Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Сперматогенез у млекопитающих животных. Особенности дифференцировки клеток семенника (на примере крыс) 10
1.2. Действие повреждающих факторов на мужские половые клетки и гонады млекопитающих животных 23
1.2.1. Экспериментальные и клинические исследования гонадо- и гаметотоксического эффекта противоопухолевых препаратов 23
1.2.2. Гонадо- и гаметотоксическое действие ионизирующей радиации 33
1.3. Подходы к коррекции деструктивных процессов в сперматогенном эпителии и половых клетках, вызванных действием антибиотиков и ионизирующей радиацией 39
1.3.1. Антибиотики группы антрациклинов (доксорубицин): механизм действия и выявленная токсичность. Возможность снижения токсичности противоопухолевых препаратов 39
1.3.2. НИЛИ: особенности действия на биологическую ткань и возможность использования в качестве способа защиты сперматогенеза от повреждений, вызванных ионизирующей радиацией 45
2. Материалы и методы 50
2.1. Схемы экспериментов по введению крысам препаратов цитостатического ряда 50
2.1.1. Получение наносомальной лекарственной формы доксорубицина 50
2.1.2. Токсикологическое исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему млекопитающих 50
2.1.3. Схема эксперимента по изучению наносомальной лекарственной формы доксорубицина на репродуктивную систему крыс с интракраниально перевитой глиомой С6 51
2.2. Схема экспериментов по изучению воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенный эпителий до процедуры общего ионизирующего облучения ... 52
2.3. Гистологическая обработка материала
2.4. Количественные методы анализа семенников крыс всех экспериментальных групп
2.5. Статистическая обработка результатов 55
3. Результаты собственных исследований 56
3.1. Исследование эффекта воздействия антрациклиновых антибиотиков (доксорубицин) на популяцию мужских половых клеток половозрелых крыс 56
3.1.1. Изучение влияния наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий половозрелых крыс 56
3.1.2. Влияние наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий в процессе химиотерапии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6 75
3.2. Морфофункциональная характеристика ткани семенника при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением крыс 85
4. Обсуждение полученных результатов 94
4.1. Действие доксорубицина и его лекарственных модификаций на интерстициальную ткань и половые клетки 94
4.2. Действие НИЛИ как радиопротектора на половые клетки половозрелых крыс 98
5. Заключение 102
Выводы 103
Литература 105
- Экспериментальные и клинические исследования гонадо- и гаметотоксического эффекта противоопухолевых препаратов
- Антибиотики группы антрациклинов (доксорубицин): механизм действия и выявленная токсичность. Возможность снижения токсичности противоопухолевых препаратов
- Схема экспериментов по изучению воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенный эпителий до процедуры общего ионизирующего облучения
- Влияние наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий в процессе химиотерапии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6
Введение к работе
Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме млекопитающих животных и человека, связанных с клеточной пролиферацией и дифференцировкой. Он протекает под контролем специфических генов и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов и факторов роста. Исследователи занимаются проблемой защиты и сохранения половых клеток от негативных влияний различных факторов в силу уникальной роли половых клеток в онтогенезе и в связи с необходимостью развития профилактических мер, направленных на сохранение здоровья потомства. Так, например, основная практическая задача, стоящая перед радиобиологией: выяснение не только механизмов влияния повреждающего фактора (ионизирующей радиации), но и поиск способов предотвращения или ослабления побочных эффектов с помощью природных или искусственных радиопротекторов [Круглова, Карнаухов, 2001]. Разрабатываются новые средства защиты биологических систем от различных типов воздействий и видов излучений при острых и отдаленных последствиях облучения.
Основная задача лекарственного лечения опухолей -разработка способов увеличения эффективности действия противоопухолевых средств и ослабления их побочного повреждающего воздействия. Продолжается поиск лекарственных средств, обладающих большей эффективностью поражать опухолевые клетки, не повреждая при этом здоровые органы и ткани (в том числе репродуктивную систему). Задача сохранения репродуктивного здоровья особенно актуальна для детской онкологии. За последние годы детские онкологи добились значительных успехов относительно онкологических заболеваний, которые раньше считались
неизлечимыми. Правильное лечение приводит к выздоровлению ребенка. В настоящее время в мире живут многие тысячи людей, излеченных от онкологических заболеваний в детстве. Однако эти успехи достигаются за счет применения лекарственных препаратов, оказывающих значительное токсическое действие на центральную нервную систему, сердце, печень, почки, иммунную систему, костный мозг и репродуктивную систему. В связи с этим задача снижения побочных эффектов при химиотерапевтическом лечении и лучевой терапии является приоритетной для современной онкологии.
Исходя из вышесказанного возникла необходимость поиска методов защиты половых клеток от:
1) побочного токсического действия противоопухолевых препаратов цитостатического ряда, применяемых при химиотерапии злокачественных новообразований, с помощью химической модификации антибиотика (заключение в наночастицы с дальнейшей обработкой их поверхностно-активными веществами)
2) лучевого поражения с помощью профилактического действия низкоинтенсивного лазерного излучения;
Цель работы: провести морфологическое исследование ткани семенника в условиях применения новой наносомальной лекарственной формы доксорубицина и низкоинтенсивного лазерного излучения как радиопротектора.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
- Установить характер повреждений сперматогенного эпителия при действии доксорубицина и его наносомальной
лекарственной формы на дифференцирующиеся клетки сперматогенного эпителия и интерстициальную ткань.
- Сопоставить характер повреждений дифференцирующихся половых клеток и интерстициальной ткани после введения доксорубицина и его модификаций на разных сроках эксперимента.
- Изучить воздействие наносомальной лекарственной формы доксорубицина на половые клетки крыс с интракраниально перевитой глиомой Сб. Сопоставить полученные результаты с состоянием сперматогенного эпителия крыс без глиомы.
- Определить эффект действия низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого до общего радиационного облучения, на процесс сперматогенеза и интерстициальную ткань половозрелых крыс.
Научная новизна
Проведенное комплексное морфологическое исследование семенников крыс с помощью методов световой микроскопии, количественного анализа сперматогенеза и морфометрической оценки состояния тканевых компонентов семенника позволило получить новые данные о характере изменений в семенниках крыс, возникающих в условиях применения новых наносомальных лекарственных форм доксорубицина.
Впервые показан защитный эффект низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого до общего радиационного облучения, на дифференцирующиеся мужские половые клетки и состояние интерстициальной ткани.
Практическая значимость работы
Результаты, полученные в ходе настоящей работы, углубляют и расширяют существующие представления о повреждающем действии антибиотиков антрациклинового ряда на клетки сперматогенного эпителия крыс. Показано профилактическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения как способа коррекции нарушений сперматогенеза, индуцированных ионизирующим облучением, что пополняет знания о действии лазера на биологическую ткань. Это имеет практическое значение для понимания сочетанного действия двух видов излучений: ионизирующего и низкоинтенсивного лазерного.
Известно, что химиотерапия и радиотерапия являются фундаментальными методами лечения онкологических заболеваний, поэтому современные представления о последствиях консервативного лечения на организм млекопитающих, особенно на репродуктивную систему, являются актуальными.
Согласно ВОЗ доклинические исследования лекарственных препаратов следует проводить, выполняя требования GLP (Good Laboratory Practice) [Брайцева, 2005]. Среди основных требований, выдвигаемых этим важным документом - GLP, стоит необходимость определения токсичности в отношении репродуктивных функций, что и было сделано в представленной работе.
Положения, выносимые на защиту
1. Новая наносомальная лекарственная форма доксорубицина обладает меньшей токсичностью для дифференцирующихся мужских половых клеток по сравнению с действием свободной формы антрациклинового антибиотика. Как прослежено в динамике (15-е и 30-е сутки) выраженный токсический эффект доксорубицина проявляется во всех экспериментальных группах, при этом в группе крыс, которым вводили антрациклиновый антибиотик в традиционном водном растворе, дегенеративные процессы в сперматогенном эпителии наиболее выражены.
2. По сравнению с интактными животными в сперматогенном эпителии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6 в результате лечения доксорубицином и его модификациями происходит более выраженный процесс дегенерации половых клеток, приводящий к полному опустошению извитых семенных канальцев.
3. Использование низкоинтенсивного лазерного излучения перед общим радиационным облучением повышает количество сперматоцитов I, находящихся на стадии метафазы I и II деления мейоза, по сравнению с эффектом ионизирующего облучения.
4. Низкоинтенсивное инфракрасное лазерное излучение, применяемое в импульсном режиме до радиационного облучения в средних дозах, может быть включено в список средств, обладающих резистентным эффектом по отношению к сперматогенезу.
Экспериментальные и клинические исследования гонадо- и гаметотоксического эффекта противоопухолевых препаратов
Интерес к проблеме стерильности как к одному из побочных действий цитостатического воздействия значительно возрос в последние годы, что связано, прежде всего, с определенными успехами, которых достигла противоопухолевая химиотерапия [Шилин и др., 1999; Гольдберг и др., 2000; Боровская и др., 2002]. Так, известны группы злокачественных новообразований, при лекарственном лечении которых удается добиться длительной стойкой ремиссии. Кроме того, внедрение в онкологическую практику современных методов диагностики привело к увеличению количества больных с ранними формами опухолей, которые достаточно хорошо поддаются лечению, в том числе химиотерапевтическому. В связи с этим возникает актуальная задача сохранения качества жизни пациентов, особенно если пациент находится в молодом возрасте. С учетом биологического, социального и психологического значения побочных эффектов антибластомных средств на сперматогенез и овариальную функцию это требует углубленного изучения их гонадотоксических эффектов [Шилин и др., 1999]. В настоящее время накоплен уже достаточно обширный клинический и экспериментальный материал о влиянии цитостатической химиотерапии на репродуктивную функцию [Курило, Хилькевич, 1991; Гольдберг и др., 1997; 2000; Боровская и др., 2001; 2002]. Более того, проводится интенсивный поиск способов коррекции возникающих при химиотерапии осложнений. Выраженность токсического действия противоопухолевых препаратов на половые железы обусловила необходимость их более тщательного экспериментального изучения.
Половые железы, являющиеся активно пролиферирующими клеточными системами, в первую очередь, наряду с системой крови и слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта, подвергаются токсическому действию противоопухолевых препаратов. Это относится как к семенникам, в которых, благодаря многочисленным митотическим делениям сперматогониев и двум мейотическим делениям сперматоцитов I и II порядка, происходит созревание мужских половых клеток, так и к яичникам, структура и функциональное состояние которых постоянно изменяются в связи с цикличностью их деятельности. Поэтому тщательное количественное изучение цитологического и мутагенного действия противоопухолевых агентов на половые клетки и половые железы млекопитающих имеет большое значение.
Показано, что при воздействии в период митотического деления просперматогониев тиофосфамид обладает гаметотоксическим эффектом для плодов мышей линий 101 /Н, AKR и СВА [Курило, Хилькевич, 1991]. Эффект проявляется в увеличении объема ядер половых клеток в ИСК к моменту рождения и в снижении количества половых клеток всех клеточных генераций. Введение самкам тиофосфамида на 12-й день беременности в дозе 5 мг/кг приводит к снижению числа просперматогониев в семенниках 19-суточных плодов (то есть поколения Fi).
Анализ эффекта хронического введения циклофосфамида взрослым самцам крыс позволил обнаружить, что предимплантационная гибель потомства от таких самцов и интактных самок обусловлена нарушениями, возникающими в сперматозоидах. Постимплантационные же потери являлись следствием возникновения нарушений в сперматидах [Hales, Robaire, 1990]. Эти данные свидетельствуют о том, что наибольшая частота доминантных летальных мутаций после воздействия циклофосфамидом возникает вследствие нарушений в половых клетках на постмейотических стадиях развития. В тоже время эффект циклофосфамида на предмейотические стадии развития половых клеток взрослых самцов может проявляться изменением поведенческих реакций у потомства первого поколения Fi [Auroux, 1986]. Частота врожденных уродств у потомства также увеличивается после длительного введения циклофосфамида самцам крыс в течение 7-9 недель, т.е. воздействия на предмейотические стадии развития половых клеток [Trasler et al, 1986].
У человека длительное введение циклофосфамида сопровождается дисфункцией гонад с развитием азоо- или олигозооспермии [Watson et al, 1985].
Следует отметить, что изучение состояния репродуктивной системы на экспериментальных животных позволяет провести детальный морфологический анализ половых желез и одновременно оценить не только отдельные параметры функционирования этой системы, но и ее интегральные характеристики, такие как способность к спариванию и его эффективность, дать подробный анализ состояния потомства.
Работая в указанном направлении на протяжении последних лет, Гольдберг и Боровская [1999; 2000; 2002] в своих экспериментальных исследованиях сосредоточили внимание на изучении состояния репродуктивной системы при введении противоопухолевых препаратов, принадлежащих к разным классам химических соединений, таких как комплексные соединения платины (платидиам, карбоплатин), антрациклиновые антибиотики (доксорубицин, фарморубицин), препараты растительного происхождения (вепезид). Необходимо подчеркнуть, что в современной лекарственной терапии опухолей для достижения наибольшего эффекта соблюдается принцип химиотерапевтического радикализма, перечисленные антибластомные средства вводили однократно в максимально переносимых дозах. Проведение экспериментальных исследований позволило Гольдбергу с соавторами изучить характер, глубину, динамику, механизмы нарушений репродуктивной системы на фоне применения препаратов разных групп, а также выявить особенности гонадотоксического действия каждого их них, что зачастую сложно сделать в условиях клиники, т.к. современная химиотерапия опухолей, как правило, является комбинированной (полихимиотерапия) [1999; 2000; 2002].
Установлено, что своеобразие повреждающего действия на половые железы антибластомных средств с различным механизмом их цитостатического действия заключается в степени его выраженности, сроках проявления и времени наступления процессов репаративной регенерации, что обусловлено различной чувствительностью к их действию отдельных типов половых клеток семенников и различных структурно-функциональных элементов яичников. Проведен сравнительный анализ нарушений как отдельных звеньев, так и всей системы воспроизводства при введении противоопухолевых препаратов разных групп. Описано состояние потомства экспериментальных животных, один из родителей которого перенес цитостатическое воздействие [Гольдберг и др., 1995, 1996,2000,2003].
Антибиотики группы антрациклинов (доксорубицин): механизм действия и выявленная токсичность. Возможность снижения токсичности противоопухолевых препаратов
Наиболее широкое распространение в клиническом использовании получили липосомы как контейнеры для доставки лекарственных препаратов.
Липосомы представляют собой закрытые сферические пузырьки, образованные из фосфолипидов, которые состоят из гидрофильной головки и гидрофобного хвоста. Они не токсичны, биодеградируемы, при определенных условиях могут поглощаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого [Каплун и др., 1999].
Впервые липосомы описаны около 30 лет назад и названы фосфолипидными сферулами. Вначале липосомы использовались как модельная система при изучении биологических мембран, а затем -как средство доставки лекарственных препаратов, в том числе и противоопухолевых. Последующие исследования в этом направлении привели к созданию большого количества липосомальных форм, способных нести широкий спектр препаратов, некоторые из них уже нашли клиническое применение. Липосомы существенным образом улучшили терапевтическую эффективность противоопухолевых препаратов и снизили токсичность по сравнению со свободными субстанциями [Lasic et al., 1995; Harrington et al., 2000].
Вещество, заключенное в липосомы, защищено от воздействий ферментов, что увеличивает эффективность препаратов, подверженных биодеструкции в биологических жидкостях, например в крови. Еще одно важное преимущество липосом — постепенное высвобождение лекарственного препарата из липосом, что увеличивает время действия вводимого вещества. Недостатком липосомальиых форм является то, что они быстро захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС). Это происходит вследствие взаимодействия липосом с белками плазмы -опсонинами. Опсонины «метят» липосомы, делая их мишенями для клеток РЭС. Понятно, что увеличение времени циркуляции липосомальиых форм лекарственных препаратов еще больше может повысить их эффективность. С этой целью было предложено их поверхность модифицировать полимерами с гибкой гидрофильной цепью, например полиэтиленгликолем (ПЭГ) [Blum et al., 1990; Allen et al., 1991]. Для преодоления захвата липосом мононуклеарами РЭС ученые разработали «липосомы-невидимки». С этой целью в липидныи слой липосом встраивают ПЭГ, что приводит к повышению осмотического давления вокруг липосом и препятствует их сближению с клеткой. При этом липосомы не распознаются клетками РЭС и долгое время циркулируют в крови. Однако пегилированные липосомы имеют существенный недостаток - они также плохо накапливаются в опухоли.
Химиотерапия онкологических заболеваний головного мозга затруднена функционированием гематоэнцефалического барьера. Недавно было показано [Steiniger et al., 2004], что доксорубицин, заключенный в наночастицы и обработанный препаратом Tween 1% (полисорбат 80, 1%-й раствор), способен преодолевать гематобарьер, создавая терапевтическую дозу доксорубицина в головном мозге и поражая клетки глиобластомы. Также было обнаружено, что экспериментальные животные, получавшие лечение комбинацией Dox+NP+Tween 1% (доксорубицин в наноочастицах, обработанных полисорбатом 80), имели более длительное время выживания по сравнению с остальными группами. Гистологический анализ тканей головного мозга, проведенный в данном эксперименте, показал низкие значения размера опухоли и низкие значения пролиферации и апоптоза в группе, леченной Dox+NP+Tween 1%. Данный эксперимент убедительно показал, что препарат Dox+NP+Tween 1% обладает терапевтическим потенциалом для лечения опухолей головного мозга, в частности глиобластомы. Однако в данной работе не были исследованы побочные действия нового лекарственного препарата, в частности на репродуктивную систему.
Также группой авторов [Gelperina et al.,2002] был поставлен эксперимент по изучению влияния лекарственной формы доксорубицина (в том числе обработанного Tween 1%) на сердце здоровых крыс. Выявлено, что доксорубицин, заключенный в нанокапсулы, обладает сниженной кардиотоксичностью по сравнению со свободной формой доксорубицина. Фармакокинетика и химиотерапевтическая активность антрациклиновых антибиотиков, ассоциированных с полимерными наночастицами была изучена Скиданом И.Н. [2000]. Целью исследователя было повышение эффективности противоопухолевой химиотерапии. Было проведено исследование фармакокинетики доксорубицина, ассоциированного с наночастицами из поли-н-бутилцианоакрилата, на интактных крысах при внутривенном введении и на изолированных опухолевых клетках и изучена возможность изменения фармакокинетики доксорубицина на наночастицах в результате модификации их поверхности полисорбатом 80. В результате проведенного эксперимента был установлен антибластомный эффект антрациклиновых антибиотиков, входящих в состав полимерных частиц в отношении перевиваемых опухолей у животных. Кроме того, с помощью электронно-микроскопического метода изучена реакция клеток асцитной карциномы Эрлиха при взаимодействии с наночастицами. При ультраструктурном исследовании интактных клеток асцитной карциномы Эрлиха и тех же клеток, инкубированных с «пустыми» полимерными наночастицами, отмечали выраженную фагоцитарную реакцию последних. Реакция характеризовалась увеличением тонких цитоплазматических выростов, формирующих фагоцитарные вакуоли. Автор наблюдал хлопьевидные массы, расцененные им как продукты деструкции полимерных наночастиц и их поглощение путем микропиноцитоза [Скидан, 2000].
Опыты Скидана показали, что в результате модификации поверхности полисорбатом 80 наночастицы приобретают способность доставлять противоопухолевый антибиотик доксорубицин в головной мозг. При покрытии наночастиц полисорбатом 80 поглощение их РЭС снижается примерно в 1,5-2 раза и, соответственно, увеличивается время их циркуляции в крови. Это обстоятельство создает возможность накопления доксорубицина в головном мозге [Скидан, 2000].
Однако, несмотря на значительный прогресс в изучении доксорубицина, ассоциированного с полимерными наночастицами, его фармакокинетики и побочных токсических действиях, не было проведено исследований по влиянию модифицированной формы доксорубицина на репродуктивную систему, в частности мужские половые клетки. В виду того, что препараты на основе биодеградирующих наночастиц постепенно внедряются в онкологическую практику, вопрос гаметотоксического действия препаратов актуален и требует решения.
Схема экспериментов по изучению воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматогенный эпителий до процедуры общего ионизирующего облучения
Процентное соотношение интерстициальной ткани во всех экспериментальных группах достоверно не отличалось от такового в интактной группе животных. Количество клеток Лейдига незначительно выросло, однако, также достоверно не отличалось от данного показателя крыс интактной группы.
Выявленные признаки деструктивных изменений СЭ и интерстициальной ткани свидетельствуют о негативном влиянии антибиотиков, однако, на данном этапе эксперимента (15-е сутки после прекращения лечения) не удалось выяснить, какая модификация доксорубицина является наиболее безопасной с точки зрения влияния на половые клетки и интерстициальную ткань.
Результаты второй части эксперимента, когда животных наблюдали в более поздние сроки (30-е сутки после окончания лечения), представлены в таблице 5.
Группа иптактных животных. При гистологическом исследовании СЭ крыс интактной группы в просвете 44,3±0,8% ИСК были видны сперматозоиды (рис.5). Количество ИСК, содержащих 3 генерации половых клеток (сперматогонии, сперматоциты и сперматиды), у крыс интактной группы составило 55,7±0,8%. ИСК с 2-мя и ниже генерациями половых клеток в данной группе обнаружено не было. Индекс сперматогенеза у крыс интактной группы составил 3,44±0,008. Слущивание НІЖ в просвет ИСК составило 3,1 ±0,7%. Число ИСК с пустотами и расслоениями СЭ также было незначительно (в 1,3±0,7% ИСК). Атипия собственной оболочки ИСК обнаружена в 24,8±5,4% проанализированных ИСК. Процентное соотношение площади, занимаемой интерстициальнои тканью и ИСК составило 18,53±1,8. Количество клеток Лейдига -2537±296.
Экспериментальные группы. Группа NP+Tween 1%. Картина морфологических изменений в СЭ у крыс 1-й подопытной группы, получавших NP в комплексе с Tween 1%, была существенно изменена по сравнению с таковой у крыс интактной группы. Было выявлено достоверное снижение количества ИСК с 4-мя генерациями (р 0,05). Количество ИСК, содержащих 4 генерации половых клеток, составило 32,5±4,2%, что приблизительно на 20% ниже такового показателя у крыс интактной группы. Количество ИСК с 3-мя генерациями половых клеток в СЭ составило 66,4±3,7%. ИСК, содержащих 2 генерации ПК (сперматогонии и сперматоциты), обнаружили в 1,1 ±0,8% проанализированных ИСК, что указывает на токсичность соединения NP+Tween 1%.
Индекс сперматогенеза у крыс данной группы составил 3,31±0,04, что достоверно (р 0,05) ниже значения индекса сперматогенеза у крыс интактной группы (диаграмма 1). Повреждений половых клеток замечено не было. Однако слущивание НІЖ в просвет ИСК отмечено в 7,8±0,7% канальцах, что достоверно превышает таковой показатель у крыс интактной группы (р 0,05). Пустоты и расслоения СЭ выявлены в 12,1 ±1,9% проанализированных ИСК. Атипия собственной оболочки ИСК у крыс, которым применяли комбинацию лекарственных препаратов NP+Tween 1%, замечена в 37,3±5,2% канальцев. Клетки Лейдига в интерстициальнои ткани семенников крыс 1-й группы не изменены, их число на 1000 случайных полей зрения составило 3776±664. Процентное соотношение интерстициальной ткани и ИСК не изменено по сравнению с таковым показателем интактных животных.
Группа Dox. У крыс 2-й группы, получавших свободный Dox, выявлено резкое снижение индекса сперматогенеза (таблица 5, диаграмма 1). Он составил 2,66±0,11, что достоверно (р 0,05) отличается от такового показателя крыс интактной группы. По сравнению с интактной группой наблюдали дистрофическое изменение со стороны паренхимы органа. Количество ИСК, содержащих 4-3 генерации половых клеток, достоверно (р 0,05) снижено по сравнению с интактной группой (ИСК с 4-мя генерациями - 14,5±2,7% (р 0,05), с 3-мя генерациями - 50,1±3,6%). Наблюдали появление ИСК, в которых отсутствуют половые клетки любых клеточных генераций, а присутствуют только клетки Сертоли, которые, как известно, являются самыми устойчивыми при любом виде воздействия (рис.6). Доля таких канальцев составила 3,5+1,6%. Также в семенниках крыс, получавших доксорубицин в свободном состоянии, выявлены ИСК, содержащие 1 генерацию половых клеток (сперматогонии) (5,4±2,2%) и 2 генерации половых клеток (сперматогонии и сперматоциты) (26,5±4,5%).
В семенниках крыс 2-й группы (Dox) обнаружили выраженную атипию собственной оболочки ИСК: ее отслоение от пласта сперматогенных клеток и проявление признаков складчатости и «фестончатости». Количество ИСК с нарушением строения собственной оболочки составило 65,5±3,3%. Данный показатель оказался достоверно (р 0,05) выше по сравнению с интактной группой и превысил значения количества ИСК с нарушением собственной оболочки во всех остальных экспериментальных группах (диаграмма 2). Происходило разрыхление слоев клеток СЭ, опустошение ИСК. Доля ИСК, содержащих пустоты и расслоения СЭ, у крыс 2-й группы (Dox) составила 36,1 ±2,9%. Наиболее отчетливо по сравнению с остальными экспериментальными группами была выражена десквамация НПК в просвет ИСК. Данный показатель равен 19,1±2,9%, что достоверно (р 0,05) превысило не только значение у крыс интактной группы, но и значения слущивания НПК других экспериментальных групп. В процессе количественного морфологического анализа выявлено, что наиболее активно слущивались в просвет половые клетки поздних стадий развития (ранние и средние сперматиды). Отмечали сниженное по сравнению с интактной группой число сперматоцитов, вступающих в процесс дифференцировки (стадия прелептотены). Также у крыс 2-й (Dox) группы выявлено набухание клеток Сертоли, и появление сперматоцитов с вакуолизированной цитоплазмой. В интерстициальной ткани наблюдается незначительный отек.
Влияние наносомальных лекарственных форм доксорубицина на сперматогенный эпителий в процессе химиотерапии крыс с интракраниально перевитой глиомой С6
Также при анализе сперматогенного эпителия крыс, получавших свободный доксорубицин, на базальной мембране были обнаружены гибнущие сперматогонии с пикнотическими ядрами (рис.8).
Группа Dox+NP. При морфологическом анализе клеток сперматогенного эпителия крыс 3-й группы при действии препарата Dox+NP было выявлено достоверное по сравнению с контрольной группой снижение числа ИСК с 4-мя генерациями клеток (28,4±9,1%), повышение числа ИСК с 3 генерациями (57,4±8,5%) по сравнению со 2-й группой, а также появление ИСК с 2-мя (11,8±П,3%) и 1-й генерацией (2,4±2,4%), в которых деструктивные процессы были выражены особенно сильно. Индекс сперматогенеза у крыс, получавших доксорубицин в наночастицах, составил 3,11±0,2, что достоверно не отличается от индекса сперматогенеза 2-й группы. Имело место атипия собственной оболочки ИСК (17,0±2,2%), появление складчатости и «фестончатости». Выявлено наличие 2х и Зх-ядерных клеток (рис.9). В основном это были сперматиды. Под действием антибиотика нарушен процесс деления клеток (доксорубицин связывается с липидами клеточных мембран), что и приводит к появлению многоядерных клеток. Наблюдали появление многополюсных метафаз в сперматоцитах; набухание и вакуолизацию сперматоцитов на стадии пахитены. Был замечен процесс слущивания пласта половых клеток всех стадий дифференцировки, активная гибель постмейотических клеток (ранних, средних, поздних сперматид и сперматозоидов). Количество ИСК со слущенными НПК в просвет канальца составило 11,0+9,5%. Наиболее сильно по сравнению с остальными группами экспериментальных животных было выражено разрыхление пласта дифференцирующихся половых клеток (20,2+4,4%). Данный показатель был достоверно (р 0,01) выше по сравнению с контрольной группой, а также превышал таковое значение всех остальных групп. В отдельных канальцах СЭ крыс, получавших Dox+NP, встречаются дегенерирующие сперматоциты. Изменения в собственной оболочке ИСК у крыс данной группы выражено незначительно по сравнению с другими группами, применяющими доксорубицин (17,0+2,2%).
Группа Dox+NP+Tween 1%. Анализ морфологических изменений СЭ крыс 4-й группы (Dox+NP+Tween 1%) не показал значительных отклонений от контрольной группы. Количество ИСК, содержащих 4 генерации половых клеток, выросло по сравнению с другими группами животных, которым давали доксорубицин в любых модификациях (40,6+2,5%). Не было отмечено ИСК, в которых кроме клеток Сертоли присутствовала только одна клеточная генерация -сперматогонии, хотя в остальных экспериментальных группах были выявлены такие извитые семенные канальцы. Количество ИСК с 3-мя генерациями было равно таковому показателю у крыс контрольной группы (56,0+2,3%). Индекс сперматогенеза в данной группе составил 3,37+0,03, что выше индекса сперматогенеза остальных групп (кроме контрольной). Однако в СЭ крыс, употреблявших Dox+NP+Tween 1%, выявлено наличие 2х и Зх-ядерных клеток (сперматоциты и сперматиды). Наблюдали смешение сперматоцитов к люминарной зоне, отслоение пласта сперматогенных клеток от собственной оболочки ИСК. Количество ИСК, в которых обнаружена атипия собственной оболочки, составило 17,5±5,8%. Слущивание дегенерирующих половых клеток разных стадий дифференцировки в просвет извитого семенного канальца составляло 0,85±0,4% на 100 семенных канальцев, а в 2,4±1,2% ИСК обнаружены пустоты и расслоения СЭ. Клетки, уходящие в дегенерацию, слущиваются в просвет ИСК, что и наблюдается при анализе сперматогенного эпителия у животных в 4-й группе. Пустоты в СЭ и слущивание НПК в просвет ИСК свидетельствуют о гибели половых клеток. ИСК і исследуемых группах Однако активный сперматогенез встречается в отдельных канальцах, половые клетки и их дифференцировка ничем не отличаются от такового контрольной группы. Морфологический анализ семенников крыс 4-й группы показал, что отдельные ИСК были представлены клетками Сертоли и всеми типами дифференцирующихся половых клеток (40,6±2,5%). Таким образом, в результате проведенного морфологического анализа СЭ крыс с перевитой глиомой С6, получавших лечение разными лекарственными формами доксорубицина, было установлено, что половые клетки дегенерируют наиболее сильно при введении свободного доксорубицина. У крыс, которым вводили истинный раствор доксорубицина, выявлена тяжелая степень нарушения половых клеток в составе СЭ: появление клеток с дегенерирующими ядрами, отслоение половых клеток от базальной мембраны, расслоение сперматогенного эпителии, атипия собственной оболочки. При этом у крыс, получавших лечение новой наносомалыюй лекарственной формой доксорубицина, количественные показатели состояния сперматогенеза значительно выше крыс контрольных групп, что и указывает на сниженный гаметотоксический эффект.
