Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Свойства опухолевой ткани, делающие осуществимой терапию
конъюгированными препаратами 13
Антигены, ассоциируемые с опухолями 13
Интернализация 14
Особенности опухолевых кровеносных сосудов и проникновение лекарства через них 14
Особенности опухолевого метаболизма 15
1.2. Стратегии получения биоконъюгатов для направленной доставки и выбора
сшивающего агента 16
Функциональные группы белков 16
Реагенты для модификации белков 16
1.3. Бифункциональные реагенты 17
САТА 17
СПДП 19
1.4. Иммуноконъюгаты на основе моноклональных антител 20
Конъюгирование лекарственных средстве МАТ 21
Мишени для антител 25
Факторы, влияющие на эффективность конъюгатов противораковых препаратов с антителами 26
Доставка антрациклинов с помощью МАТ 28
Ограничения эффективности конъюгатов лекарственных средств с антителами , 29
1.5. Альфа-фетопротеин 30
Функции 30
Структура 31
АФП как вектор для направленной доставки противораковых средств 31
Регуляция экспрессии АФП 33
Генетическое разнообразие АФП 33
Антигенные разновидности 34
Рецептор АФП 34
1.6. Рецептор эпидермального фактора роста как мишень для лекарственных средств
направленного действия 34
Эпидермальный фактор роста (ЭФР) 35
Структура ЭФР 36
Потенциал использования ЭФР в лечении рака 37
Синтез конъюгатов ЭФР 38
Рецептор ЭФР 38
Структура рецептора эпидермального фактора роста 40
Передача сигнала с помощью РЭФР 40
Усиление внутриклеточного сигнала РЭФР 42
Мутантные формы РЭФР 43
1.6.10. РЭФР и рак 43
Подходы, основанные на применении липосом 44
Декстраны 46
Использование человеческого сывороточного альбумина в качестве носителя . 47
1.10. Опухолевый ангиогенез в качестве мишени для терапии 48
1Л 0.1. Механизмы, способствующие ангиогенезу 51
1.10.2. Основной ФРФ 51
1.10. 3. Протеолитические ферменты 52
Клетки, ответственные за воспалительную реакцию 52
Роль интегринов в ангиогенезе 53
Ингибиторы ангиогенеза 54
Антиангиогенная терапия рака 54
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
2.1 Использованные оборудование и материалы 57
2.2.. Выделение и очистка АФП 58
2.2.1. Иммобилизация моноклональных антител на сефарозе 58
2.2.2, Фракционирование полиэтиленгликолем 59
Аффинная хроматография 59
Ионообменная хроматография 59
Гель-проникающая хроматография 60
Электрофорез в полиакриламидном геле 60
2.3. Выделение и очистка ЭФР 61
Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рч ЭФР) 61
Выделение мышиного ЭФР 61
2.3.3.Синтез и очистка ЭФРфр и его модифицированных форм 61
2.4. Получение конъюгатов ДР с АФП 62
Модификация ДР с помощью Н-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата. (СПДП) 62
Модификация АФП с помощью СПДП 62
Получение конъюгатов ДР с АФП с помощью СПДП 62
Получение конъюгатов ДР с ЭФР и ЗФРфрю-зі 63
Получение конъюгатов ДР с ЭФРфр2о-л, ЭФРфр 1 и ЭФРфр2 63
Получение конъюгатов ДР сМАТдфпр 64
Активация доксорубицина с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликолевой кислоты (SATA) 64
Синтез конъюгата моноклонального антитела с доксорубицином 64
2.8. Исследование биологической и специфической противоопухолевой активности
препаратов in vitro 65
Культивирование клеток 65
Митогенная активность ЭФР, ЭФРфр2о-зь ЭФРфр! и ЭФРфр2 66
Определение цитотоксической активности (ЦТА) конъюгатов in vitro 66
Оценка жизнеспособности клеток 66
2.9. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo 67
Животные и опухоли 67
Дозы препаратов и их введение 67
Объем опухолей 67
Продолжительность жизни животных 68
Статистическая обработка результатов 68
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69
3.1. Выделение а-фетопротеина человека 69
Аффинная хроматография 69
Ионообменная хроматография 71
Гель-проникающая хроматография 72
3.2. Выделение ЭФР 75
3.2.1. Выделение ЭФР из подчелюстных желез мыши 75
3.2.3. Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рчЭФР) 76
3.3. Синтез конъюгатов векторных белков с доксорубицином 77
Конъюгаты АФП и МАТдфпр с доксорубицином (ДР) 77
Получение конъюгата ДР с МАТафпр 79
Исследования ЦТА конъюгатов АФП-ДР и МАТАФПр-ДР 80
Получение конъюгатов ДР -ЭФР и ДР-ЗФРфр2о-зі 83
Определение митогенной активности ЭФР и ЭФРфр20-31 83
Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфр2о-згДР 84
Цитотоксическая активность конъюгатов в отношении эндотелиальных клеток (HUVEC) 85
Получение конъюгатов рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР и его модифицированных форм {ЭФРфр1, ЭФРфр2) с помощью сшивающего реагента СПДП 86
Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР-пептидами в отношении клеток карциномы человека HeLa 87
ЦТА ДР и конъюгатов в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro 88
3.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo 88
ВЫВОДЫ 90
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФП - а-фетопротеин
AT - антитела
АФПР - рецептор АФП
ДР - доксорубицин
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
МАТ - моноклональные антитела
РЭА - раковоэмбриональный антиген
ОФ ВЭЖХ - обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
ОФРФ - основной фактор роста фибробластов
РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста
САТА - N-гидроксисукцинимидный эфиро S-ацетилтиогликолевой кислоты
СЭФР - фактор роста сосудистого эндодтелия.
СПДП - N-оксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты
ТФР - трансформирующий фактор роста.
ЦТА — цитотоксическая активность
ЧСА - человеческий сывороточный альбумин
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭФР - эпидермальный фактор роста
ЭФРфр - рецепторсвязывающий фрагмент эпидермального фактора роста
Введение к работе
Направленную доставку нередко подразделяют на активную и пассивную, причем пассивная предполагает накопление лекарства вследствие действия физико-химических или фармакологических факторов, тогда как активная направленная доставка обусловлена специфическим взаимодействием между системой доставки и компонентами клеток или тканей. Терапия рака с помощью направленной доставки лекарственных средств осуществляется преимущественно применением цитотоксических препаратов, которые убивают клетки, вместо того, чтобы оказывать постепенное фармакологическое действие за счет биологического ответа. Большинство этих препаратов было разработано на основании того факта, что раковые клетки делятся быстрее, нежели нормальные, В целом это действительно так, однако проблема состоит в том, что разница их активностей по отношению к опухолевой и нормальной тканям настолько мала, что между концентрацией, вызывающей гибель всех опухолевых клеток и концентрацией, ведущей к серьезным повреждениям нормальной ткани остается лишь небольшое «окно». Очевидно, что возможность более эффективной доставки препарата к его мишени и сопутствующее уменьшение количества препарата, поступающего в нормальные ткани, привели бы к сокращению числа опасных для жизни побочных эффектов и значительному прогрессу терапии рака.
Открытие опухолевых антигенов заставило возлагать на эти идеи большие надежды и стимулировало проведение большого числа разнообразных опытов по направленной доставке. Однако вскоре стало ясно, что в большинстве своем предложенные мишени относились к опухолеассоциированным антигенам, различие в экспрессии которых опухолевой и нормальной тканями носит лишь количественный характер. На данном этапе возник вопрос о том, может ли такая разница в экспрессии антигена иметь терапевтическое применение. Чтобы ответить на него необходимо, в первую очередь, определить характерные различия между нормальными и раковыми клетками, которые могут быть использованы. Молекула клеточной поверхности, распознаваемая векторным агентом может быть опухолеспецифическим антигеном, например гликопротеином или онкобелком, рецептором фактора роста или гормона
роста. В идеальном случае такая молекула на клеточной поверхности должна обладать следующими свойствами: (А) уникальная молекула, экспрессируемая только в ткани опухоли, (Б) отсутствие экспрессии в нормальных тканях, (В) высокая аффинность связывания с векторной молекулой, (Г) однородность экспрессии на всех клетках ткани-мишени, (Д) экспрессия в опухолях всех больных с одинаковым типом рака, (Е) не выделяется в сыворотку больных. Главной предпосылкой подхода, основанного на направленной доставке лекарственных средств, является то, что конъюгирование лекарства с молекулой, специфично связывающейся с опухолью, приводит его в неактивное состояние до тех пор, пока оно не достигнет своей мишени. Оказавшись в опухоли, конъюгированный препарат связывается с поверхностью опухолевых клеток и в дальнейшем интернализуется и отщепляется от молекулы-носителя. Таким образом, конъюгированные препараты можно рассматривать как опухолеактивируемые пролекарства (ОАПЛ).
В то время как наиболее распространенные пролекарства превращаются в лекарственную форму за счет таких механизмов, как химический или ферментативный гидролиз, восстановление активности ОАПЛ должно целиком зависеть от антигенов или рецепторов, которые специфичны для поверхности опухолевых клеток. Как правило, подобные лекарственные средства разрабатывались для преодоления физиологических барьеров, таких как быстрый метаболизм или выведение из циркуляции. Обычные пролекарства разрабатываются в предположении того, что улучшение фармакокинетических свойств исходного лекарства приведет к увеличению его уровня в циркуляции и через это - к большей активности за счет улучшения его накопления в опухоли. При терапии ОАПЛ специфическое сродство опухолеассоциированного антигена или рецептора к векторной составляющей конъюгата ведет, вдобавок, к большему поглощению и накоплению ОАПЛ в опухоли, против которой оно направлено и, таким образом, к увеличенной селективности. За этим следует высвобождение активного лекарства, следствием которого является его высокая местная концентрация в области мишени. В идеальном случае конъюгаты стабильны в кровотоке, поэтому активное лекарство не высвобождается вовне опухоли. Конъюгаты также не должны связываться с тканями, не являющимися их мишенью и, следовательно, должны быть нетоксичны при применении in vivo.
В ранних испытаниях конъюгированных препаратов широко использовались моноклональные антитела, однако различными методами, например
иммунофлуоресцентным, было показано, что большинство антител связывается с опухолеассоциированными антигенами, которые лишь преимущественно, но не исключительно, экспрессируются на поверхности опухолевых клеток. В большинстве случаев антитела также связываются, хотя и в меньшей степени, с нормальными тканями. Применение же небольших фрагментов антител показало, что они обладают большей скоростью клиренса и неспособны транспортировать достаточное количество активного лекарства.
В качестве векторных агентов наиболее привлекательны другие молекулы, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), обладающий малым размером, высоким сродством к рецептору и быстро интернализирующийся после связывания с рецептором. Вдобавок ЭФР не обладает иммуногенностью по отношению к организму-хозяину. Альфа-фетопротеин (АФП) является онкофетальным белком, который широко используется в качестве векторной молекулы, поскольку его рецептор избирательно экспрсссируется в различных типах опухолей. Ряд других векторных агентов с небольшой молекулярной массой, включая трансформирующий фактор роста (ТФР-сс) и лактоферрин, также связывается преимущественно с опухолевыми мишенями.
Подчеркнутые выше проблемы можно преодолеть путем тщательного исследования характеристик процесса конъюгации, которые ведут к улучшению доставки и избирательности конъюгированного препарата. Оно включает выбор вектора, природы связи между фармакологическим агентом и вектором и улучшение понимания механизмов высвобождения лекарства внутри клетки.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Главной целью исследования являлось получение конъюгатов биологически активных пептидов и белков с подходящими химиопрепаратами, обладающими противоопухолевой активностью, для создания эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Изучение свойств пептидных и белковых векторов с точки зрения сродства к раковой клетке.
Получение выбранных пептидов и белков из различных биологических источников или химическим синтезом.
Изучение противоопухолевых и структурных свойств ряда противоопухолевых антибиотиков с оценкой пригодности для синтеза конъюгатов.
Изучение различных методов синтеза конъюгатов с применением ряда конденсирующих агентов и выбор оптимального метода.
Синтез ряда конъюгатов и изучение их биологических свойств.
Изучение противоопухолевой активности полученных препаратов напровленного действия.
