Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Морфофункциональные аспекты стрессорного и ишемического повреждения миокарда и пути совершенствования фармакокоррекции (Обзор литературы)- 10
1.1. Влияние стресса и ишемии на сердечно-сосудистую систему 10
1.2. Ультраструктура миокарда в норме и патологии 15
1.2.1. Ультраструктура миокарда интактных животных 15
1.2.2. Морфология миокарда при патологических состояниях 18
1.2.3. Ультраструктура миокарда при воздействии стресса 20
1.2.4. Влияние кардиотропных средств на ультраструктуру миокарда 31
1.3. Оксид азота в сердце животных и человека 33
1.3.1. Общая характеристика нитрооксидсинтазы 33
1.3.2. Роль оксида азота в сердце животных и человека в норме и при патологических состояниях 37
1.4. Фармакологическая коррекция стрессорного повреждения миокарда—41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Характеристика подопытных животных 51
2.2. Метод моделирования хронического иммобилизационного стресса и изучения стресспротекторного действия 52
2.3. Характеристика лекарственных препаратов 52
2.4. Электронно-микроскопическое исследование миокарда— 54
2.5. Иммуногистохимическое исследование экспрессии eNOS
и iNOS в миокарде 55
ч.
2.6. Методы исследования кардиофармакологических свойств испытуемых препаратов - 56
2.7. Методы исследования механизмов кардиотропного действия испытуемых фармакологических препаратов 61
2.8. Статистическая обработка результатов, морфометрия 62
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Исследование острой токсичности испытуемых соединений 65
3.2. Исследование фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении 69
3.3. Морфологические изменения миокарда белых мышей при длительном применении метаболических средств в условиях хронического стресса 74
3.3.1. Исследование ультраструктуры миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса 77
3.3.2. Ультраструктура миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения неотона 84
3.3.3. Ультраструктура миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения димефосфона 94
3.3.4. Ультраструктура миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения мексидола 102
3.4. Исследование антиишемических свойств исследуемых соединений—114
3.5. Исследование некоторых механизмов кардиотропного действия мексидола, димефосфона и неотона 135
3.6. Исследование экспрессии eNOS и iNOS в миокарде 142
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 152
Выводы 178
Практические рекомендации - 181
Список сокращений и условных обозначений
- Ультраструктура миокарда интактных животных
- Метод моделирования хронического иммобилизационного стресса и изучения стресспротекторного действия
- Исследование фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении
- Ультраструктура миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения мексидола
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие в связи с сохранением высоких показателей заболеваемости ишемической болезнью сердца во всем мире поддерживается интерес к изучению патогенеза повреждения миокарда (Драпкина О. М. и др., 2000; Арзамасцев А.П. и др., 2003; Сапрунова В.Б., 2003; Голиков П.П., 2004; Марков Х.М., 2005; Мартынов А.И. и др., 2005; Благонравов М.Л., 2007; Barton С.Н., 2001; Barouch L.A..et al., 2002; Bian К., Murad F., 2003;). Учитывая, что последствия ишемии определяются не только гемодинамическими изменениями, но и тканевыми повреждениями, в современной клинической практике все большее значение придают миокардиальной цитопротекции (Голиков А.П., 2003; Лукьянова Л.Д , 2004; Смирнов Л.Д., 2005; Семенкова Г.Г., Кокорева Л.В., 2007).
Особое внимание в настоящее время уделяется изучению морфофункциональных изменений тканевых, клеточных и субклеточных компонентов миокарда, осуществляющих структурно-метаболические, адаптационные и регенераторные процессы в сердце, а также обеспечивающие эффективное функционирование сердечно-сосудистой системы (Евсевьева М.Е., 2000; Непомнящих Л.М., 2001; Павлович Е.Р., 2001; Тверская М.С. и др., 2004; Лушникова и др. 2005; Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д., 2006;). Одним' из важных направлений исследования морфофункциональной организации сердца явилось открытие комплекса сигнальных молекул, обеспечивающих тригеррные функции органов и систем организма, одной из них является оксид азота (Охотин В.Е., Шуклин А.В., 2006; Bian К. et al., 2003; Godecke A., Schrader J., 2004). Эндогенный оксид азота проявляет свойства вазодилятатора (Ванин А.Ф., 1998; Champion H.C.et al., 2004;). Именно нарушение продукции эндотелиальными клетками оксида азота рассматривается как один из факторов в патогенезе ишемических и стрессорных повреждений миокарда, приводящих к дисфункции сосудистого эндотелия (Марков Х.М., 2005; Мартынов А.И. и др.,2005; Ребров А.П. и др., 2005; Бокерия Л.А. и др. 2006).
Большое значение при изучении морфофункциональных изменений сердечно-сосудистой системы и компенсаторных реакций в условиях патологии имеют исследования влияния целого ряда лекарственных средств на восстановление структурно-метаболических параметров и поддержание
эффективной деятельности сердца (Северина И.С., 2002; Голиков П.П., 2004; Сернов Л.Н и соавт., 2004; Гейченко В.П. др., 2005; Бульон В.В. и др., 2007; Ismailoglu U.B. et. al., 2001). В распоряжении клиницистов имеется большой арсенал лекарственных средств, позволяющий достаточно успешно бороться с последствиями стрессорного и ишемического повреждения миокарда. Однако механизм действия большинства препаратов основан на снижении потребности миокарда в кислороде, что, как правило, достигается угнетением его сократимости и может способствовать развитию сердечной недостаточности. Что касается современных стресспротекторов (седативные препараты, транквилизаторы, Р-адреноблокаторы и др.), то по своей природе они являются средствами дезадаптационной природы: снижают остроту восприятия ситуации, угнетают психо-моторные функции организма, уменьшают реактивность сердечно-сосудистой и других систем организма. В связи с этим большой интерес представляет появившаяся в последнее время группа лекарственных средств, получившая название «препараты метаболического типа действия». К ним относят такие средства как димефосфон, мексидол, креатинфосфат, кудесан и другие. Они обладают широким спектром биологической активности, в том числе проявляют кардиотропные свойства (Меерсон Ф.З. и др.., 1989; Ончинников В.Д., 1989; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 1989; Сернов Л.Н., Смирнов Л.Д., 1996; Рябинин В А. и др., 1996). Однако реализуются ли эти кардиотропные свойства на морфологическом уровне, а также имеются ли у них другие фармакодинамические аспекты на сегодняшний день остается достаточно серьезной неисследованной проблемой медицины. Учитывая актуальность проблемы и необходимость ее дальнейшего изучения, нами было предпринято данное исследование.
Цель работы: изучение морфофункциональных изменений миокарда при экспериментальной патологии (стрессорном и ишемическом повреждении миокарда) и анализ возможностей коррегирующего влияния препаратов метаболического типа действия на структурную организацию мышечных и сосудистых компонентов сердца.
Задачи исследования.
1. Изучить изменения морфологии миокарда и нарушения функции левого желудочка мышей при различной экспериментальной патологии (стрессорном и ишемическом повреждении миокарда).
Исследовать особенности ультраструктурных изменений сердечной мышечной ткани и сосудов микроциркуляторного русла при экспериментальной терапии мексидолом, неотоном и димефосфоном в условиях хронического иммобилизационного стресса.
Изучить фармакотоксикологические свойства мексидола, неотона и димефосфона при длительном применении в условиях хронического стресса.
4. Изучить кардиопротекторное действие мексидола, неотона и
димефосфона при экспериментальном ишемическом повреждении миокарда.
5. Оценить участие ферментов семейства NO-синтаз и их
морфофункциональные проявления, а также медиаторов симпатоадреналовой
системы в реализации стрессорного повреждения миокарда.
6. Оценить влияние препаратов метаболического типа действия на
состояние NO-синтазной системы и на участие симпатоадреналовой системы
в реализации их стресс-протекторного эффекта.
Научная новизна исследования.
В результате проведенных исследований впервые установлено, что при длительном применении препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса наблюдаются компенсаторно-адаптационные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов, ведущие к поддержанию эффективности морфофункционального состояния миокарда. Установлено, что применение неотона, мексидола, димефосфона в условиях хронического стресса, умеренно коррегирует стрессорные изменения ультраструктуры миокарда, уменьшая зоны пересокращения миофибрилл, их деструкцию, участки внутриклеточного и интерстициального отека и количество измененных митохондрий с конденсированным матриксом, спазмированных сосудов.
Изучено кардиопротекторное действие мексидола, неотона и димефосфона при экспериментальном ишемическом и стрессорном повреждении миокарда. Выявлено, что выраженность противоишемического эффекта всех изучаемых препаратов примерно равнозначна. Установлено, что изучаемые препараты не оказывают влияния на смертность подопытных животных в условиях хронического экспериментального стресса и являются безопасными при длительном применении.
Препараты неотон, мексидол, димефосфон способны коррегировать стрессорные повреждения миокарда, влияя на экспрессию конститутивной
эндотелиальной изоформы NO-синтазы в эндотелии кровеносных сосудов, что компенсирует эндотелиальную дисфункцию в условиях хронического стресса, и индуцибельной изоформы в кардиомиоцитах что, приводит к снижению токсического эффекта оксида азота. Выявлено, что неотон, мексидол и димефосфон коррегируют содержание оксида азота в миокарде мышей в условиях хронического иммобилизационного стресса.
Показано, что неотон, мексидол способны предотвращать стрессорные повреждения миокарда, влияя на концентрацию медиаторов симпатоадреналовой системы.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные результаты подтверждают целесообразность
использования данной модели стресса для изучения хронической токсичности кардиотропных средств при их доклинических испытаниях и изучения влияния препаратов метаболического типа на коррекцию стрессорных изменений в миокарде. Полученные данные о морфологических изменениях миокарда на фоне хронического иммобилизационного стресса и участии в этом процессе NO-синтазной системы должны учитываться в клинике ишемических и стрессорных поражений сердца, а также при изучении молекулярных основ компенсаторно-приспособительных процессов в эксперименте. Полученные результаты углубляют знания о механизмах кардиопротекторных эффектов препаратов метаболического типа действия (неотона, мексидола, димефосфона). По материалам диссертации получено удостоверение на рационализаторское предложение (2007г). Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии Мордовского государственного университета, кафедры фармакологии и служат обоснованием для продолжения исследования кардиотропных эффектов препаратов метаболического типа действия в условиях стресса.
Положения, выносимые на защиту
1. Длительное применение препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса не сопровождается негативными изменениями морфофункционального состояния миокарда. Изменения микроскопических и субмикроскопических структур миокарда можно
рассматривать как компенсаторно-адаптационные, ведущие к поддержанию эффективности морфофункционального состояния миокарда.
2. Неотон, димефосфон и мексидол способны эффективно
ограничивать альтеративные процессы в миокарде при моделировании
экспериментального инфаркта. Выраженность противоишемического
эффекта всех препаратов примерно равнозначна и соответствует эффекту
пропранолола.
3. Препараты метаболического типа действия способны коррегировать
стрессорные повреждения миокарда на уровне NO-синтазной и
симпатоадреналовой систем.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены: на IV научной конференции молодых ученых МГУ им. Н.П. Огарева (Саранск, 1999); научной конференции МГУ им. Н.П. Огарева «Клинико-экспериментальные аспекты современной медицины» (Саранск, 1999); межрегиональной научной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции "Экология, здоровье и природопользование" (Саратов, 2000); на III международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2002); на I Всероссийского конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002); на научной конференции МГУ им. Н.П. Огарева «XXXI Огаревские чтения» (Саранск, 2003); на II Всероссийского конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003); на VI Международном славянском конгрессе по электростимуляции и клинической электрофизиологии сердца (Санкт-Петербург, 2004); на научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2005); 4-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти Я.В.Костина «Общество, здоровье, лекарство» (Саранск, 2005); IV национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005); на 2-ой Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания
современного человека» (Ульяновск, 2005); на 11 научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2006); на Всероссийской научно-практической конференции «Неотложные состояния при сердечно-сосудистых заболеваниях» (Москва, 2006); на V Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2006); на научно-практической международной конференции «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» (Белгород, 2006); на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); на XXXV научной конференции «Огаревские чтения» медицинского факультета Мордовского госуниверситета «медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2006); на 6-й Всероссийской научной конференции, «Ретиноиды (Орел, 2007); на конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии к 100-летию со дня рождения основателя кафедры анатомии человека, профессора И.С. Кудрина (Санкт-Петербург, 2006); на XII международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007); 5-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2007); XII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им Н.П. Огарева (Саранск, 2007). Публикации
По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 10 научных работ в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК и 1 монография, получено удостоверение на рационализаторское предложение (2007г). Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов,
выводов, списка литературы, включающего 332 источника (184
отечественных авторов; 148 - зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 74 рисунками, из них 49 микрофотографий и 14 таблицами.
Ультраструктура миокарда интактных животных
Сократительные кардиомиоциты стенок желудочков, межжелудочковой перегородки представляют собой вытянутые, плотно упакованные клетки, которые сгруппированы в мышечные волокна. Характерным признаком этих типичных миокардиальных клеток является продольное расположение всех основных органелл, включая миофибриллы, часто имеющие разветвленную форму, митохондрии, преимущественно образующие цепочки в пространстве между пучками миофибрилл, и ядра. Близко расположенные части клеток - в основном их торцевые части -имеют множество соединений, образующих вместе вставочные диски (Шаров В.Г., 1988; Форбс М.С., Сперелакис Н., 1990).
Миофибриллы - пучки нитей сократительных белков - являются основными внутриклеточными органеллами. Миофибриллы состоят из чередующихся анизотропных (А) и изотропных (I) дисков. А-диски, составляющие в миокарде 2/3 длины миофибрилл, образованы миозиновыми нитями, а 1-диски состоят из актиновых нитей (Хем А., Кормак Д., 1983; Шаров В.Г., 1988; Непомнящих Л.М., 1998; Ferrans V.J., Roberts W.C., 1973; SommerJ.R., Johnson E.A., 1979).
Несколько реже, чем миофибриллы, встречаются митохондрии, расположенные правильными рядами в межмиофибриллярном пространстве и образующие беспорядочные скопления в субсарколеммаль-ном и околоядерном пространстве (Хем А., Кормак Д., 1983; Фролов В.А., Пухлянко В.П., 1989). Митохондрии содержат плотно упакованные ровные ряды крист и снаружи ограничены двойной мембраной (Фролов В.А., Пухлянко В.П., 1989; Matlib М.А. et al, 1981).
Электронно-микроскопическая томография определила новые черты строения митохондрий. Стандартная модель структуры крист оказалась неточной. В зависимости от источника и конформационного состояния структура крист может варьировать от простых трубчатых образований до сложных ламеллярных структур, прикрепленных к границе внутренней мембраны через трубчатые структуры диаметром 28 нм (Frey T.G., Mannella С.А. 2000). В миокарде преобладают митохондрии овальной или округлой формы. Кристы имеются в большом количестве, плотно упакованы и располагаются перпендикулярно длинной оси митохондрий. Длина органелл варьирует от 1 до 4,8 мкм, а толщина - от 0,8 до 2,7 мкм (Лифантьев В.И. и др., 1987).
Митохондрии играют важную роль в запрограммированной клеточной гибели (Bernardi P. et al., 1999; Wojtczak J.A., Sheu S.S., 1999; Skulachev B.P., 2000), в процессе старения (Litoshenko А., 2000). При старении происходят морфологические и функциональные изменения митохондрий в результате экспрессии специфических ферментов в этих органеллах, действия на геном митохондрий свободных радикалов кислорода, фрагментации митохондриальной ДНК и точечных мутаций последней (Takayuki О., 1997; Thorsten J., 1999). В кардиомиоцитах желудочков хорошо развиты две основные мембранные системы: а - поперечные (Т) и продольные тубулы, образующие вместе продольно-поперечную тубулярную систему; б - сарко-плазматический ретикулум (СПР), являющийся резервуаром внутриклеточного Са2+ (Шаров В.Г., 1988; Choi H.S. et al., 1999; Eisher D.A. et al., 1999). Канальцы Т-системы, образованные трубчатыми инвагинациями сарколеммы, локализуются на уровне Z-линий. В непосредственном контакте с ними, формируя диады и триады, находятся цистерны агра-нулярной саркоплазматической сети. Кроме ее поперечных элементов, входящих в состав диад и триад, в сердечных миоцитах имеются ее продольные канальцы (Forbes M.S., 1985). Небольшие цистерны гранулярной саркоплазматической сети встречаются обычно в околоядерной зоне. Здесь же располагаются скопления митохондрий, единичные лизосомы и элементы пластинчатого комплекса.
Миокардиальные клетки желудочков часто имеют два и более ядер. Ядра содержат, в основном, диспергированный хроматин, на его фоне хорошо видна петлистая нуклеолемма. С каждым полюсом ядра связана некоторая конусообразная область миоплазмы, в которой выявляются пузырьки пластинчатого комплекса, центриоли, митохондрии, шероховатый и гладкий эндоплазматический (саркоплазматический) ретикулум и множество лизосом, включая лизосомы с гранулами липофусцина (Шаров В.Г, 1988).
Наряду с органеллами в саркоплазме кардиомиоцитов обнаруживается ряд включений: гранулы гликогена, редкие липидные капли. Частицы липофусцина часто выявляются в миоплазме вблизи полюсов ядер. Саркоплазма ограничена плазматической мембраной, которая снаружи покрыта умеренно осмиофильным рыхлым слоем - базальной мембраной.
Метод моделирования хронического иммобилизационного стресса и изучения стресспротекторного действия
Для изучения стресс-протекторной активности метаболических средств нами была использована модель 25%-ного иммобилизационного стресса по И.А. Коломейцевой (1988), предложенная В.П. Балашовым и соавт. в 2002 году для оценки безопасности потенциальных противоаритмических средств как наиболее простой, дешевый и адекватный метод. Иммобилизационный стресс воспроизводили ежедневным помещением животных в тесные пеналы объемом 42 см , ограничивающие подвижность животных. Длительность иммобилизации составляла 6 часов (25%) в течение 30 дней. Исследуемые соединения вводили ежедневно однократно внутрибрюшинно до стресса в объеме 0,2 мл на инъекцию в эффективных дозах. Животные были разделены на пять групп: 1- интактные мыши (контроль); 2 - животные, подвергнутые хронической иммобилизации; 3 - животные, подвергнутые хронической иммобилизации и получающие мексидол (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, 30 суток, б раз в неделю), 4 - те же условия + неотон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю), 5 - те же условия + димефосфон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю). В контрольной серии опытов животные получали 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида в качестве плацебо. Все растворы и инструменты подвергались стерилизации.
Как наиболее показательный интегральный критерий стресса мы использовали показатель летальности животных. Учет летальности животных проводили ежедневно. На 30 сутки животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом.
Димефосфон - диметиловый эфир 1.1 - диметил - 3 оксобутилфосфоновой кислоты: о Бесцветная прозрачная жидкость, легко растворима в воде.
Оригинальный отечественный препарат. Ампулы по 1 мл (1 г в 1 мл), Производитель - Казанский фармацевтического завода бактероидных препаратов (Россия). Препарат оказывает антиацидотическое действие. От других антиацидотических средств отличается тем, что его действие связано не с нейтрализацией избытка кислородных соединений, а с активацией метаболических механизмов регуляции кислотно-основного состояния организма. ,NK \ Фосфокреатин - 1-(2-гидроксиэтил) фосфатилгуанидин гидроген-фосфат: НО О Синонимы: креатинфосфат, креатинолфосфат, неотон.
Фосфокреатин играет важную роль в обеспечении энергетических процессов сократительной деятельности мускулатуры.
Неотон - лиофилизированный порошок во флаконах по 1 г с приложением ампул растворителей. Производитель Альфа Вассерман С.п.а., Италия.
Белый кристаллический порошок, легко растворим в воде. По химической структуре мексидол является соответствующей эмоксипину солью янтарной кислоты (сукцинатом). Мексидол является ингибитором свободнорадикальных процессов (антиоксидантом). Производитель ООО МЦ «Эллара», Владимирская область (Россия), ампулы по 2 мл 5% раствора (50 мг в 1 мл).
Для электронно-микроскопического исследования миокарда левого желудочка проводили проводку и заливку материала по традиционному методу. Кусочки ткани фиксировали в 3% глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 12 часов при 4 С. После промывки 0,15 М фосфатным буфером (3 смены) проводили постфиксацию 2% растворе осмиевой кислоты в течение 2 часов при 4 С, далее кусочки проводили через батарею спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50, 70, 96, -1 смена по 30 минут при 4 С и 100 - 3 смены по 30 минут при 18 С) и окиси пропилена. Перед заливкой производили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в отношении 1:1 в течение 3 часов, далее кусочки помещали в заливочную смесь эпоксидных смол на 30 минут при 60С. Заливку осуществляли с использованием смеси эпоксидных смол ЭПОН-АРАЛДИТ (Mollenchauer., 1964) с последующей полимеризацией в течение 2- суток при 60С, ультратонкие срезы получали на микротоме, монтировали, их на сетки и бленды, контрастировали уранилацетатом (5% раствор на метиловом спирте), цитратом свинца (Reynolds., 1963, Venable J.; Coggeshal R., 1965), препараты изучали на электронном микроскопе ЭМ-125 при ускоряющем напряжении 75 кВ.
Исследование фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении
В нашем исследовании наблюдение за динамикой смертности белых мышей проводилось в течение 30 дней. Впервые работа с использованием такого методического подхода (в условиях 25% стресса) была выполнена Шевораковой Т.И. (2000). Автор показала увеличение смертности мышей и нарушение адренергической иннервации миокарда при длительном применении некоторых антиаритмических препаратов. Основываясь на результатах этой работы и работ других сотрудников кафедры гистологии Мордовского госуниверситета, для изучения стресспротекторных свойств препаратов метаболического типа мы выбрали модель 25% иммобилизационного стресса (Шувалова Е.Н. 2003.; Балашов В.П. и др, 2004.)
На первом этапе исследования мы оценили, каким образом изменяется смертность животных, находящихся в условиях стандартной двигательной активности, при длительном внутрибрюшинном введении плацебо. Эта контрольная серия опытов ("интактный контроль") выполнена на 45 мышах. Им вводили 0,9 % раствор хлорида натрия. Было показано, что введение подопытным животным плацебо на протяжении 30 суток не сопровождалось их гибелью. Полученные результаты свидетельствуют о нормальном состоянии популяции мышей, использованной для проведения экспериментов. Животные являются здоровыми, не склонными к спонтанной гибели по возрастным или инфекционным причинам. Это позволяет надежно оценить влияние длительного применения препаратов метаболического типа действия на смертность мышей в последующих сериях опытов.
Во второй серии экспериментов животных подвергали ежедневному шестичасовому иммобилизационному стрессу на протяжении 30 суток. Стресс моделировали, помещая животных в тесные пеналы, ограничивающие их подвижность (Коломейцева И. А., 1988). В этой серии опытов к концу периода наблюдения из 45 животных, включенных в эксперимент, погибло 13, что составляет 29 %. Можно сделать вывод о том, что избранные продолжительность и интенсивность стресса, оказываются достаточными для того, чтобы вызвать гибель небольшого числа подопытных животных. Учитывая данные других авторов (Шеворакова Т.И., 2000; Бирлюкова Д.В., 2002), можно признать модель стресса достаточно удобной для решения поставленных в работе задач. На фоне небольшой смертности животных в контроле можно зарегистрировать действие и стресспротекторов - снижающих данный показатель, и действие веществ усугубляющих негативное действие стресса. В работах выше цитированных авторов последний эффект препаратов называют «летальногенным» эффектом.
В следующих сериях опытов, в условиях экспериментального стресса, было изучено влияние мексидола, неотона и димефосфона на смертность животных. Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно, однократно и ежедневно в объеме 0,2 мл на инъекцию в течение 30 суток в дозах, указанных в разделе 2.1. Все растворы и инструментарий были подвергнуты стерилизации. Данные о летальности животных в эксперименте представлены в таблице 3.2.
Общим свойством всех исследуемых препаратов явилась их не способность повышать выживаемость животных. Показатели летальности в группе стресс-контроля и в опытных группах оказались очень близкими. Однако важным является тот факт, что смертность животных при длительной терапии препаратами метаболического типа действия не увеличивалась, что является свидетельством отсутствия у них летальногенных свойств и, следовательно, свидетельством высокой безопасности. Особенно очевидным последнее обстоятельство становится при сравнении полученных нами данных с эффектом этацизина и некоторых других антиаритмиков I класса, о негативном действии которых говорят данные литературы (Балашов В.П. и др., 2002; Шувалова Е.Н. 2003).
Первый летальный исход (1 мышь) у животных стресс-контроля был зарегистрирован на 4 сутки. Далее, при единичной смертности в другие дни, пики летальности пришлись на 7 сутки (3 мыши), на 21 день (3 мыши) и 28 сутки (4 мыши). Динамика летальности животных при хронической иммобилизации представлена на рисунках 3.2, 3.3, 3.4.
В серии опытов, на фоне длительного введения мышам мексидола (20,0 мг/кг), первый летальный исход был зарегистрирован на 3 сутки (1 мышь). Далее пики пришлись на 7 сутки (3 мыши), на 20 день (3 мыши), 27 сутки (3 мыши). Динамика летальности животных при хронической иммобилизации и длительном применении мексидола представлена на рисунке 3.2.
Ультраструктура миокарда в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения мексидола
У животных, подвергнутых хроническому стрессу, отмечался полиморфизм ультраструктуры миокарда, наряду с участками миокарда, имеющими нормальное строение мы наблюдали и существенные морфологические изменения желудочковых кардиомиоцитов. Наши данные согласуются с данными литературы (Непомнящих Л.М., 1998; Павлович Е.Р.,1991) и описаниями морфологических изменений при воздействии хронического стресса и ишемии миокарда в других работах, выполненных на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (Шувалова Е.Н.,2003; Ивочкина И.Л., 2005). Изменения тонкой структуры мышечной оболочки встречались мозаично. Оболочки отдельных кардиомиоцитов выглядели размытыми, в них отмечалось неоднородность электронной плотности сарколеммы. Отмечался более электронноплотный матрикс органелл. В гиалоплазме отмечались гранулярные и филаментные образования. В кардиомйоцитах обнаруживался умеренный внутриклеточный отек, чаще наблюдающийся в периферических отделах клеток в субсарколеммальном пространстве. ; Встречались кардиомиоциты с крупными ядрами, в некоторых случаях ядерные оболочки образовывали складки, инвагинации, выпячивания, контуры ядер становились более извилисты (Рис 3.8). Количество гетерохроматина существенно увеличивалось, и его скопления концентрировались по периферии ядра, что может косвенно свидетельствовать о полиплоидности ядер, типичной для кардиомиоцитов. Однако значительная часть нуклеоплазмы содержала эухроматин, что характерно для клеток с высокой синтетической активностью.
Отмечалось и нарушение структуры вставочных дисков: их расхождение, дезорганизация с нарушением чередования специализированных контактов (Рис. 3.9).
Фрагмент кардиомиоцита мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Атипичное ядро с большим количеством инвагинаций. Обозначения: Мх - митохондрии, Мф - миофибриллы, Я - ядро (х 24000).
Спазмированный сосуд в миокарде мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Выраженный интерстициальный отек. Дезорганизация вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов. Обозначения: КС - кровеносный сосуд, ИО - интерстициальный отек, ВД - вставочный диск (х 26000).
Скопление митохондрии с уплотненным матриксом под сарколеммой в кардиомиоците мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Контрактуры миофибрилл II степени. Разволокнение миофибрилл (стрелки). Обозначения: Мф - миофибриллы, Мх - митохондрии, Сл -сарколемма (х 19000).
Гигантская митохондрия с просветленным матриксом разрушенными кристами в кардиомиоците мыши в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф - миофибриллы, Мх-митохондрия (х 24000). Изменения со стороны энергетического аппарата были достаточно значительными. В кардиомиоцитах отмечалось наличие двух видов митохондрий: «светлые» со структурными кристами и «темные» с конденсированным матриксом, причем количество последних преобладает, что может свидетельствовать о нарушении энергетических процессов в клетках. В зоне деструкции крист обнаруживались точечные зоны просветления. В некоторых органеллах наружная митохондриальная мембрана теряет двухконтурность и становится нечеткой. Особенностью является локализация деструктивных изменений мембран митохондрий в зоне внутриклеточного отека. Кроме того, наблюдался «феномен» скопления митохондрий под сарколеммой (Рис 3.10), что может свидетельствовать о адаптационно-компенсаторном ответе энергетических структур кардиомиоцитов на длительное стрессорное воздействие. Иногда встречались гиганские митохондрии с просветленным матриксом и деформированными кристами (Рис.3.11).
Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени) в кардиомиоците мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Разволокнение миофибрилл (стрелки). Митохондрии с уплотненным матриксом. Обозначения: Мф - миофибриллы, Мх - митохондрии (х 22000). Таким образом, обнаруженные изменения наружной и внутренней мембран митохондрий свидетельствуют о влиянии иммобилизационного стресса на мембранные структуры кардиомиоцитов.
Миофибриллярные структуры кардиомиоцитов характеризовались также значительной гетерогенностью. Наряду с нормальным строением у животных, подвергнутых хронической иммобилизации, отмечались характерные участки пересокращения мышечных волокон. Выявлялось пересокращение миофифибрилл от незначительного изменения размеров Н-полос и 1-дисков (контрактуры I степени) до существенного пересокращения - (контрактуры III степени) по Непомнящих (1991). Чаще выявлялись контрактуры II степени (Рис. 3.12). Причем отмечается некоторая мозаичность контрактур, так в одних клетках все пучки миофибрилл выглядели «пересокращенными», тогда как в других только отдельные пучки миофибрилл были изменены. Встречались также участки разрыхления и разволокнения миофибрилл (Рис. 3.12), что было выражено сильнее в периферических участках кардиомиоцитов в зоне внутриклеточного отека, а также в миофибриллах, находящихся в состоянии контрактур II- III степени. Саркомеры в участках около «пересокращений» имели фрагментированые телофрагмы. В миокарде встречались расширенные терминальные цистерны эндоплазматического ретикулума.
