Введение к работе
2005-4
13037 Актуальность проблемы
Роль белков теплового шока (Heat shock proteins, Hsp) в защите клеток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, а также в процессах клеточной репарации, сегодня не вызывает сомнений. Наиболее изученным является основной белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа - Hsp70 (Маргулис, Гужова, 2000). Защитная роль этого белка во многом обусловлена его шаперонной активностью - способностью поддерживать денатурированные и вновь синтезированные полипептиды в развернутой конформации. Из этого вытекает участие шаперонов в таких жизненно-важных клеточных процессах, как транспорт белков в различные компартменты, сборка из них активных структур, а также утилизация необратимо денатурированных белковых молекул. На сегодняшний день достоверно показано участие белков теплового шока в патогенезе многих заболеваний, а также накапливаются факты о возможном терапевтическом и иммуномодулируюшем эффекте Hsp70.
В основе шаперонного механизма Hsp70 лежит связывание им гидрофобных участков последовательности белков-мишеней, оказавшихся на поверхности белковых молекул вследствие утраты ими нативной конформации. Hsp70 может восстановить нарушенную исходную укладку полипептидной цепи, однако работа этого шаперона невозможна без участия регуляторных белков-помощников, в первую очередь Hdjl (Hsp40) и Bagl. Именно взаимодействие этих белков-кошаперонов с Hsp70 вызывает последовательное АТФ-зависимое изменение его конформации, делающее возможным захват и высвобождение субстратов (Takayama et al., 1997; 1999; Zeiner et al., 1997; Cheetham et al., 1998, Kelley, 1998).
Общие принципы работы шаперонного механизма на базе Hsp70 в настоящее время достаточно полно описаны, в основном благодаря интенсивным экспериментам in vitro, проводившимся в конце 90-х годов с изолированными рекомбинантными белками, происходящими из разных видов млекопитающих и микроорганизмов. Исключительно важное, на наш взгляд, значение имеют количественные характеристики взаимодействия Hsp70 с двумя основными белками-помощниками. Их соотношения, по-видимому, являются определяющим звеном регуляции работы всего шаперонного механизма Hsp70. Смещения баланса между рассматриваемыми белками может приводить к изменениям активности системы на тех или иных этапах ответа клетки на стресс. Значительный прогресс в понимании влияния кошаперонов Hdjl и Bagl на активность Hsp70 был получен благодаря опытам in vivo. Однако попытки описания взаимодействия участников шаперонно-субстратного комплекса, оверэкспрессируемых в модельных клетках, также не внесли полной ясности. Основной проблемой исследователей явилось нарушение клеточного метаболизма множественной трансфекцией. Таким образом, сегодня все еще не хватает информации о взаимодействии Hsp70 с белками-помощниками Hdjl и Bagl в живых клетках, располагающих естественным полем деятельности для клеточных шаперонов. Оптимальной системой для оценки шаперонной активности Hsp70 является, на наш взгляд, клеточный зкетрдкі^содепжащий шапероны, белки-помощники и белки-мишени в реальных колдадсШё(НЛЛДОйЙ1ЩЩ^4х. Кроме того,
| БИБЛИОТЕКА
І1 С.Петербург у і'/4
внесение дополнительных факторов в экстракт не вызывает усложнения системы или ее искажения, особенно при применении рекомбинантных белков человека, практически идентичных эндогенным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась характеристика шаперонной активности Hsp70 и выявление при помощи традиционных и новых оригинальных методов степени ее регуляции количественными изменениями кошаперонов Hdjl и Bagl в реакции клеток человека на тепловой стресс.
Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:
показать взаимодействие белков Hsp70, Hdjl и Bagl на разных стадиях ответа клеток на тепловой стресс с помощью методов реципрокной ко-иммуноцреципитации и конфокальной микроскопии;
разработать, изготовить и апробировать специальную разновидность иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения Hsp70 в различных образцах;
оценить с ее помощью изменение количества Hsp70 в клетках человека в развитии реакции на тепловой шок;
определить степень влияния АТФ и АДФ на шаперонную активность Hsp70, очищенного и в составе клеточных экстрактов;
охарактеризовать влияние кошаперонов Hdjl и Bagl на шаперонную активность Hsp70 , очищенного и в составе клеточных экстрактов;
выяснить направленность воздействия Bag- и J-доменов белков семейств Bag и Hdj на шаперонную активность Hsp70.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
степень связывания белком теплового шока 70 кДа своих кошаперонов Hdj 1 и Bagl определяется этапом реакции клетки на стресс;
-
созданная принципиально новая система иимуноферментного анализа для количественного определения Hsp70 может быть успешно использована на практике, в том числе вместе с оригинальной системой ИФА для оценки шаперонной активности данного белка;
-
шаперонная активность Hsp70 регулируется ею количественными соотношениями с кошаперонами Hdj 1 и Bagl;
-
молярная концентрация АТФ является критичной для выполнения Hsp70 его шаперонной функции;
-
консервативные J- и Bag-домены кошаперонов Hdjl и Bagl способны модулировать шаперонную активность Hsp70, очищенного и в составе клеточных экстрактов.
Научная новизна.
Прослежено изменение шаперонной активности основного белка теплового шока Hsp70 в развитии реакции клеток лейкемии человека К562 на тепловой стресс. Показано, что при этом изменяется как предпочтительность связывания Hsp70 с кошаперонами Hdjl и Bagl, так и внутриклеточная локализация этих белков. Произведено точное измерение количеств основного белка теплового шока Hsp70 и его кошаперонов, в том числе с помощью разработанной нами принципиально новой разновидности иммуноферментного анализа. Эти данные впервые позволили сделать вывод, что шаперонная активность Hsp70 определяется его соотношением с белками-помощниками Hdjl и Bagl.
Получены данные о критичности АТФ для выполнения шаперонной функции белком Hsp70. Показано, что высокоафинные к Hsp70 консервативные домены кошаперонов Hdjl и Bag! способны угнетать его шаперонную активность, что подтверждает возможность регуляции функции Hsp70 специфическими петидами на клеточном и организменном уровнях.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты свидетельствуют о саморегуляции шаперонной системы на базе Hsp70 в процессе реакции клеток К562 на тепловой стресс соотношением белков Hsp70, Hdj 1 и Bagl. Успешное использование консервативных доменов белков Hdjl и Bagl для угнетения шаперонной активности Hsp70 позволяет проводить разработку различных пептидных модуляторов активности шаперонов. Помимо фундаментальных исследований, такие пептидные модуляторы могут быть использованы в медицинской практике для выключения защитных систем раковых клеток и активации таких систем в клетках, моделирующих протеотоксические заболевания.
Разработанная принципиально новая разновидность иммуноферментного анализа для количественного определения Hsp70 успешно апробирована в научных и медицинских исследованиях и готова к широкому применению. Результаты работы войдут в материалы специального учебного курса по шаперонным системам, читаемым на биолого-почвенном факультете СПбГУ.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи и 1 свидетельство о патентной защите. Основные положения представлены на 1-ой ежегодной Международной конференции северных стран по ответу на стресс (The Nordic Stress Response Network), (21-23 сентября 2001 г, Копенгаген, Дания); Международной конференции балтийских стран по клеточной биологии (NorFA Baltic Meeting on Cell Biology), (22-25 мая 2003 г, Тарту, Эстония); 13-ой Европейской конференции по артериальной гипертензии (13-17 июня 2003 г, Милан, Италия); 1-ом съезде Общества клеточной биологии, (14-16 октября 2003 г, Санкт-Петербург); Международном междисциплинарном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицинам, (14-24 февраля 2004 г, Хургада, Египет);
8-ой Междисциплинарной Международной конференции «Стресс и поведение», (17-19 мая 2004 г, Санкт-Петербург); 4-ой Международной конференции по молекулярной биологии ответа на стресс, (13-16 мая 2004 г, Вуан, Китай); 13-ой Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (24-27 мая 2004 г, Санкт-Петербург), 14-ой Европейской конференции по артериальной гипертензии (13-17 июня 2004 г, Париж, Франция).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 140 публикаций. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и иллюстрирована 18 рисунками и 2 схемами.
