показано, что р-адренергическая активация хлорного тока, кальциевого тока L-типа и калиевого тока замедленного выпрямления зависит от присутствия в экстраклеточном растворе ионов натрия (Harvey et al., 1991). Замещение экстраклеточного натрия катионами тетраметиламмония, холина, Tris или М-метил-Б-глюкамина (NMDG) вызывало уменьшение амплитуды этих токов. Было показано, что натрий влияет на аденилат-циклазную систему, которая участвует в регуляции этих токов. По-видимому, чувствительность хлорного, кальциевого и калиевого токов к экстраклеточному натрию отражает результат изменений [Na,+], который играет важную роль в поддержании каналов в фосфорилированном состоянии (Harvey etal., 1991).
Влияние различных катионов на кальциевые каналы L-типа в миоцитах морской свинки также исследовалось в работе Балке и Виер (Balke, Wier, 1992). В их работе, в отличие от данных Харви и соавторов, при замене внеклеточного натрия на Cs+, тетраэтиламмоний, NMDG наблюдалось 3-6- кратное увеличение пиковой амплитуды кальциевого тока, которое обратимо блокировалось антагонистами каналов L-типа - Cd и нитрендипином. При этом эффект внеклеточного натрия, по-видимому, также как в предыдущей работе был опосредован влиянием на цАМФ-зависимую протеинкиназу, участвующую в фосфорилировании кальциевого канала L-типа (Balke, Wier, 1992).
В плазматической мембране вентрикулярных миоцитов морских свинок подробно охарактеризованы натрий-активируемые калиевые каналы (Mistry et al., 1997).
Ряд исследований на возбудимых и невозбудимых клетках позволяет предполагать, что в физиологических условиях кальциевые каналы характеризуются значительной проницаемостью для ионов натрия. Для потенциал-зависимых кальциевых каналов известно, что нахождение по крайней мере двух ионов кальция в поре канала необходимо для возникновения кальциевого тока (Polo-Parada et al., 1997). В физиологических условиях, по-видимому, имеет место конкуренция между ионами натрия и кальция за второй сайт связывания в поре канала, в которой уже находится один ион кальция. Если пору канала занимает ион натрия, то это приводит к уменьшению кальциевой проводимости, и таким образом, в физиологических условиях, проводимость кальция через этот канал регулируется ионами натрия и составляет 50-70% от максимальной (Polo-Parada et al., 1997).
Хорошо известна роль ионов натрия в процессе синаптической передачи сигнала в нервно-мышечном соединении. В результате активации и инактивации натриевых каналов нервный импульс распространяется вдоль аксона, пока не достигнет места контакта с мышечной клеткой. Здесь под действием деполяризации открываются потенциал-зависимые кальциевые каналы. Увеличение локальной концентрации внутриклеточного свободного кальция ([Са;2+]) индуцирует слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной (Jahn, Sudhof, 1993). Уже многие годы было известно, что вход ионов натрия через потенциал-зависимые каналы приводит к деполяризации мембраны, но, кроме того, оказалось, что натрий может играть дополнительную роль в модуляции кальциевой проводимости через потенциал-зависимые кальциевые каналы (Romano-Silva et al., 1994; Basudev et al., 1995). Локальное повышение [Na;+] может оказывать значительное стимулирующее воздействие на кальциевую проводимость, сопряженную с высвобождением глютамата. Это происходит, по-видимому, в результате частичного ингибирования транслокации протеинкиназы С, что, вероятно, каким-то образом связано с медленной фазой высвобождения нейромедиатора (Basudev et al., 1995).
Уровень свободного кальция в цитозоле может контролироваться натрий-зависимыми механизмами. Так, например, в опытах на хромафинных клетках быка показано, что увеличение [Na;+] приводит к увеличению [Са;2+], поглощению 45Са2+ из среды и секреции катехоламинов (Liu, Као, 1990). В работе на гладкомышечных клетках аорты крысы показано, что удаление ионов натрия из раствора, омывающего клетки, и замещение его холином приводит к увеличению [Са;2+] (Batlle et al., 1991). Регуляция [Са +] в обоих случаях, по-видимому, осуществляется посредством натрий-зависимого механизма с участием Na+/Ca + обменника плазматической мембраны, который обеспечивает выход кальция из клетки, когда концентрация внутриклеточного кальция повышена, и вход кальция в цитоплазму из внеклеточной среды, когда повышена концентрация внутриклеточного натрия.
В мышечных клетках сердца быстрое высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума является ключевым событием, которое связывает электрическое возбуждение поверхностной мембраны и механическое сокращение клетки. Ранее считалось, что высвобождение кальция из ретикулума происходит исключительно в результате входа кальция в клетку через потенциал-зависимые кальциевые каналы клеточной мембраны. Однако в работе на изолированных вентрикулярных миоцитах морских свинок показано, что увеличение [Na;+] вызывает вход кальция в клетку посредством Na+/Ca2+ обменника, что в свою очередь приводит к выходу кальция из ретикулума. Таким образом, увеличение [Na;+] может выполнять роль фактора безопасности в сопряжении возбуждения и сокращения сердечной мышцы путем ускорения изменений [Са; ], ответственных за передачу сигнала в субсарколемном пространстве (Lipp, Niggli, 1994).
С помощью флуоресцентных измерений на клетках околоушных слюнных желез крысы показано, что АТФ вызывает временное увеличение [Са;2+], когда экстраклеточный кальций в растворе отсутствует. АТФ-индуцированный кальциевый ответ подавлялся при удалении экстраклеточного натрия (Fukushi et al., 1997). Авторы предполагают, что АТФ, действуя через P2Z пуринорецепторы, вызывает вход натрия через катионные каналы, а увеличение [Naj+], в свою очередь, вызывает высвобождение кальция из внутриклеточных депо (Fukushi et al., 1997).
ADF/кофилин
Помимо реабсорбирующих эпителиев, натрий-селективные каналы, характеризующиеся близкими функциональными свойствами и, возможно, отвечающие за поддержание натриевого баланса и объема клеток, были обнаружены в ряде других тканей. Как правило, отличием этих каналов от эпителиальных является пониженная чувствительность к амилориду и его аналогам. Такие каналы были описаны в плазматических мембранах сенсорных клеток лягушки и курицы (Avenet, Lindemann, 1988; Frings, Lindemann, 1988; Jorgensen, Ohmori, 1988), гладкомышечных клеток (Van Renterghem, Lazdunski, 1991), макрофагов (Negulyaev, Vedernikova, 1994) и клеток базофильной лейкемии крысы (Parekh, 1996), лимфоцитов (Bubien, Warnock, 1993), клеток эпидермальной карциномы А431 (Negulyaev et al., 1994) и клеток миелоидной лейкемии человека К562 (Negulyaev et al., 1996; Ведерникова и др., 1997).
Кроме того, оказалось, что имеется большая степень гомологии между а-субъединицей ЭНК и белками, отвечающими за передачу сигнала в ответ на механическую стимуляцию в нематодах Caenorhabditis elegans. Эти белки кодируются генами тес-4, тес-10, deg-І, имеют сходную с ос-субъединицей топологию и, вероятно, являются механочувствительными катионными каналами. Мутации генов тес-4, тес-10 приводят к изменению формы и отмиранию нейронов нематод, поэтому группу белков, кодируемых этими генами, часто называют дегенеринами (Chalfie et al., 1993; Hong, Driscoll, 1994; Huang, Chalfie, 1994; Lai et al., 1996).
Также были обнаружены и другие белки, анализ аминокислотной последовательности которых, позволил отнести их к семейству потенциал-независимых натриевых каналов. Так, в человеческой ДНК был выявлен фрагмент, содержащий ген, кодирующий белок, обозначенный как SNaCh (Waldmann et al., 1995). Как и субъединицы ЭНК, белок SNaCh содержит два участка, формирующие трансмембранные домены. Аминокислотная последовательность белка 8NaCh на 37% гомологична аминокислотным последовательностям а-субъединицы ЭНК крысы и человека. Анализ тканевого распределения РНК транскриптов 5NaCh показал, что, в отличие от субъединиц а-, (5- и у- каналов эпителиальных тканей, белок 8NaCh экспрессируется преимущественно в мозге, панкреатических и половых железах (Waldmann et al., 1995).
Еще один представитель семейства потенциал-независимых натриевых каналов - обнаруженный в моторных нейронах моллюсков канал, активирующийся коротким пептидом фен-мет-арг-фен-амидом (F-M-R-F-NH2-активируемый канал) (Greenberg, Price, 1992). Аминокислотная последовательность каналообразующего белка, обозначаемого как FaNaCh, в меньшей степени гомологична первичной структуре субъединиц натриевых каналов и дегенеринов (по сравнению с гомологией белков внутри этой группы). Однако, как и все представители семейства натриевых каналов, FaNaCh характеризуется единообразной топологией - формирует два трансмембранных домена (Lingueglia et al, 1995).
В результате исследований последних лет установлено, что к семейству потенциал-независимых натрий-проводящих каналов принадлежит еще один тип лиганд-управляемых каналов - протон-управляемые каналы нейронов мозга и спинальных ганглиев позвоночных животных (ASIC). В начале 80-х гг. электрофизиологами было высказано предположение о роли протон-управляемых каналов сенсорных нейронов для передачи болевых ощущений - ноцицептивной чувствительности (Krishtal, Pidoplichko, 1981; Akaike et al, 1990). После определения аминокислотной последовательности протон-управляемого канала оказалось, что она на 67% гомологична субъединицам ЭНК и дегенеринов Caenorhabditis elegans, и что канал формирует два трансмембранных домена (Waldmann et al., 1997).
Таким образом, семейство потенциал-независимых натриевых каналов, обнаруженных в различных тканях позвоночных и беспозвоночных животных, характеризуется гомологией первичной структуры каналообразующих белков и принципиальным сходством молекулярной организации и топологии в плазматической мембране. Механизмы регуляции новых типов натрий-проводящих каналов, идентифицированных в плазматической мембране невозбудимых клеток, мало изучены. Согласно современным представлениям, одной из важнейших клеточных систем, структурно и функционально связанных с работой ионных каналов плазматической мембраны эукариотических клеток, является кортикальный актиновый цитоскелет. Плазматическая мембрана тесно связана с кортикальным актиновым слоем, так что их можно считать единым функциональным образованием. Кортикальный цитоскелет является динамичной структурой, способной перестраиваться в ответ на нужды клетки. Процессы сборки-разборки микрофиламентов находятся под контролем множества различных белков, которые регулируют сборку актиновых филаментов, соединяют их в пучки или сети и определяют их расположение, длину и другие свойства. В следующем разделе остановимся подробно на актин-связывающих белках, обеспечивающих разнообразие структур кортекса.
Передача сигнала от Rho-белков на актиновый цитоскелет
Семейство белков WASP состоит из следующих белков: WASP, N-WASP и SCAR/WAVE. WASP изначально был обнаружен у пациентов с синдромом Wiskott-Aldrich, генетическим иммуннодефицитным заболеванием, характеризующимся пониженной подвижностью лимфоидных клеток (Ochs et al., 1980). WASP присутствует в гемопоэтических клетках, N-WASP имеется в клетках мозга, сердца и легких, a Scar/WAVE экспрессируются повсеместно. WASP-подобные белки обнаруживаются в различных организмах, от дрожжей до человека и характеризуются консервативностью (Mullins, 2000). WASP и N-WASP содержат РН (plekstrin-homology) OMeH, который связывает PIP2. WASP-белки являются медиаторами активированных малых G-белков Rac и Cdc42. Активированный WASP связывает Агр2/3 комплекс и стимулирует его нуклеирующую активность. Кроме того, N-WASP может непосредственно способствовать полимеризации актина, т.к. его №-І2-концевой участок связывается с F-актином, а СООН-концевой с G-актином, и подобно профилину, N-WASP перемещает мономеры актина на плюс-конец растущего филамента (Pollard et al., 2000).
ГТФ-связывающие белки (G-белки) относятся к суперсемейству ферментов ГТФаз, т.е. они могут осуществлять гидролиз гуанозинтрифосфата. Выделяют два класса G-белков - гетеротримерные, состоящие из трех субъединиц, и мономерные (или малые), состоящие из одной субъединицы. Гетеротримерные G-белки участвуют в передаче сигнала от рецепторов с семью трансмембранными спиралями (такие рецепторы называются также серпентиновыми или рецепторами, сопряженными с G-белками). В настоящее время идентифицировано около 100 таких рецепторов. Для всех этих рецепторов характерна сходная топология - одна полипептидная цепь, которая семь раз пронизывает мембрану. К этой группе относятся а- и Р-адренэргические рецепторы, дофаминовые рецепторы, мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, рецепторы серотонина и ряд других (Clapham, 1996).
Гетеротримерный G-белок состоит из трех субъедениц: а, р и у. а -субъединица связывает и гидролизует ГТФ, Р и у формируют димер, который диссоциирует только в условиях денатурации. Активированный серпентиновый рецептор связывается с комплексом Gapy, главным образом через а-субъединицу. Это ведет к замене ГДФ на ГТФ в составе a-субъединицы и последующей диссоциации комплекса на Ру и a-ГТФ, которые способны независимо передавать сигнал далее, a-субъединица является ГТФазой, и гидролиз ГТФ на ГДФ и фосфат приводит через некоторе время к воссоединению начального трехсубъединичного комплекса, готового к принятию нового сигнала (Neer, 1995). Регуляторный цикл гетеротримерных G-белков представлен на рис. 1.
Для гетеротримерных G-белков показана двойная регуляция белков-мишеней. Во-первых, активированный G-белок может прямо влиять на эффекторную молекулу. Такой быстрый путь регуляции показан для некоторых ионных каналов, например, потенциал-зависимых кальциевых и натриевых каналов сердца, а также для некоторых ферментов. Во-вторых, G-белок может действовать опосредованно, запуская цепь событий, изменяющих концентрацию одного или нескольких внутриклеточных посредников, наиболее важные среди которых - цАМФ, Са2+, инозитолтрифосфат. Эти молекулы, в свою очередь действуют, изменяя поведение белков-мишеней в клетке (Neer, 1995). С другой стороны, эффекторная молекула может взаимодействовать с несколькими G-белками. Так, для амилорид-чувствительного натрий-селективного канала в лимфоидных клетках характерна двойная регуляция G-белками (Bubien et al., 1994). С одной стороны, активированный Gs-белок приводит к активации канала, действую через цАМФ-зависимый механизм. Gs-белок активирует синтез цАМФ аденилатциклазой, цАМФ активирует протеинкиназу А, которая фосфорилирует субъединицу канала, что приводит к его открыванию. С другой стороны, активированный Gj-белок инактивирует канал, и это происходит в результате прямого связывания х;-субъединицы с молекулой канала (Bubien et al., 1994). Малые G-белки являются мономерами с молекулярным весом 20-40 кДа. В клетках эукариот идентифицированы около 100 малых G-белков. По меньшей мере 5 семейств - Ras, Rho, Rab, Sarl/Arf и Ran - составляют надсемейство малых ГТФ-связывающих белков. В настоящее время изучены функции многих малых G-белков. Белки семейства Ras в основном регулируют экспрессию генов, члены семейства Rho регулируют перестройки актинового цитоскелета и экспрессию генов, белки семейства Rab и Sarl/Arf регулируют внутриклеточный везикулярный транспорт, а белки семейства Ran регулируют ядерноцитоплазматический транспорт в фазах Gl, G2 и S клеточного цикла и организацию аппарата микротрубочек в М-фазе (Takai et al., 2001). Многие регуляторные и эффекторные молекулы малых G-белков были идентифицированы, и, во многом, изучены пути их активации. Поскольку представители семейства Rho осуществляют контроль за состоянием актинового цитоскелета, остановимся подробнее именно на этих белках.
Влияние цитохалазинов Д и Б на активность натриевых каналов в экспериментах на изолированном мембранном фрагменте
Мы показали, что инактивация натриевых каналов, вызванная полимеризацией актина на цитоплазматической поверхности мембраны, может быть предотвращена актин-связывающим кэпирующим белком CapZ. Это происходило в том случае, когда CapZ добавляли в раствор камеры либо одновременно с G-актином, либо непосредственно после начала сборки филаментов на мембране. Наши опыты свидетельствуют о том, что CapZ не оказывает прямого эффекта на активность и свойства натриевых каналов и не связывается необратимо с мембраной. Мы предположили, что эффект CapZ заключается в модификации сборки актина.
Когда CapZ добавляли одновременно с G-актином, инактивации каналов не происходило даже тогда, когда молярное соотношение CapZ/актин было низким. Из опытов по измерению вязкости следует, что при низких соотношениях CapZ/актин формирующиеся филаменты лишь незначительно короче, чем филаменты со свободными плюс-концами. Такие филаменты могли бы привести к закрытию каналов, если бы они формировались на плазматической мембране. Отсутствие инактивации свидетельствует о том, что при одновременной подаче CapZ и G-актина происходит более быстрая сборка филаментов в растворе, чем на мембране. CapZ, добавленный в ходе процесса инактивации каналов под действием полимеризующегося актина, может связываться с плюс-концом растущих филаментов и препятствовать дальнейшему присоединению мономеров к этому концу (Isenberg et al., 1980; Schafer et al., 1996; Kuhlman, Fowler, 1997). Таким образом, дальнейшая элонгация будет возможна только на минус-конце, что приведет к снижению скорости сборки филаментов. Кроме того, CapZ обладает нуклеирующей активностью (Remmert et al., 2000) и, следовательно, способствует полимеризации мономеров актина в растворе. Это может привести к тому, что пул мономеров, необходимых для элонгации филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной, уменьшится. Кэпирование плюс-концов приводит к увеличению критической концентрации, необходимой для дальнейшей полимеризации. Таким образом, по-видимому, останавливается дальнейшая элонгация и происходит частичная разборка филаментов, ассоциированных с мембраной, что, в свою очередь, предотвращает инактивацию и частично восстанавливает активность каналов.
Кэпирующие белки, родственные мышечному белку CapZ, были обнаружены во многих клетках, в том числе в тромбоцитах (Barkalow et al., 1996), нейтрофилах (Maun et al., 1996), эритроцитах (Kuhlman, Fowler, 1997) и в различных культивируемых клетках (Schafer et al., 1998). Соотношение кэпирующего белка к актину было оценено в тромбоцитах как 1:90 (Barkalow et al., 1996), что является близким к значению, использованному в наших экспериментах. Показано, что кэпирующий белок локализуется на периферии клеток (Schafer et al., 1998), где участвует в динамических перестройках кортикальных актиновых структур (Cooper, Schafer, 2000). В нашей работе показана роль кортикального цитоскелета, одним из компонентов которого являются кэпирующие белки, в регуляции активности натриевых каналов.
Можно сопоставить влияние белка CapZ и гельзолина (Maximov et al., 1997; Negulyaev et al., 2000) на функционирование натриевых каналов. При микромолярном уровне внутриклеточного кальция гельзолин фрагментирует F-актин и кэпирует образующиеся плюс-концы филаментов. Вероятно, в клетках при повышении уровня кальция гельзолин может индуцировать активацию натриевых каналов, тогда как кэпирующий белок будет поддерживать каналы в открытом состоянии, независимо от [Са І].
Таким образом, мы впервые показали, что кэпирование актиновых филаментов может быть вовлечено в регуляцию натриевых каналов. Модификации кортикального актинового цитоскелета кэпирующими белками могут быть важны для поддержания необходимого уровня натриевого входа в невозбудимых клетках.
В наших экспериментах с использованием негидролизуемого аналога GTP - GTPyS получены данные, свидетельствующие об участии G-белков в регуляции натриевых каналов в клетках К562. Показано, что GTPyS приводит к активации натриевых каналов, соответствующих по своим характеристикам каналам, активирующимся при разрушении кортикального актинового цитоскелета. Фторид алюминия (A1F4"), активатор гетеротримерных G-белков (Gilman, 1987), не вызывал активации натриевых каналов, что указывает на то, что, по-видимому, GTPyS приводит к активации мономерных (малых) G-белков. GTPyS не активировал каналы, когда фрагмент мембраны преинкубировали с фаллоидином или когда GTPyS вводили одновременно с G-актином. Кроме того, активность каналов, вызванная GTPyS, ингибировалась полимеризующимся актином так же, как в опытах с цитохалазинами. Таким образом, G-белки вовлечены в регуляцию каналов опосредованно, их роль заключается в модуляции процессов сборки-разборки кортикального актинового цитоскелета.
Известно, что малые G-белки семейства Rho (Rho, Rac, Cdc42) регулируют перестройки актинового цитоскелета в клетках (Takai et al., 2001). Rho-белки модулируют активность многих актин-связывающих белков и, в частности, могут вызывать диссоциацию кэпирующих белков от плюс-концов актиновых филаментов (декэпирование) (Schafer et al., 1996). В пермеабилизованных тромбоцитах Rac увеличивает количество свободных плюс-концов филаментов и тем самым имитирует действие агониста рецептора к тромбину и GTPyS (Hartwig et al., 1995). Аналогичным образом, в нейтрофилах активация G-белка при добавлении GTPyS может приводить к запуску полимеризации актина путем высвобождения плюс-концов (Tardif et al., 1995). В дальнейшем в экспериментах на бесклеточных системах из цитозоля нейтрофилов было обнаружено, что GTPyS неспособен инициировать полимеризацию в присутствии RhoGDI и токсина В из Clostridium difficile, специфичных ингибиторов Rho-белков (Katanaev, Wymann, 1998), что доказывает участие этих белков в процессе, индуцированном GTPyS. Вероятно, в наших экспериментах разборка актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной, также происходит в результате декапирования плюс-концов. В клетке декэпирование плюс-концов микрофилам ентов, как правило, приводит к дальнейшей полимеризации, поскольку в цитоплазме содержится большое количество мономерного актина, который быстро присоединяется к свободным плюс-концам. Однако если во время эксперимента на изолированном участке мебраны в составе внутриклеточного раствора отсутствует G-актин, «декэпирование» микрофиламентов, связанных с мембраной, будет приводить к обратному эффекту, а именно к их разборке. Подтверждением этого предположения служат опыты, в которых GTPyS был не способен индуцировать активность каналов в присутствии Са-актина. Таким образом, мы полагаем, что в клетках К562 активация малого G-белка инициирует каскад реакций, приводящий к высвобождению концов актиновых филаментов. На свободных концах филаментов будет происходить присоединение или потеря мономеров в зависимости, соответственно, от присутствия или отсутствия пула G-актина.
