Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 8
2.1. Апоптоз. 8
2.1.1. Основные морфологические черты апоптоза. 8
2.1.2. Биохимические механизмы апоптотической гибели . 13
2.1.3. Активация и регуляция каспазного каскада. 17
2.2 Участие онкобелка Мус в регуляции апоптоза. 22
2.3. Защитные системы опухолевых клеток. 31
2.4. Белки теплового шока. 33
2.4.1. Белки теплового шока и их классификация . 33
2.4.2. Семейство белков Hsp70 и его функции. 35
2.4.3. Роль Hsp70 в процессе апоптоза. 41
3. Материалы и методы. 48
3.1. Клеточные линии и их культивирование. 48
3.2. Тепловое воздействие и индукция синтеза Hsp70. 49
3.3. Трансфекция клеток. 49
3.4. Анализ ядерной локализации MycER после индукции ОНТ. 50
3.5. Индукция и оценка апоптоза. 50
3.6. Анализ кинетики каспазной активности. 50
3.7. Антитела. 51
3.8. Анализ фрагментации клеточной ДНК. 51
3.9. Анализ транслокации цитохрома с. 52
3.10. Коиммунопреципитация и лиганд-блоттинг. 53
3.11. Выделение и очистка белков теплового шока семейства 70 кДа. 55
3.12. Статистическая обработка. 56
4. Результаты. 57
4.1. Тепловой шок снижает чувствительность опухолевых клеток с высоким содержанием Мус к действию противоопухолевых препаратов.
4.2. Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов . 60
4.3. Молекулярные механизмы подавления Мус-опосредованного апоптоза. 63
4.4. Процесс апоптоза, инициированный v-Myc, специфически подавляется ингибитором каспазы 9. 65
4.5. Hsp70 регулирует активность эффекторных каспаз, но не влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий. 66
4.6. Hsp70 физически взаимодействует с каспазой 3 и каспазой 7. 68
5. Обсуждение. 72
6. Выводы. 82
7. Список литературы. 83
- Биохимические механизмы апоптотической гибели
- Белки теплового шока и их классификация
- Выделение и очистка белков теплового шока семейства 70 кДа.
- Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение процессов инициации и прогрессии злокачественных новообразований является одной из важнейших задач современной клеточной биологии и медицины. Известно, что огромное разнообразие опухолевых клеток объединяет их повышенная способность к пролиферации. Эта способность обычно складывается из двух компонентов: из увеличенной способности к росту в конкретных условиях (уменьшенной потребности в ростовых факторах, сниженной зависимости от прикрепления и т.п.) и из способности расти неопределенно долгое время (клеточное бессмертие, иммортализация, способность к бесконечно долгой пролиферации).
Сегодня известно три основных, классических или традиционных метода лечения онкологических заболеваний: хирургический, лучевой и лекарственный (химиотерапия, гормонотерапия). Современная медицина, используя последние достижения науки, продолжает развивать наиболее значимые направления в лечении: гипертермия, гипергликемия, торможение роста опухоли, облегчение доставки лекарств, воздействие на мембраны опухолевых клеток. Существуют также экспериментальные методы, показавшие свою достаточную эффективность и готовые выйти из области научных исследований в широкую клиническую практику: аутопересадка красного костного мозга в сочетании с большими дозами цитостатиков, генная терапия, электрохимиотерапия, фокусированный ультразвук высоких энергий (выжигающая терапия опухолей), применение противоопухолевых вакцин. Разрабатываются и другие методы, которые находятся либо в начальной стадии изучения, либо эффективны лишь при лечении отдельных видов опухолей.
Целью противоопухолевой терапии является уничтожение раковых клеток без ущерба для окружающих нормальных тканей; поэтому большинство химиотерапевтических препаратов задумано так, чтобы остановить пролиферацию опухолевых клеток и запустить процесс программируемой клеточной смерти (апоптоз).
Для многих спонтанных опухолей имеются серьезные доказательства вовлеченности определенных клеточных генов, и, прежде всего онкогенов, генов-супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла в процесс канцерогенеза, но для подавляющего большинства опухолей молекулярные механизмы запуска "онкогенной" программы клетки остаются неизвестными. Интересно, что многие протоонкогены, в частности протоонкогены семейства Мус, запускающие клеточную пролиферацию, одновременно предрасполагают клетки к апоптозу (Reed, 2003). Генетические изменения протоонкогена Мус, ведущие к его нерегулируемой экспрессии, характерны для множества опухолей различного
происхождения - лимфомы Беркитта, рака легкого и рака молочной железы (Amati et al., 2001). Белки семейства Мус являются транскрипционными факторами, и неизвестна ни одна мутация онкогенных представителей этого семейства (v-myc, с-myc, N-myc и L-myc), которая бы инактивировала проапоптотическую функцию, не затронув их способность стимулировать пролиферацию. Было сделано предположение, что Мус влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий, тем самым предрасполагая клетки к митохондриальному пути реализации апоптоза (Juin et al., 1999).
В процессе канцерогенеза опухолевые клетки вырабатывают собственные защитные системы, вследствие чего они значительно отличаются от нормальных клеток организма, в том числе и по способности вступать в апоптоз. Одна из защитных систем основана на шапероне Hsp70. Этот белок обладает двумя очень важными свойствами: шаперонной активностью и способностью защищать клетки от разнообразных неблагоприятных факторов. Шаперонная активность - это способность белка связываться с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами, транспортировать их через сеть внутриклеточных мембран и экспонировать их белок-модифицирующим системам (Morimoto et al., 1997). Данные огромного числа экспериментов in vitro и in vivo убедительно свидетельствуют о том, что Hsp70 представляет собой наиболее эффективную и консервативную защитную систему клеток и целого организма (Jaattela, 1999; Маргулис, Гужова, 2009).
Высокий уровень экспрессии Hsp70, обнаруженный в опухолевых клетках, по-видимому, является препятствием для противоопухолевой терапии, и свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для больного при некоторых видах новообразований (Ciocca et al., 1993; Ricaniadis et al., 2001). Ранее было установлено, что Hsp70 спасает раковые клетки от действия многих факторов, вызывающих апоптоз, включая такие, как TNF-a, стауроспорин, жесткий тепловой стресс и многие другие. (Samali, Orrenius, 1998; Гужова и др., 2000). Более того, Hsp70 может тормозить процесс апоптоза на различных его фазах. Наиболее убедительное доказательство противоапоптозного действия Hsp70 было представлено в экспериментах на карциноме молочной железы МСН-7, в которых в клетки вводили анти-смысловую mPvNA к Hsp70, в результате чего они погибали путем апоптоза (Nylandsted et al., 2000). Несмотря на интенсивные исследования, механизм защитной функции Hsp70 остается неясным. Однако большинство данных свидетельствует о превалирующей роли Hsp70 в ингибировании митохондриального пути апоптоза (Beere, Green, 2001). Исходя из вышеизложенных фактов, можно предположить, что Hsp70 также способен к кооперации с Мус в процессе канцерогенеза.
Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении функции шаперона Hsp70 на клеточном и молекулярных уровнях в процессе апоптоза,
$
стимулированном действием противоопухолевых препаратов, в раковых клетках с нормальной и повышенной экспрессией протоонкогена Мус. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Выяснить, может ли повышенная экспрессия Hsp70 подавлять действие противоопухолевых препаратов, направленное на индукцию апоптоза в популяции опухолевых клеток.
Сравнить обусловленную Hsp70 устойчивость опухолевых клеток с нормальной и повышенной экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов.
Используя модель на основе клеток U-937, выяснить механизм подавления Hsp70 апоптоза, управляемого v-Myc.
Выяснить, способен ли Hsp70 изменять кинетику активации эффекторных каспаз в клетках миелоидной лейкемии человека.
Проверить возможность взаимодействия Hsp70 с эффекторными каспазами в ходе апоптоза клеток миелоидной лейкемии человека, индуцированного противоопухолевыми препаратами.
Научная новизна работы. Впервые показано, что чувствительность опухолевых клеток к апоптозу, вызванная повышенной экспрессией протоонкогена Мус, подавляется Hsp70 в большей степени, чем в клетках с регулярной экспрессией онкогена. Найдены новые мишени для защитного действия Hsp70 в процессе апоптоза - эффекторные каспазы 3 и 7.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе показано, что повышенная экспрессия Hsp70, характерная для опухолевых клеток, делает их нечувствительными к действию противоопухолевых препаратов. Показан механизм, с помощью которого осуществляется защитная функция Hsp70. Несмотря на то, что работа имеет фундаментальную направленность, полученные данные позволяют рекомендовать практикующим онкологам включать признак «содержание Hsp70» в набор диагностических факторов и учитывать в выработке противоопухолевой стратегии.
Основные положения, выносимые на защиту:
Hsp70 обладает сильным антиапоптотическим эффектом при действии на раковые клетки противоопухолевыми препаратами.
Защитный эффект Hsp70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессии протоонкогена Мус.
Противоапоптозное действие Hsp70 осуществляется ниже по течению, чем выброс цитохрома с из митохондрий.
Каспаза 3 и каспаза 7 - новые мишени для осуществления противоапоптозной функции Hsp70.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов. Материалы диссертации представлены на 13-м Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-
Петербург, 1999), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), 4-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001), 1-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Копенгаген, Дания, 2001), 2-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Санкт-Петербург, 2002), 2-м Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Украина, 2003), 1-м Всемирном конгрессе по раку «От фундаментальной науки к терапии рака» (Шанхай, Китай, 2008), 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 4-м Международном симпозиуме «Белки теплового шока в биологии и медицине» (Лаборатория морской биологии, Вудс Хол, США, 2008) и обсуждались на научных семинарах Лаборатории защитных механизмов клетки и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 ссылок. Иллюстративный материал представлен 15 рисунками и 1 таблицей.
Биохимические механизмы апоптотической гибели
Апоптоз является полезным и необходимым для жизнедеятельности организма процессом. С 1990-х годов апоптоз активно изучается, поскольку выяснилось, что нарушения в этом процессе приводят к различным патологиям. Так, недостаточно эффективная работа механизмов апоптоза приводит к образованию опухолей, а избыточная их функция вызывает массовую утрату клеток, например при нейродегенеративных процессах.
Апоптоз наступает, в частности, если клетка заражена вирусом или слишком сильно повреждена агрессивными химическими агентами или ионизирующим излучением (например, рентгеновскими лучами). Решение о запуске механизмов апоптоза клетка может принять сама или это могут сделать соседние клетки или клетки иммунной системы. Если клетка не в состоянии запустить процесс апоптоза вследствие мутации или вирусной инфекции, она может начать бесконтрольно делиться, что приводит к образованию опухоли. Так, человеческий папилломавирус использует свой ген Е6, чтобы разрушить белок р53, критически важный для инициации апоптоза. В результате инфекция этим вирусом может вызвать развитие рака шейки матки (Levine, 2009).
Процесс апоптоза крайне важен для надежной работы иммунной системы: Т-клетки, созревая в тимусе, постоянно тестируются на способность распознать чужеродный антиген. Те из них, кто не способен это сделать, а это около 97 % всех вновь созревающих клеток, должны вступить в процесс апоптоза. Еще один тест для клеток иммунной системы — тест на безопасность для «своих»: клетки, слишком сильно реагирующие на собственные белки, также приговариваются к апоптозу. В дальнейшем, встретив клетку с чужеродным белком, Т-клетки и В-клетки подают ей сигнал на запуск апоптоза.
Апоптоз играет важную роль в поддержании гомеостаза. Ежедневно у здорового человека возникает от 50 до 70 миллиардов новых клеток, и такое же количество их гибнет, в основном за счёт включения механизмов апоптоза. За год обновляется столько клеток, что их общий вес равен весу тела.
Апоптоз играет важную роль в развитии эмбрионов и морфогенезе животных и растений. Так, например, разделение пальцев у эмбриона требует, чтобы клетки, находящиеся между пальцами, погибли. Таким образом, апоптоз - физиологический процесс элиминации клеток, играющий основополагающую роль в развитии и поддержании гомеостаза многоклеточных организмов.
Помимо вышеизложенных отличий апоптоза от некроза, эти процессы коренным образом различаются на молекулярном уровне. Именно открытие молекулярных механизмов апоптотической гибели послужило причиной выделения апоптоза в особый тип гибели клеток.
Биохимические механизмы апоптотической гибели. Как уже было отмечено, в финальной фазе апоптоза наблюдается фрагментация хроматина. При этом происходит дробление ДНК, которое осуществляется в два этапа: сначала происходит разрезание на фрагменты длиной от 50 до 300 тыс. пар оснований; затем ДНК расщепляется на межнуклеосомные фрагменты. Дробление ДНК происходит вследствие активации специфической каспазоактивируемой дезоксирибонуклеазы CAD (caspase activated DNAsa). В норме CAD присутствует в клетке в виде неактивного комплекса со своим ингибитором ICAD. В процессе апоптоза, ингибитор расщепляется каспазами, CAD активируется и функционирует, как специфическая эндонуклеаза; это позволяет уничтожить ДНК индивидуальной клетки и, одновременно, делает процесс программируемой клеточной гибели безопасным для окружающих клеток. Ранее считали, что события в клеточном ядре являются определяющими в осуществлении апоптоза. Однако позже было установлено, что блокирование расщепления ДНК хотя и замедляет, но не предотвращает гибель клетки, а события, характерные для апоптоза, могут происходить в безъядерных цитопластах (Cohen et al., 1992). К настоящему времени накоплено большое количество данных об участии цитоплазматических протеаз в инициации и осуществлении программы апоптоза (Vaux, 1999), и именно этим ферментам приписывается основная роль в реализации программированной гибели клетки.
Белки, участвующие в проведении апоптозного сигнала начали идентифицировать в 80-ьтх годах прошлого столетия. У почвенной нематоды Caenorhabditis elegans были найдены 14 различных генов, продукты которых вовлечены в процесс апоптоза. Три из них - проапоптотические ced-3, ced-4 и антиапоптотический ген ced-9 - вызвали особый интерес, поскольку их гомологи были обнаружены у многих высших организмов. Белок CED-9 гомологичен Bcl-2, известному ингибитору апоптоза (Hengartner, Horvitz, 1994). Гомологом CED-4 у млекопитающих является Apaf-І. Гомологи CED-3 найдены у насекомых, амфибий, грызунов и приматов. У человека гомологом CED-3 является interleikin 1 3-converting enzyme (ICE). ICE является внутриклеточной протеазой, которая участвует в созревании интерлейкина-ір, сигнального белка, участвующего в активации воспалительного процесса. В настоящий момент у позвоночных найдено 14 белков ICE семейства. Так как все протеазы данного семейства содержат цистеин в активном сайте и специфически разрезают белки по аспарагиновому остатку, то в дальнейшем белки этого семейства стали называть цистеин-зависимыми аспартат-специфичными протеазами, или каспазами (caspases = cysteine-dependent aspartate-specific proteases). Было показано, что повышенная экспрессия генов каспаз вызывает апоптотическую гибель клеток с характерными морфологическими признаками (Samali, 1999; Levkau et al., 1999).
Белки теплового шока и их классификация
. История изучения белков теплового шока начинается с 1962 года, когда в журнале «Experientia» была опубликована статья итальянского ученого Ритозза об открытии им явления активации генома (образования так называемых «puff» - утолщений на хромосомах) в клетках эпителия слюнных желез личинки Drosophila busckii при воздействии теплового шока. В дальнейшем появление таких пуфов было обнаружено и при других стрессорных воздействиях (Ritossa, 1962). В 1974 году Тисьёр с соавторами показали, что при тепловом шоке в клетке наблюдается усиление экспрессии особой группы белков, в то время как общий белковый синтез снижается (Tissieres et al., 1974). Среди полипептидов, синтез которых увеличивался наиболее существенно, был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа, названный белком теплового шока 70. Далее были выделены другие сходные по молекулярной массе и строению белки, из которых было сформировано семейство Hsp70 - Hsc70, Grp75 и Grp78.
Важное открытие, которое было сделано в самом начале исследований функции БТШ, основано на многочисленных наблюдений явления так называемой термотолерантности. Предварительно подвергнутые мягкому тепловому шоку клетки в последующем могли переносить более тяжелое термическое повреждение. Термотолерантность прямо пропорционально зависела от степени увеличения синтеза Hsp (Li, Werb, 1982). Было обнаружено, что реакция клетки на многочисленные внешние воздействия различной природы: физические (температура), химические (токсические вещества), биологические (вирусная инфекция) также сопровождается усилением синтеза белков теплового шока. Повышенная устойчивость клеток после воздействия мягкого теплового шока наблюдалась не только к последующему более сильному тепловому воздействию, но и к воздействию такими стрессорами, как этанол, арсенит, тяжелые металлы, гипоксия (Heads, Yellon, Latchman, 1994), свободнорадикальное окисление, вирусная инфекция и др. Этот феномен получил название кросстолерантности. Исследование эффектов теплового шока на фибробласты цыпленка (Kelley, Schlesinger, 1982), кишечную палочку (Yamamori et al., 1978), дрожжи (McAllister, Finkelstein, 1980), растения (Barnett et al., 1980) и другие организмы показали, что такой ответ на стресс, как индукция синтеза белков теплового шока, является универсальным. Кроме того, была доказана высокая консервативность Hsp70 (60-78% гомологии между белками эукариот и 40-60% гомологии между белками прокариот и эукариот). Высокий процент гомологии между Grp75 из митохондрий млекопитающих и прокариотического аналога Hsp70 (Dna К) из клеток Escherichia coli, по мнению многих ученых, подтверждает симбиогенетическую гипотезу происхождения митохондрий. В 1986 году английский исследователь Пэлам предположил, что Hsp70 могут связывать и поддерживать в развернутом состоянии белки с нарушенной конформацией (Pelham, 1986). Затем Эллис, сравнивая многочисленные данные о Hsp со своими наблюдениями, сформулировал концепцию молекулярных шаперонов: «Молекулярные шапероны - класс клеточных белков, функцией которых является обеспечение правильности сворачивания определенной (не собственной) полипептидной цепи и последующей сборки олигомерной структуры» (Ellis, 1987).
На сегодняшний день принята условная классификация белков теплового шока, в основе которой лежит молекулярный вес белков (табл.1), хотя функции представителей разных групп белков теплового шока сопряжены.
Семейство Hsp70 и его функции. Самым распространенным и наиболее хорошо изученным в настоящее время является семейство Hsp70. В одной клетке млекопитающих оно представлено двумя глюкозо-регулируемыми белками - Grp75, Grp78, и двумя цитоплазматическими белками индуцибельным Hsp70 и конститутивным Hsc70. Grp75 - конститутивный белок матрикса митохондрий, который является необходимым элементом транслокационной машины и участвует в транспорте и сборке митохондриальных белков.
Grp78 - конститутивный белок матрикса эндоплазматического ретикулума. Как и Grp75, он участвует в транслокации и сборке различных белков, в частности, молекул иммуноглобулинов.
Hsp70 конститутивно синтезируется у приматов и на крайне низком уровне у других млекопитающих, именно этот белок индуцируется различными стрессовыми факторами. Hsc70 синтезируется конститутивно, и его экспрессия слабо изменяется в ответ на некоторые виды стрессового воздействия.
В клетках человека выявлено 12-14 генов, кодирующих Hsp70 (Tavaria et al., 1996). Показано, что Hsp70 и Hsc70 являются продуктами разных генов (Lindquist, Craig, 1988). Интересной особенностью генов индуцибельных форм Hsp70 является отсутствие интронов (Hunt, Morimoto, 1985), в то время как ген, кодирующий конститутивный Hsc70, содержит 8 интронов (Dworniczak, Murault, 1987). Поэтому нарушение сплайсинга, в частности, при тепловом шоке, блокирует активность большинства генов, но не генов индуцибельных Hsp (Yost, Lindquist, 1991). Повышение температуры подавляет также инициацию и элонгацию трансляции и ведет к разборке имеющихся полисом (Lindquist, 1980). Как только мРНК, кодирующие белки теплового шока, появляются в цитоплазме, полисомы формируются вновь и Hsp70 и некоторые другие БТШ быстро становятся основным продуктом белкового синтеза в клетке (Lindquist, 1980). Степень гомологии между генами, кодирующими Hsp70 и Hsc70, составляет примерно 74%, а гомология на уровне белковых продуктов - 81%. При этом наиболее вариабельным является С-концевой домен молекулы, отвечающий за узнавание и связывание полипептида, а самым консервативным — N-концевой, аденозинтрифосфат-связывающий домен с молекулярной массой 44 кДа (рис.4). Обе части молекулы Hsp70 разделяются короткой последовательностью, в которой находится сайт узнавания белка протеолитическими ферментами (Flaherty et al.. 1990). Сходство аминокислотных последовательностей этих двух белков с прокариотическим аналогом Dna К составляет около 45%, причем 80% гомологии приходятся на N-концевой домен (Buchberger et al., 1994).
Выделение и очистка белков теплового шока семейства 70 кДа.
Генетические изменения клеток прогрессирующих опухолей, которые с одной стороны приводят к неограниченной пролиферации, а с другой - делают клетки более чувствительными к апоптозу, характерны для таких онкогенов, как Мус и Е1А (Green, Evan, 2002; Nilsson, Cleveland, 2003). В этой работе нам удалось показать, что Hsp70, который вовлечен в процесс онкогенеза, подавляет процесс апоптоза, сенсибилизированный онкогеном Мус.
Наши результаты демонстрируют, что повышенная экспрессия Мус делает опухолевые клетки U-937 и RatlMycER более чувствительными к действию противоопухолевых препаратов, таких как адриамицин (ADR), этопозид (ЕТО) и камптотецин (CAMP), эти результаты подтверждают более ранние работы (Hoffman, Liebermann, 1998). Изучая возможную роль шаперона Hsp70 в этом процессе, нам удалось показать, что повышенная экспрессия шаперона подавляет развитие апоптоза, вызванного действием противоопухолевых препаратов в обеих клеточных линиях. Удивительно, но процесс подавления апоптоза в клетках, подвергнутых тепловому прекоыдиционированию, был наиболее выражен клетках обеих линий с высоким содержанием Мус. Более того, нам удалось показать, что при дробном повышении активности Мус в клетках RatlMycER, с одной стороны, и экспрессии Hsp70 - с другой, уменьшение количества апоптозных клеток в ответ на действие ЕТО и CAMP носит дозазависимый характер. На основании этих данных мы сделали вывод о существенном вмешательстве Hsp70 в сигнальные пути апоптоза, сенсибилизированном повышенной экспрессией Мус. Что является мишенями для Hsp70 и Мус в этом процессе? Наши результаты показывают, что в процессе апоптоза в клетках U-937, вызванного действием ЕТО, происходит активация «верхней» каспазы 8 и эффекторной каспазы 9, 3 и 7 и происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий. Активация каспазы 8 происходит независимо от уровня экспрессии Мус и Hsp70, но на нижних ступенях апоптозного сигнального каскада можно заметить существенную разницу, обусловленную повышенной экспрессией Мус и (или) Hsp70. Существенно, что протеолиз каспазы 9 коррелирует с повышенной экспрессией Мус. Специфический ингибитор каспазы 9 не подавлял развитие апоптоза в клетках U-937, однако был эффективен в клетках U-937-v-myc, что подчеркивает селективную роль каспазы 9 в процессе апоптоза, индуцированного ЕТО в клетках с повышенной экспрессией Мус. Анализ кинетики протеолиза каспаз и выхода цитохрома с из митохондрий показал, что в клетках с регулярной экспрессии Мус протеолиз каспаз запускается значительно раньше, чем выход цитохрома с, что говорит о том, что в этих клетках действует прямой путь апоптоза, в то время как в клетках U-937-v-myc более существенную роль играет митохондриальный путь, что соответствует ранее опубликованным работам (Juin et al., 1999).
В литературе не прекращается дискуссия о том, на каких этапах апоптозного каскада шаперон Hsp70 играет наиболее существенную роль. Две группы исследователей (Beere et al., 2000; Saleh et al., 2000) одновременно предположили, что Hsp70 связывает APAF-1, препятствуя его олигомеризации и последующей активации каспазы 9. Другая группа ученых (Li et al., 2000) утверждала, что Hsp70 подавляет апоптоз позднее, чем высвобождение цитохрома с, но до начала протеолиза каспазы 3. С другой стороны, было несколько публикаций о том, что Hsp70 суппрессирует процесс апоптоза на домитохондриальных этапах, (Mosser et al., 2000; Steel et al., 2004; Stankiewitch et al., 2005), прямо или косвенно понижая олигомеризацию или транслокацию белка Вах к митохондрии и поэтому препятствуя выходу цитохрома с, (Gotoh et al., 2004; Stankiewitch et al., 2005). Мы не наблюдали изменения динамики выхода цитохрома с в клетках с повышенной экспрессией Hsp70; напротив, нам удалось показать взаимодействие шаперона и эффекторной каспазы 3 и 7, и таким образом, наши данные подтверждают первую из представленных выше гипотез. Однако нельзя отрицать роль шаперона на более ранних этапах каскада в других клеточных системах при использовании иных индукторов апоптоза.
Мы показали, что процесс апоптоза, вызванный действием
противоопухолевых препаратов и сенсибилизированный Мус, суппрессируется Hsp70. Можно предположить, что селективное фармакогенное подавление синтеза и (или) функции Hsp70 в опухолевых клетках может позволить Мус реализовать свой проапотозный потенциал.
Хотелось бы упомянуть еще две работы, которые не были цитированы ранее. В одной из них авторы устанавливают связь между защитным эффектом Hsp70 и его способностью активировать антиапоптозный фактор c-FLIP и связывать и блокировать активность проапоптозного белка APAF-1; эти процессы приводят к инактивации инициирующей каспазы 8 и 9 и повышению устойчивости нервных клеток к ишемии (гипоксии) (Matsumori et al., 2006). Авторы другой работы исследовали процесс апоптоза, связанный с деполяризацией митохондрий и установили, что при повышении количества Hsp70 в клетках, он, помимо других белков, связывает и инактивирует в цитоплазме фактор инициации апоптоза AIF-1; при этом не наблюдается типичной для апоптоза фрагментации хроматина (Lui, Kong, 2007). Суммируя вышесказанное можно заключить, что шаперон Hsp70 подавляет процесс апоптоза практически на всех этапах каскада.
Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов
Рассматривая механизмы защитной функции Hsp70, мы не коснулись вопроса, зависит ли она от его шаперонной активности. К сожалению данных, о возможной связи между этими свойствами белка, довольно мало. Группа Кампинги установила, что при повышении количества Hsp70 процессы агрегации поврежденных вследствие стресса белков замедляются, и поскольку такая агрегация является причиной гибели клеток, можно утверждать, что уровень апоптоза снижается благодаря эффективности Hsp70 как шаперона (Kampinga, 2006).
Хотелось бы обсудить еще две интересные публикации. В одной из них авторы использовали модель апоптоза, индуцированного метаболическими ингибиторами, что приводило к связанному с белком Вах повреждению митохондриальных мембран, выходу фактора AIF-1 в цитоплазму и его транспорту в ядро и, в конечном счете, развитию процесса апоптоза. С использованием разных делеционных и мутантных конструкций Hsp70 удалось установить, что для инактивации AIF-1 в цитоплазме необходим как весь АТФ-азный домен, так и последовательность четырех последних С-концевых аминокислот, EEVD, хотя последний не имеет значения для остановки транспорта в ядро AIF-1 (Rushalski et al., 2006). Таким образом, для подавления апоптоза необходим весь АТФ-азный домен, то есть наиболее консервативная часть шаперона.
В другой работе, посвященной анализу доменов Hsp70, ответственных за защиту первичных астроцитов от ишемического повреждения, было установлено, что делеции в N-концевой части молекулы белка и, соответственно, способность к фолдингу других полипептидов, не влияют на защитный эффект Hsp70 (Sun et al., 2006). В то же время, авторы показали, что ответственность за защитную активность несет С-концевой домен белка. Противоречия с предыдущей работой (Rushalski et al., 2006) относятся, скорее всего, к разнице в способах определения защитной активности и в самих выбранных конструкциях белка. Несмотря на видимые противоречия, из обсуждаемых данных следует, что обе части шаперона (АТФ- и пептид-связывающая) необходимы для полноправной защитной активности белка Hsp70. Таким образом, шаперонная и защитная активность Hsp70 связаны друг с другом и составляют основную протекторную систему живой клетки.
Из всего вышеописанного может создаться впечатление, что в опухолевых клетках шаперон Hsp70 играет исключительно отрицательную роль, защищая раковую клетку от действия противоопухолевых препаратов. Однако в последние 10-12 лет собрано значительное число данных, подтверждающих возможность выхода белка Hsp70 на поверхность и (или) во внеклеточное пространство и кровоток. Частично эти работы были инспирированы открытием некоторых Hsp, в основном Hsp70, на наружной мембране раковых клеток. Интерес к комплексу шаперона с мембраной неслучаен, поскольку в дальнейшем такие комплексы стали использоваться для создания противоопухолевых вакцин. В начальных экспериментах препараты мембран раковых клеток вводили животным, а затем инъецировали опухолевые клетки. Протокол оказался успешным: отторжение опухоли было зарегистрировано в моделях значительного числа онкопатологий. При анализе препаратов мембран выяснилось, что наиболее значительную роль в достижении терапевтического эффекта играет наличие Hsp70. Для увеличения эффективности иммунотерапии вместо мембран для иммунизации стали использовать препарат Hsp70, выделенного с использованием разных хроматографических сорбентов, за исключением АТФ-агарозы (Blachere et al., 1993; Castelli et al., 2004). Отметим, что применение этого геля позволяет выделить Hsp70 практически без примесей, которые, как выяснилось, являются опухолевыми антигенами, специфичными для данного типа опухоли. Иммунизация животных перед введением им раковых клеток приводила к отторжению опухоли и генерации иммунного ответа. Эти результаты послужили основой для разработки способов иммунотерапии с использованием Hsp70 и других Hsp и регулируемых глюкозой белков, в качестве эффективного адъюванта. Группа под руководством П.Сривастава начала получать препараты Hsp70 и Grp96 непосредственно из опухолей пациентов и иммунизировать их такими препаратами; в результате у больных возникал иммунный ответ к собственным опухолевым антигенам, что блокировало дальнейшее распространение опухоли (Blachere et al., 1993). По крайней мере, для отдельных типов опухолей, таких, как рак почки, методика иммунотерапии с использованием Grp96 признана успешной. В апреле 2008 г она была сертифицирована в РФ компанией Antigenics (США) и, таким образом, стала одной из первых зарегистрированных технологий индивидуальной противоопухолевой терапии (http//www.antigenics.com). Добавим, что только в Американском патентном офисе зарегистрировано более 100 патентов по различным способам получения препаратов Hsp70 для иммунизации онкологических больных, и значительная их часть находится на контроле у FDA - администрации по контролю над продуктами питания и лекарствам при правительстве США.
Другим направлением, формирование которого началось после открытия белка Hsp70 на поверхности раковых клеток, стало исследование поведения клеток, нацеленных на распознавание комплекса шаперона с опухолевыми антигенами. Выяснилось, что для части цитотоксических клеток, натуральных киллеров, мишенью является пептид Hsp70 длиной 14 аминокислот и расположенный в мембране раковой клетки (Gastpar et al., 2004). На 1-й фазе клинических испытаний этот пептид показал свою эффективность в применении к пациентам с раком кишечника или легких (Krause et al., 2004). Считается установленным, что ответ на комплекс Hsp70 с опухолевыми антигенами, экспонированный на поверхности раковых клеток, может также обеспечиваться цитотоксическими лимфоцитами. Подтверждений этому в литературе много: есть работы, указывающие на участие CD 8 -лимфоцитов в ответе организма, спровоцированном препаратами, обогащенными Hsp70 и другими Hsp.
Похожие диссертации на Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов
