Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Бактериолитические ферменты 14
1.1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе 14
1.2. Внутриклеточные (автол итичес кие) бактериолитические ферменты 16
1.2.1. Свойства автолитических ферментов 17
1.3. Внеклеточные бактериолитические ферменты 19
1.4. Внеклеточные бактериолитические комплексы 19
1.5. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 21
ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий -субстрата бактериолитических ферментов 23
2.1. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий 26
2.2. Клеточная стенка грамиоложительных бактерий 27
2.3. Строение пептидогликана бактерий 29
ГЛАВА 3. Покоящиеся формы бактерий 37
3.1. Спорообразующие бактерии 39
3.1.1. Классификация спорообразующих бактерий 40
3.1.1.1. Анаэробные спорообразующие бактерии 40
3.1.1.2. Аэробные спорообразующие бактерии 41
3.1.2. Жизненный цикл спорообразующих бактерий 49
3.1.2.1. Характеристика бактериальных эндоспор 54
ГЛАВА 4. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза 66
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 68
ГЛАВА 5. Материалы и методы 69
5.1. Материалы 69
5.2. Микроорганизмы и условия их культивирования 69
5.3. Получение препаратов зрелых спор 70
5.4. Определение ферментативных активностей 70
5.4.1. Определение бактериолитической активности 70
5.4.2. Определение дрожжелитической активности 71
5.4.3. Определение протеазной активности 71
5.4.4. Определение пептидазной активности 72
5.5. Определение количества белка 73
5.6. Получение лизоамидазы 73
5.7. Выделение и очистка компонентов лизоамидазы 73
5.7.1. Выделение пептидаз Лі и Л4 73
5.7.1.1. Осаждение белков сульфатом аммония 73
5.7.1.2. Ионообменная хроматография на СМ-сефадексе С-50 74
5.7.1.3. Ионообменная хроматография на SP-сефадексе С-50 74
5.7.1.4. Гельфильтрация на сефакриле S-200 74
5.7.1.5. Электрофоретический анализ ферментных препаратов 75
5.7.2. Выделение и очистка М-ацетил-мураноил-Ь-аланин амидазы Л2 и мурам идазы М 75
5.7.3. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы 76
5.7.4. Выделение и очистка полисахарида лизоамидазы 76
5.8. Реконструкция фермент-полисахаридного комплекса 76
5.9. Характеристика полученных ферментных препаратов 76 5.9.1. Вестерн-блоттинг 76
5.9.2. Идентификация N-концевых аминокислотных последовательностей молекул ферментов 77
5.9.3. Определение оптимального значения рН для действия нового бактериолитического фермента Л4 и металлопротеазы 77
5.9.4. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия ферментов Л4
и металлопротеазы 77
5.9.5. Определение влияния температуры на проявление активности ферментов Л4 и металлопротеазы 78
5.9.6. Определение термостабильности ферментов Л4 и металлопротеазы 79
5.9.7. Определение действия ингибиторов на активность ферментов Л4 и металлопротеазы 79
5.9.8. Определение заряда фермента Л4 методом электрофореза 80
5.9.9. Определение молекулярных масс ферментов Л] и Л4 80
5.10. Изучение действия лизоамидазы и ее компонентов на эндоспоры бактерий рода Bacillus 81
5.10.1. Изучение действия лизоамидазы и лизоцима на зрелые споры бацилл с выявлением результатов на жидкой среде 81
5.10.2. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов
на твердой среде 81
5.10.3. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов нп жидкой среде с последующим высевом на твердую среду 82
5.10.4. Изучение действия гомогенных ферментов лизоамидазы, полисахарида лизоамидазы и
реконструированных фермент-полисахаридных комплексов на зрелые споры бацилл 83
5.10.5. Обработка спор В. subtilis W-23, В. subtilis 168 и Л. cereus 217 лизоамидазой для последующего исследования методом атомно-силовой микроскопии 83
ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение 84
6.1. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бактерий рода Bacillus 84
6.2. Исследование спор В. subtilis W-23, В. subtilis 168
и В. cereus 217, обработанных лизоамидазсй, методом атомно-силовой микроскопии 92
6.3. Изучение роли компонентов лизоамидазы в действии препарата на зрелые споры бактерий рода Bacillus 94
6.3.1. Выделение, очистка и характеристика компонентов лизоамидазы 95
6.3.1.1. Выделение пептидазы Лі и обнаружение ранее неизвестного бактериолитического фермента Л4 95
6.3.1.2. Изучение основных физико-химических свойств нового бактериолитического фермента Л4 100
6.3.1.3. Выделение и очистка М-ацетил-мурамоил-Ь-аланин амидазы Л2 и мурамидазы М 108
6.3.1.4. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы 108
6.3.1.5. Выделение и очистка экзополисахарида лизоамидазн и реконструирование фермент-полисахаридного комплекса 109
6,3.2. Изучение действия отдельных ферментов лизоамидазы,
полисахарида лизоамидазы и вариантов реконструкции препарата на зрелые споры
бактерий рода Bacillus 109
6.4, Обнаружение дрожжелитической активности металлопротеазы препарата лизоамидаза 115
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 119
ВЫВОДЫ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
- Распространенность бактериолитических ферментов в природе
- Клеточная стенка грамотрицательных бактерий
- Спорообразующие бактерии
- Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза
- Микроорганизмы и условия их культивирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной медицины является борьба с множественно устойчивей к антибиотикам патогенной микрофлорой: стафилококками, стрептококками, а также с образующими эндоспоры представителями семейства ВасШасеае.
Эпидемиологическое значение бактериальных спор определяется возможностью их длительного сохранения (в сухой почве за 50 лет хранения сохраняет жизнеспособность до 10% спор). Высокая устойчивость спор к различным воздействиям связана с наличием у них плотной многослойной оболочки, низким содержанием воды, присутствием ферментов в неактивной форме. Терморезистентность спор объясняется значительной внутриклеточной концентрацией в них дипиколинивой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты. Таким образом, бактериальные эндоспоры практически не уязвимы для внешнего воздействия, что создает определенные сложности при разработке эффективных методов борьбы с патогенными спорообразующими бактериями. К патогенным для человека бактериям p. Bacillus относятся В. cereus, вызывающий воспалительные процессы, и В. anthracis - возбудитель сибирской язвы.
По данным Всемирной организации здравоохранения, сибирской язвой в мире ежегодно заболевают около 20 000 человек, при этом не редок летальный исход; поэтому создание вакцин против сибирской язвы и развитие новых направлений профилактики этого заболевания является чрезвычайно важным вопросом. Особенно актуальной эта проблема стала после террористических актов, произошедших в США в 2001 году и выражавшихся в рассылке конвертов со спорами В. anthracis. Возможность применения спор сибирской язвы в качестве биологического оружия обусловлена относительной легкостью получения большого количества биологического материала, возможностью его скрытого применения, высокой эффективностью.
Кроме того, известно, что многие виды непатогенных бацилл способны вызывать ряд серьезных заболеваний у людей с ослабленной иммунной системой, после антибиотикотерапии и др.
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН из культуральной жидкости бактерии Lysobacter sp. XL1 получен препарат лизоамидаза. В состав препарата входят бактериолитические ферменты (эндопептидаза Л,, N-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза Л^ и мурамидаза М), благодаря чему лизоамидаза эффективно лизирует клетки широкого спектра патогенных антибиотикоустойчивых грамположительных бактерий (в том числе вегетативные клетки В. subtilis и В, cereus) и может успешно использоваться как в биологии, так и в медицине. Действие лизоамидазы на бактериальные эндоспоры не было изучено.
Цель работы: исследование действия препарата лизоамидаза и его компонентов на споры В. subtilis и споры В. cereus, выбранные в качестве модели спор В. anthracis - возбудителя сибирской язвы, поскольку покровы спор В. cereus имеют строение, аналогичное строению покровов спор В. anthracis.
Задачи работы: 1. Изучить действие лизоамидазы на споры В. subtilis W-23, В. subtilis 168 и В. cereus 217.
2. Выделить, очистить и охарактеризовать бактериолитические ферменты лизоамидазы, а также металлопротеазу и полисахарид, входящие в ее состав. 3. Изучить действие отдельных компонентов лизоамидазы и их сочетаний на зрелые спорый, subtilis W-23, В. subtilis 168иВ. cereuslll.
Научная новизна работы. Впервые изучено действие препарата лизоамидаза на эндоспоры В. subtilis W 23, В. subtilis 168 и В. cereus 217. Установлено, что лизоамидаза обладает спороцидным действием в отношении зрелых спор этих бацилл.
Показано, что спороцидное действие выявляется при использовании бактериолитических фер.ментов лизоамидазы в сочетании с экзополисахаридом, входящим в ее состав.
В ходе работы выделен новый бактериолитический фермент бактерии Lysobacter sp. XL 1 - Л4. Разработана схема очистки фермента Л4, при использовании которой он может быть получен в электрофоретически гомогенном состоянии.
Установлена N-концевая аминокислотная последовательность молекулы фермента Л4. При сравнении данной последовательности с белковыми последовательностями, представленными в базах данных «PIR», «Uni-Prot» и «Swiss-Prot» [], выявлено, что бактериолитический фермент Lysobacter sp. XL 1 Л4 гомологов не имеет, а, следовательно, является новым, неизвестным ранее белком.
Определены основные физико-химические свойства фермента Л4. Показано, что пептидогликан Lysobacter sp. XL 1 бактериолитический фермент Л4 гидролизует как диаминопимелиноил-аланин эндопептидаза.
Обнаружено, что металлопротеаза лизоамидазы не участвует в спороцидном действии препарата, но способна эффективно лизировать клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучены основные физико-химические свойства металлопротеазы на новом субстрате - на клетках дрожжей S, cerevisiae.
Определена N-концевая аминокислотная последовательность молекулы металлопротеазы. Установлено, что металлопротеаза бактерии Lysobacter sp. XL 1 по N-концевой аминокислотной последовательности гомологична ахромопюипу Achromobacter lyticus на 67%.
Научно-практическое значение. Полученные в данной работе результаты могут быть использованы в области медицины: возможно применение лизоамидазы, отдельных бактериолитических ферментов лизоамидазы или их сочетаний с экзополисахаридом лизоамидазы для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых патогенными видами бактерий рода Bacillus.
Так, лизоамидаза, гомогенная эндопептидаза Л] и экзополисахарид лизоамидазы были переданы сотрудникам ФГУП "Государственный научный центр прикладной микробиологии" МЗ РФ (г. Оболенск) для изучения их действия на вегетативные клетки и споры Bacillus anthracis и лечения данными препаратами зараженных сибиреязвенным микробом животных. В результате получены следующие данные:
1. Лизоамидаза оказывает бактерицидное действие на вегетативные клетки, прорастающие споры и покоящиеся споры В. anthracis. Гомогенный бактериолитический фермент эндопептидаза Лі оказывает бактерицидное действие только на вегетативные клетки В. anthracis.
2. Лизоамидаза оказывает лечебный эффект по отношению к экспериментальной сибиреязвенной инфекции, вызванной у белых мышей и золотистых хомяков введением спор В. anthracis (в том числе вакцинного штамма 71/12, вирулентного штамма 4-7 и штамма СТИ-AR, устойчивого к рифампицину, ампициллину, тетрациклину и доксициклину).
3. Бактер политическая эндопептидаза Л3 оказывает лечебный эффект по отношению к модели сибиреязвенной инфекции, вызванной у белых мышей введением вегетативных клеток вакцинного штамма В. anthracis 71/12. Такой же эффект оказывает эндопептидаза Л, в сочетании с полисахаридом лизоамидазы.
По полученным результатам подготовлена заявка (регистрационный № 2005114964) на патент «Средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, способ профилактики и лечения сибирской язвы», авторы: Кунаев И. С, Степная О. А., Бегунова Е. А., Цфасман И. М., Логвина (Чайка) И. А., Маринин Л. И., Старицын Н. А., Шишкова Н. А.
Распространенность бактериолитических ферментов в природе
Бактериолитическне ферменты - это ферменты, способные разрушать клеточные стенки бактерий, и тем самым вызывать лизис бактериальной клетки.
Еще в начале XX века ученые обратили внимание на способность выделений и экстрактов тканей животных лизировать суспензии некоторых грам положительных бактерий. Так, в 1909 г. русский ученый П. Н. Лащенков впервые описал бактериолитическне свойства белка куриного яйца и предположил, что это может быть связано с присутствием в нем специфического энзима (Егоров, 1986). Спустя 13 лет английский микробиолог А. Флеминг открыл и выделил из некоторых биологических жидкостей и тканей человека бактериолитический фермент лизоцим (Fleming, 1922). С тех пор и до настоящего времени гедется интенсивная работа по изучению бактериолитических ферментов.
Наиболее изученными бактериолитическими ферментами растительного, грибного и животного происхождения являются лизоцимы. Они содержатся в молоке, слизи, моче и тканях животных, а также в некоторых тканях растений и грибов (Salton, 1957; Hash et aL, 1964; Нага, Matsushima, 1972; Imoto et aL, 1972; Phillips, 1965; Fermor, Wood, 1981; Taylor, 1983), при этом наибольшая концентрация лизоцима - 2,6% - обнаружена в яичном белке (Головина, 1972). Кроме лизоцимов, в сыворотках человека и некоторых млекопитающих также были обнаружены бактериолитическне N-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазы (Vallingcr et aL, 1982; MoIIner, Braun, 1984).
Принято считать, что бактериолитическне ферменты растений, животных и других высших организмов являются частью их иммунной системы и выполняют защитные функции (Imoto et aL, 1972; Strominger, Tipper, 1974; Vallingcr efa/., 1982).
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из нескольких слоев (рис. 1а). Самый внутренний, примыкающий к цитоплазматической мембране слой, содержит пептидогликан. Его толщина - 2-3 нм (Costerton et al., 1974; Salton, 1994, Holtje, 1998). В некоторых случаях с пептидогликаном ковалентно связаны липопротеины (Braun and Wu, 1994; Sutcliffe, Russel, 1995). Сверху слой пептидогликан а покрывает внешняя мембрана, толщиной 8-Ю нм (Hancock et al., 1994; Bevcridgc, 1999).
Пептидогликан грамотрицательных бактерий. Пептидогликан у грамотрицательных бактерий, в-основном, однослойный, значительно реже 2-х или 3-х слойный и составляет менее 10% сухой массы клеточных стенок этих бактерий (Labishinski, Maidhof, 1994; Pink et al., 2000). Межпептидные мостики отсутствуют. Большинство изученных грамотрицательных бактерий имеют схожее строение пептидогликана.
Внешняя мембрана. Внешняя мембрана так же, как и цитоплазматическая мембрана, представляет собой бислойную мембрану. Однако, в отличие от цитоплазматической мембраны, она крайне асимметрична. Фосфолипиды, преимущественно фосфотидилэтаноламин (ФЭА) (90%) и немного фосфотидилглицерина (ФГ) и кардиолипина (КЛ), обнаружены исключительно во внутреннем монослое, тогда как внешний представлен липополисахаридом (Hancock et al., 1994; Beveridge, 1999). Белковый состав внешней мембраны грамотрицательных бактерий сравнительно проще, чем в цитоплазматической мембране, всего в него входит 6-8 преобладающих белков, которые являются либо структурными, либо транспортными белками. За редким исключением (протеазы, липазы) внешняя мембрана не содержит ферментов (Hancock et at., 1994).
Спорообразующие бактерии
Известно, что в основе морфологической дифференцировки лежат определенные биохимические процессы, которые, в свою очередь, являются выражением соответствующей генетической информации, запрограммированной в генетическом аппарате клетки и реализующейся в процессе ее развития или под действием различных внешних факторов. При этом условия, способствующие образованию покоящихся клеток, до сих пор изучены недостаточно. К категории благоприятствующих факторов относится отсутствие определенных питательных веществ в среде, температура, рН среды, условия аэрации.
Помимо факторов внешней среды, в неодинаковой степени злияющих на формирование разных типов покоящихся клеток, обнаружены специфические вещества, основная функция которых заключается в регулировании роста и развития эубактерий и, в частности, в индуцировании формирования покоящихся клеток. Эти вещества могут выделяться в культуральную среду или накапливаться внутри клетки (Гусев, Минеева, 1992).
Известно, что покоящиеся клетки эубактерий характеризуются очень низким уровнем метаболической активности (Popham, Sctlow, 1993).
Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН из культуральной жидкости бактерии Lysobacter sp. XL 1 получен препарат лизоамидаза. Препарат состоит более, чем из 20 белков, из которых были выделены, очищены и охарактеризовагы металлопротеаза (Северин и др., 1986а; Крупянко и др., 1989; Крупянко и др., 1990), фосфатаза (Северин и др., 19866), а также 3 основных бактериолитических фермента: мурамидаза (Степная и др., 1996а) и две бактериолитические протеазы. Одна из бактериолитических протеаз - Ль в соответствии с классификацией бактериолитических ферментов (Ghuysen, 1968), является эндопептидазой, обладающей также Ы-ацетил-мурамоил-Ь-аланин амидазной активностью (Степная и др., 19966; Бегунова и др., 2003); другая -Л2 - Ы-ацетил-мурамоил-Ь-аланин амидазой (Степная и др., 1986; Степная и др., 1992; Бегунова и др., 2003). Доминирующим Селком среди этих ферментов является эндопептидаза Лі.
Наряду с ферментами в состав лизоамидазы входит большое количество (до 90% по весу) кислого экзополисахарида с молекулярной массой -1300 кДа
Микроорганизмы и условия их культивирования
В работе использовали штаммы Lysobacter sp. XL 1, Bacillus subtilis W-23, Bacillus subtilis 168 и Saccharomyces cerevisiae BKM Y-1173 из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН и Bacillus cereus 217, любезно предоставленный сотрудниками ГНЦПМ г. Оболенска.
Штамм Lysobacter sp. XL 1 выращивали на жидкой среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт, Na2HP04 12H20, КН2РО4, КС1, MgS04-7H20, FeS04-7H20; рН 7.0. Культивирование вели в колбах на качалке в течение 18 часов при температуре 29С. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об./мин. на центрифуге К-70 D в течение 30 минут. Культуральную жидкость использовали для получения бактериолитических ферментов.
Вегетативные культуры В. subtilis и В. cereus выращивали на качалке при 37С и 29С соответственно, в течение 12 часов на среде 5/5, разработанной в ИБФМ РАН, следующего состава: аминопептид - 6%, триптон - 0.5 %, дрожжевой экстракт - 0.1 %, экстракт сои - 3%; рН 7.2.
