Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные методы масштабируемого концентрирования и очистки антигенных компонентов бактериальных клеток (обзор литературы) 12
1.1. Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей 12
1.2. Оборудование для концентрирования и очистки антигенных компонентов бактериальных клеток 25
1.3. Характеристика О-антигена холерного вибриона и методы его выделения, концентрирования и очистки в производстве профилактических и диагностических препаратов 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
ГЛАВА 3. Аппаратурное обеспечение исследований по внедрению масштабируемых ультрафильтрационных методов в производстве холерных вакцин 58
3.1. Разработка стенда для концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей 58
3.2. Создание схемы обвязки ультрафильтрационных модулей для проведения процессов диализа и диафильтрации концентратов антигена 71
ГЛАВА 4. Разработка технологической схемы получе ния О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационного оборудования 81
4.1. Разработка и оптимизация методических приемов концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона для получения полуфабриката О-антигена 81
4.2. Использование ультрафильтрационных модулей для ускоренного диализа и диафильтрации концентратов О-антигена 91
4.3. Технологичность и экономическая эффективность использования ультрафильтрационных модулей для проведения процессов концентрирования и диализа О-антигена 96
ГЛАВА 5. Сравнительное изучение препаратов О-антигена и таблетированной холерной вакцины, полученных с помощью ультрафильтрации и традиционной технологии 105
5.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств и серологической активности О-антигенов, полученных различными способами 105
5.2. Иммунобиологические свойства бивалентной химической табле-тированной холерной вакцины, полученной с использованием новых технологических приемов 109
Заключение 115
Выводы 126
Список литературы 128
- Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей
- Характеристика О-антигена холерного вибриона и методы его выделения, концентрирования и очистки в производстве профилактических и диагностических препаратов
- Разработка стенда для концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей
- Разработка и оптимизация методических приемов концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона для получения полуфабриката О-антигена
Введение к работе
Актуальность темы. В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения [182]. В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории. Разработана и запатентована таблетированная вакцина против 0139 сероварианта холерного вибриона [13]. Таблетированная холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования и современных методических подходов к масштабируемой биосепарации, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.
Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электрокоагуляции, мембранной фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрации биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащен растворённым веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продукт [30]. Основными преимуществами методов, использования модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравнительно малом объёме, регенерация волокон обратным током жидкости в модулях, высокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантами.
При глубинном культивировании холерного вибриона значительное количество О-антигена спонтанно освобождается в окружающую среду. [158], что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток [20]. Была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [11, 12, 14, 15], однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию производства холерных вакцин в производстве ограниченно используется метод диализа препарата О-антигена на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте "Микроб" [80]. Однако эти модули имеют невысокую площадь фильтрации (порядка 0,6 м), громоздки и использование их ограничено определённой номенклатурой мембран.
В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г. Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации и диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4м2. Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон: с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского назначения (гемодиализ и гемофильтрация) [9].
Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.
Цель работы заключается в разработке масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.
Задачи исследования: 1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.
2- Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах.
3- Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.
4- Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.
5- Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученные традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.
6- Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии.
?• Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.
Научная новизна
Впервые изучены физико-химические и биохимические свойства растворов О-антигена холерного вибриона при масштабируемых процессах ультрафильтрации, диафильтрации и диализа. Впервые, на основе изучения коллоидной структуры и физико-химического состояния растворов О-антигена холерного вибриона, разработаны оптимальные режимы ультрафильтрации данного компонента холерных вакцин. Впервые даны адсорбционные характеристики препаратов О-антигена холерного вибриона в отношении различных фильтрующих основ полых волокон и определены параметры образования вторичного фильтрационного слоя на поверхности данных материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблетированного препарата вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.
Практическая значимость
Разработана, смонтирована и введена в эксплуатацию установка с применением стандартных промышленных ультрафильтрационных модулей на полых волокнах для эффективного использования в технологиях производства медицинских иммунобиологических препаратов. Созданная универсальная ультрафильтрационная установка внедрена в производство сертифицированных препаратов - холерных вакцин. Использование концентрирования, диализа и диафильтрации на полых волокнах растворов О-антигена холерного вибриона позволило существенно снизить количество дорогостоящего сульфата аммония, применяемого для очистки О-антигена, проточной воды и электроэнергии, существенно уменьшить трудозатраты на осуществление данного этапа производства, а также повысить качество конечного продукта за счет получения более очищенной фракции О-антигена.
Внедрение метода диализа и диафильтрации О-антигена холерного вибриона на этапе его освобождения от сульфата аммония, позволяет, благодаря большой площади полых волокон в ультрафильтрационном волоконном аппарате существенно сократить время на проведение процесса диализа и исключить рутинные малоэффективные регламентные методы.
Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП - ГИСКе им. Л.А.Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНРШЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л.А.Тарасевича 26.11.2002 г.
Разработанные технологии внедрены в производство, для чего составлены и утверждены стандартные операционные процедуры на каждом этапе использования нового оборудования.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов для масштабируемого концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген.
2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена.
3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной диафильтрации раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с использованием ультрафильтрационных аппаратов.
4. Препараты О-антигена, полученные по новой технологии, соответствуют требованиям действующей нормативной документации, обладают большей серологической активностью и в своем составе сохраняют набор ферментов холерного вибриона.
5. Использование ультрафильтрационного метода в производстве холерных вакцин технологично и экономически эффективно за счет уменьшения количества расходных материалов, снижения энерго- и трудозатрат.
6. Экспериментально-производственные серии вакцины, полученные с помощью ультрафильтрации, при контрольной проверке по показателям качества соответствовали действующим требованиям фармакопейной статьи предприятия и регламенту производства на «Вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную».
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно - практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно -практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицинского университета "Окружающая среда и здоровье" (Саратов, 2002); на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону,2003 г.); на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ "Микроб" в 2000, 2002 и 2003 годах.
Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб».
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков 9 таблиц. Список литературы содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных.
Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей
В процессе разделения растворов с помощью полупроницаемых мембран, если размеры пор меньше размеров макромолекул, через мембрану преимущественно проходит растворитель. При этом концентрация растворённого вещества в пограничном слое у поверхности мембраны увеличивается. Повышение концентрации происходит до тех пор, пока под действием возникающего градиента концентраций растворённого вещества между поверхностью мембраны и объёмом раствора не установится динамическое равновесие. Явление образования у поверхности мембран пограничного слоя, в котором концентрация растворённого вещества больше, чем в основном объёме раствора, получило название концентрационной поляризации [98, 117]. Влияние концентрационной поляризации на динамические характери- t. стики мембран отрицательно, так как при этом вследствие увеличения осмотического давления раствора снижается движущая сила процесса разделения. Кроме этого возможно выпадение в осадок и осаждение на мембране трудно растворимых солей, гелеобразование высокомолекулярных соединений, что влечёт за собой чистку или замену мембраны [24].
При разделении растворов применяются ячейки с хлорсеребряными микроэлектродами, расположенными на строго определённом расстоянии, от поверхности мембраны. К недостаткам измерения концентрационной поляризации микроэлектродами относится влияние самих микроэлектродов на поток, сложность их изготовления и необходимость экранирования металлических частей. Указанных недостатков лишены оптические методы определения концентрационной поляризации [24, 42]. Эти методы позволяют изучать поляризационный слой, не нарушая его структуры. Однако интерферо-метрический метод с применением оптических квантовых генераторов (лазеров) в случае сравнительно высокой концентрации разделяемого раствора не позволяет исследовать распределение в слое концентрационной поляризации вследствие искривления светового пучка при прохождении через раствор. Применение лазеров ограничено также при большом градиенте концентраций в тонком пограничном слое. Преимуществом оптических методов является высокая разрешающая способность и возможность визуального наблюдения за пограничным слоем [91, 170]. Одним из перспективных экспериментальных методов измерения концентрационной поляризации, основанных на исследовании массообмена на границе раздела фаз жидкость - твёрдое тело, является электродиффузионный метод [28, 53, 66, 92, 154]. Выбор того или иного метода зависит от ряда факторов: конструкции мембранного аппарата, свойств мембраны, стоимости готового продукта, производительности установки.
К основным методам снижения концентрационной поляризации можно отнести следующие. Турбулизация разделяемого раствора приводит к увеличению проницаемости и селективности мембраны вследствие снижения концентрации растворённых веществ в пограничном слое [29, 110]. При разделении растворов веществ с большой молекулярной массой применяют мембраны с порами большего диаметра, чем при разделении низкомолекулярных веществ, что приводит к необходимости использования больших скоростей конвективного потока для повышения скорости ультрафильтрации, а тем более и микрофильтрации. Для этого необходимо интенсивно перемешивать раствор или прокачивать его с большой скоростью над мембраной. Более рационально применять жестко закреплённые турбулизирующие вставки. Эти вставки состоят из центрального опорного стержня, на котором закреплены диски, лопасти, шары или различные проволочные спирали [32]. Концентрационную поляризацию можно значительно снизить, создавая пульсирующий поток [87, 130]. Применяются аппараты с узкими каналами, где высокая удельная поверхность мембран позволяет иметь высокую производительность при небольших габаритных размерах аппарата. В них используют ламинарный режим движения разделяемого раствора [30, 34, 131, 132].
С повышением температуры разделяемого раствора уменьшается вязкость, увеличивается коэффициент диффузии растворённого вещества, снижается концентрационная поляризация. Однако, с повышением температуры сокращается срок службы полимерных мембран, что обусловлено существенным возрастанием скорости их гидролиза. При температуре 60-70 С аце-татцеллюлозные мембраны необратимо теряют свои полупроницаемые свойства. Кроме того, при этом возможна коагуляция белковых компонентов вакцин и сывороток, разрушение термолабильных ферментов.
Если в разделяемом растворе находятся коллоидные частицы, то они, осаждаясь, снижают проницаемость мембраны. Коллоидные частицы, так же как и молекулы полиэлектролитов несут электрический заряд. Причём, при рН 8 они обычно заряжены отрицательно, в этом случае мембрана с отрицательным зарядом будет отталкивать частицы. Такой же эффект можно получить, если к мембране подвести электрический заряд одного знака с зарядом частицы в растворе. Возможно также уменьшение концентрационной поляризации за счёт воздействия ультразвука на пограничный слой в процессах ультрафильтрации и микрофильтрации [67, 68].
При проведении мембранных процессов, в результате концентрационной поляризации, на поверхности мембраны образуется слой слаборастворимых солей (обратный осмос), гель (ультрафильтрация), осадок микрочастиц (микрофильтрация). Все факторы, влияющие на образование вышеперечисленных осадков, образующихся на поверхности мембраны, требуют предварительной очистки исходного раствора [44, 90, 149, 150]. Методы очистки мембран и методы предварительной очистки разделяемых растворов зависят от степени и вида загрязнений исходного раствора, типа аппарата и мембранного процесса, требований к качеству фильтрата. Условно их можно разделить на механические, гидродинамические, физические и химические. [98, 157]. Перечисленные методы очистки мембран позволяют в той или иной мере восстановить их характеристики [26, 171, 176]. Селективность мембран зависит от термодинамических характеристик раствора, теплоты, гидратации ионов в растворе, заряда частиц. Селективность определяется соотношением размеров пор мембраны и гидратированных ионов растворённых веществ или частиц суспензии. Таким образом, силы взаимодействия разделяемых веществ с полимерными мембранами могут меняться в широких пределах. Слабое взаимодействие имеет место, например, при проницаемости через мембрану газа, которое в основном определяется диффузией. Этим объясняются небольшие отличия в скорости проницаемости различных газов через однотипные полимерные мембраны. Скорость же проницаемости через различные по свойствам полимеры, например политетрафторэтилен, полидеми-тилсилоксан, полиэтилен, различные эфиры целлюлозы, может отличаться на пять порядков [112, 131, 133, 174]. Такая большая разница в скорости проницаемости обусловлена различиями в подвижности и гибкости полимерных цепей, которые в свою очередь связаны с полярностью и размерами молекул, а задерживающая способность ультрафильтрационных мембран характеризуется номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) [39, 95, 104, 178].
Характеристика О-антигена холерного вибриона и методы его выделения, концентрирования и очистки в производстве профилактических и диагностических препаратов
Среди диарейных заболеваний человека холера занимает особое положение, являясь наиболее тяжелым инфекционным токсикозом. По данным ВОЗ, в настоящее время регистрируется от 20 тыс. до 50 тыс. случаев заболеваний ежегодно. В связи с этим профилактика и диагностика холеры остаётся актуальной. В документах ВОЗ (1991, 2001), было заявлено о необходимости совершенствования специфической профилактики холеры путем создания новых оральных вакцин.
Одним из основных направлений в разработке средств иммунопрофилактики инфекционных заболеваний, в том числе и холеры, является создание химических вакцин. Выделение специфических фракций антигенов, ответственных за иммунологическую перестройку, и освобождение их от бал- ластных веществ, обеспечивает возможность использования комбинации различных антигенов в оптимальных соотношениях [16, 40, 57, 97, 120, 129].
В институте "Микроб" разработаны и внедрены в производство две химические вакцины из штаммов возбудителя холеры 01 серовара для парентерального и орального применения [18, 20]. Создание химических вакцин проводили, исходя из положения, что заболевание холерой обусловлено комплексом факторов патогенности холерного вибриона, играющих определенную роль в инфекционном процессе, в связи с чем в полноценной специфической вакцине все известные факторы патогенности возбудителя должны быть представлены максимально полно с сохранением их структуры и в оптимальном для создания иммунитета количестве. Поэтому предложенные химические вакцины содержат анатоксин холерогена, О-антиген, комплексы внеклеточных ферментов вибрионов. Совершенствование методов иммунопрофилактики холеры тесно связано с углубленным изучением антигенов микробной клетки, которые играют важную роль в индукции иммунного ответа.
Токсины холерного вибриона подразделяются по локализации на экзотоксины, продуцируемые во внешнюю среду, и эндотоксины, более прочно связанные с микробной клеткой. Эндотоксин, или О-антиген является основным термостабильным антигеном холерного вибриона, на его долю приходится до 90 % от веса клеточной стенки микроба. Для холерных вибрионов характерно образование большого количества О-антигена, служащего основным структурным компонентом клеточной стенки [2, 52, 54, 62]. О-антиген холерного вибриона представляет собой липополисахаридобелковый комплекс, определяет серологическую специфичность вибрионов и лежит в основе всех предложенных классификаций [2, 5, 8, 99, 138, 152]. Он расположен на поверхности клетки вибриона, определяет его родовую, видовую и типовую специфичность и изменяется при переходе из S в RO и R-формы [3]. Во внешнюю среду О-антиген (эндотоксин) холерного вибриона попадает не только за счет автолиза клеток, но может активно выделяться при росте живыми микроорганизмами [158].
О-антиген V.cholerae является типичным для грамотрицательных бактерий. Согласно современным представлениям, препараты ЛПС, выделенные из различных грамотрицательных бактерий, являются сложными гли-колипидами, состоящими из гетерополисахаридной части и липида А, который ковалентно, через 2-кето-З-дезоксиоктоновую кислоту (КДО), связан с центральной полисахаридной цепью [6, 38, 47, 48, 49, 54, 139, 140, 168]. Углеводная часть молекулы подразделяется на две различные зоны: так называемый кор и О-специфическую боковую полисахаридную цепь. Такая структура ЛПС характерна для большинства встречающихся в природе диких штаммов бактерий, образующих колонии гладкой формы (S-форма). Напротив, микроорганизмы, дающие колонии шероховатой формы (R-форма) и являющиеся природными или искусственно полученными R- мутантами, продуцируют ЛПС, для которого типичным является полное отсутствие поли-сахаридной цепи или ее присутствие в очень незначительных количествах. Указанная форма продуцирует недостроенный ЛПС, состоящий из центральной цепи полисахарида и липида А [3, 23, 38, 54, 82, 83].
Давая краткую характеристику составных частей ЛПС, необходимо отметить, что О-специфические боковые цепи являются носителями О-антигенной специфичности и состоят из повторяющихся звеньев, содержащих гексозу, галактозу, маннозу, рамнозу, абеквозу, глюкозамин [49, 168, 169]. Каждое изменение в структуре этих цепей приводит к новой серологической специфичности в молекуле. Количество олигосахаридных звеньев может варьировать от 0 до 50 [48, 156], О-специфические цепи характеризуются вариабельностью состава и структуры, что является причиной гетерогенности ЛПС и О-антигенной изменчивости.
Состав и структура олигосахаридных звеньев зависит и от формы бактерий. Так, в S-форме присутствуют молекулы с различной длиной полиса-харидной цепи, R-формы обычно лишены полисахаридных цепей, а молекула SR-формы представлена одним повторяющимся звеном [38, 46, 81, 172]. Гетерогенность ЛПС может быть наглядно продемонстрирована с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии детергента [62, 134, 156]. Относительное содержание различных типов молекул в препаратах ЛПС зависит от условий выращивания микроорганизма (температуры, продолжительности, среды), а также от метода выделения [84, 103, 181]. Контроль за гетерогенностью препаратов ЛПС, полученных различными методами экстракции, представляется чрезвычайно важным при биологических исследованиях, так как свойства ЛПС, такие, как например, протективная и серологическая активность, могут в значительной степени зависеть от относительного содержания молекул S-формы и длины цепи О-антигена. [3, 19, 52, 65,84].
Центральный полисахарид или кор представляет собой относительно консервативную часть молекулы ЛПС и является гетерополисахаридом, включающим до 11 моносахаридных остатков и состоит из двух структур, отличающихся по своему строению [6, 38, 49, 54, 139, 140]. Первая представляет разветвленный пентасахарид, построенный из остатков D-глюкозамина, глюкозы и галактозы. Вторая содержит Ь-глицеро-D-манногептозу, 2-кето-3-дезокси-0-манно-октоновую кислоту (КДО) [22, 105]. Кор оказывает существенное влияние на проявление биологических свойств липида А, что связано с увеличением подвижности углеводородных цепей жирных кислот, облегчающих принятие биологически активной конформа-ции, или со стабилизацией кором этой активной конформации [105, 166, 168]. Кор ЛПС 01 V.cholerae содержит 1 моль глюкозы, 0,1-0,2 моль глюко-замина и 3 моль гептозы [129]. В настоящее время установлено, ЛПС холерных вибрионов содержит в своем коре одну единицу КДО 5-фосфат [105, 139, 140].
Разработка стенда для концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей
К ультрафильтрационному оборудованию, предназначенному для концентрирования антигенных компонентов культур микроорганизмов, предъявляются следующие требования: герметичность трубопроводов обвязки ультрафильтрационных модулей, вспомогательного оборудования (насос, ротаметр, соединяющие шланги) и сосуда для сбора концентрата в диапазоне давления от 25 до 195 кПа. Оборудование, контактирующие с биологической жидкостью, должно выдерживать обработку химическими дезинфек-тантами (водными растворами: 6% хлорамином, 5 % перекисью водорода, 1% муравьиной кислотой, 2 % формалином, 5 % аммиаком) без образования коррозии [148].
Проведенный литературный и патентный поиск, а также изучение рынка ультрафильтрационных материалов, позволили нам выбрать стратегию научных исследований по совершенствованию технологии получения холерных вакцин и определить наиболее рентабельные материалы и оборудование для использования в этих целях. Наиболее приемлемыми по цене, доступности и диапазону исключения биомолекул оказались отечественные ультрафильтрационные аппараты на полых волокнах марки УВА-ПС-20-1040 (РисЛ). Внутри корпуса модуля проходит пучок полых волокон из ароматического полиамида (полисульфона) (1). На корпусе установлены четыре штуцера, два для отвода фильтрата (2) расположены по продольной оси корпуса и крепятся двумя накидными гайками с прокладками из силиконовой резины. Два штуцера (3) расположены на одной боковой стороне корпуса, вварены в него, один служит для входа препарата, второй для выхода концентрата.
Пропускная способность пор полых волокон по молекулярной массе белков составляет 20 кДа. Проведённые исследования поперечного разреза полого волокна на электронном микроскопе показали, что внутренний диаметр волокна составлял 0,2 мм, диаметр ультрапор от 50 до 100 ангстрем (Рис. 2). На рис. 3 показана микрофотография полого волокна фирмы "Ами-кон" выполненная на сканирующем электронном микроскопе [10]. Выбранные нами модули УВА-ПС-20-1040 выпускаются Государственным предприятием Всероссийским научно-исследовательским институтом полимерных волокон (ГП ВНИИПВ) (г.Мытищи, Московской области).
На первом этапе работы был создан опытный вариант установки для концентрирования формалинизированного центрифугата (культуральной жидкости) О-антигена холерного вибриона производственного Штамма М-41 Огава (Рис.4). Ультрафильтрационная установка состояла из ультрафильтрационного волоконного аппарата марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч (1); баллона с газообразным азотом вместимостью 40 л (2); регулятора давления азота марки БКО-54-4 (3); реактора (ферментёра) объёмом 630 л (4); насоса с магнитным приводом (5); ротаметра (6) и приёмной ёмкости для фильтрата (7). Обвязка вышеназванной установки выполнена по общепринятым требованиям, предъявляемому к оборудованию, применяемому в микробиологической промышленности [45].
Забор и циркуляция формалинизированного центрифугата культуры холерного вибриона из реактора в ультрафильтрационный аппарат осуществляется шиберным насосом с магнитным приводом марки НШМП. По шкале ротаметра, установленного перед входом в ультрафильтрационный модуль, измеряли скорость протока формалинизированного центрифугата.
В ультрафильтрационном модуле проходящий по наружной стенке полых волокон поток разделяется на две части, сквозь поры полых волокон проходит фильтрат с низкомолекулярными белками, а концентрат возвращается в реактор. В реакторе с помощью азота создается давление 25 кПа. Азот удобен в связи с большой химической инертностью, он не вступает в реакции с биомолекулами, не дает вспенивания, мало растворим в воде и других органических жидкостях и, подаваемый под давлением, увеличивает скорость потока фильтрата через поры полых волокон [76, 79].
Одним из оптимальных путей решения конструктивной проблемы получения фильтрата в процессе концентрирования формалинизированного центрифугата явилось вертикальное размещение ультрафильтрационного аппарата для отвода фильтрата одним штуцером.
Циркуляцию центрифугата препарата осуществляли насосом с магнитным приводом. Отказ от насоса с сальниковым уплотнением обусловлен их низкой герметизацией и сложностью эксплуатации. Решение использования магнитного привода связано с абсолютной герметичностью соединения насоса с электродвигателем. Разработанный в технологическом отделе института «Микроб» магнитный привод представляет собой конструкцию, состоящую из шести ведущих и шести ведомых магнитов, пустотелого стакана из нержавеющей стали, внутри которого размещён ротор с ведущими магнитами. Ротор механически связан с валом электродвигателя. Обойма с ведомыми магнитами вращается на двух фторопластовых подшипниках, укреплённых на внутренней поверхности стенок самого насоса. Изоляция ведомых магнитов от центрифугата и химических дезинфектантов осуществлена путём заключения их в стакан из нержавеющей стали марки 12Х18Н10Т с герметизацией по торцам электролучевой сваркой. Шесть шиберных лопаток из нержавеющей стали образуют качающую турбину насоса. Крепёж насоса к электродвигателю осуществляется резьбовой гайкой, разъединяющей электродвигатель и насос для стерилизации последнего в автоклаве. Данная конструкция насоса с магнитным приводом обеспечивает подачу центрифугата в ультрафильтрационный модуль, обеспечивая устойчивую работу в диапазоне от 1,7 л/мин., до 4,2 л/мин.
Ротаметр марки РС-250 служит для определения скорости прохождения раствора препарата по значениям делений на трубке шкалы, где 100 ед соответствует 1,7 л/мин, 150 ед - 2,4 л/мин, 200 ед - 3,2 л/мин, 250 ед - 4,2 л/мин. Трубка ротаметра изготовлена из молибденового стекла. Штуцеры входа и выхода выполнены из фторопласта с прокладками из силиконовой резины, измерительный поплавок из нержавеющей стали. Все детали ротаметра выдерживают обработку рекомендованными выше химическими де-зинфектантами. Данная конструкция и градуировка шкалы ротаметра, его установка обеспечивают объективный контроль подачи центрифугата на ультрафильтрационный модуль на этапе концентрирования.
В качестве сосуда для концентрирования О-антигена, находящегося в центрифугате, и его сбора после разделения в ультрафильтрационном модуле нами был выбран реактор (ферментёр) марки РЗРЯ- 6/630. Объём ферментера равный 630 л, наличие входов и выходов трубопроводов в полости сосуда конструктивно удовлетворяли схеме функционирования ультрафильтрационного модуля.
Разработка и оптимизация методических приемов концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона для получения полуфабриката О-антигена
В производстве холерных вакцин при диализе полуфабриката О антигена после осаждения его из культуральной жидкости сульфатом аммо ния используют для удаления солей аммония диализ в целлофановых ме шочках или аппарат для диализа типа «искусственная почка». Недостатками этих методов является длительность диализа за счет малой площади поверх ности мембран, большой расход проточной воды, одноразовое использова ние мембран и целлофана. На современном этапе эти способы обессоливания в производстве существенно устарели и являются малоэффективными. / В настоящее время отечественной промышленностью разработан ши- рокий ассортимент модулей на полых волокнах на основе ароматического , полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтра- 1 ции и диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. Полые волокна, аналогично мембранам, также действуют по принципам молекулярного сита, однако обладают по сравнению с ними рядом преимуществ, обу 92 словленных увеличением площади фильтрации за счет увеличения соотношения между площадью поверхности волокон и их объемом. Целью выполнения данного раздела явилась разработка оптимальной технологической схемы диализа компонентов холерной вакцины с использованием ультрафильтрационных модулей. На первом этапе работы нами была разработана и испытана схема диализа компонентов бивалентной таблетированной вакцины с использованием ультрафильтрационного модуля на полых волокнах марки УВА-ПС-20-1040 с рабочей площадью волокон Зм2, пропускной способностью по молекулярной массе 20 кДа и выходу дистиллированной воды по фильтрату 415 л/ч. На данном модуле при работе использовали принцип искусственной почки и обратного осмоса.
Схема диализной установки представляет собой сборную конструкцию (схема приведена в главе 3), состоящую из бачка, в который помещается препарат О-антигенсодержащей фракции, ультрафильтрационного модуля, насоса с магнитным приводом и блоком электропитания для циркуляции препарата, двух ротаметров, фиксирующих показание расхода объёма диали-зующей воды и прохождения объёма диализуемого препарата. Проточная кювета с ионоселективными электродами PNH4+ и pNa + позволяет получать данные о концентрации ионов аммония в протоке диализуемого препарата по откалиброванной в милливольтах (от 90 до - 22) шкале универсального иономера марки ЭВ-74. В схеме конструкции диализной установки установлен фильтр для очистки проточной диализующей воды от механических примесей, 40-литровый баллон с газообразным азотом и понижающим редуктором для выравнивания давлением азота осмотического давления диализующей воды и раствора диализуемого препарата.
Испытание данной схемы проводилось на препарате О-антигенсодержащей фракции штамма М-41 Огава, в количестве 700 г сырого осадка, который согласно регламенту производства вакцины перед диализом развели в дистиллированной воде до 3,7 л и поместили в бачок. Далее препарат подавался в ультрафильтрационный модуль на наружную сторону пучка полых волокон. Диализующая проточная вода подавалась внутрь пучка по-лых волокон. Из препарата катионы NFL» и анионы S04 " диффундировали в проточную диализующую воду. Раствор препарата проходил через кювету с ионоселективными электродами, по шкале иономера контролировался процесс обессоливания. Кроме того, процесс обессоливания препарата контролировался по реакции с реактивом Несслера. Насыщение препарата водой происходит до полного обессоливания. Чтобы исключить значительное насыщение препарата диализующей водой, в бачок с препаратом подавался азот под давлением 10 кПа, выравнивая разницу давления концентрационного градиента между проточной водой и препаратом. Диализ О-антигенсодержащей фракции прошел за 6 ч. Далее полуфабрикат вакцины стерилизовали и подвергали лиофильной сушке в соответствии с регламентом производства.
Известно, что повысить скорость обессоливания раствора можно за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем. Этот метод называется диафильтрацией.
При непрерывном методе диафильтрации биологические препараты при обессоливании находятся в постоянном рабочем объёме, поскольку удаляемый фильтрат непрерывно замещается свежим растворителем. При этом концентрация задержанных мембраной веществ не возрастает, так как они непрерывно разбавляются свежим буферным раствором. Намного более высокая эффективность диафильтрации для обессоливания объясняется тем, что в данном случае движущей силой является не концентрационный градиент, а гидростатическое давление [10].
Установка и вспомогательное оборудование для диализа методом диафильтрации в непрерывном режиме была собрана на базе однотипного модуля и оборудования, применённого в предыдущем эксперименте по диализу с небольшими изменениями. В конструкцию установки мы включили реактор, достаточный объём которого (630 л), вход и выход трубопроводов арматуры конструктивно удовлетворяли схеме дозированной подачи дистиллированной воды в бачок с препаратом, заменяя объём растворителя, уходящий в фильтрат с сульфатом аммония. Наличие паровой рубашки у реактора позволяло стерилизовать дистиллированную воду в реакторе для диализа. Баллон с газообразным азотом, объёмом 40 л и понижающим редуктором для создания в реакторе азотом давления 0,5 атм., гидростатическим давлением увеличивал скорость выхода в фильтрат растворителя (воды) через поры полых волокон [76, 79].
Для апробации диализа данным методом был использован препарат О-антигенсодержащей фракции штамма 569В Инаба. Препарат в количестве 513 г сырого осадка, разведенный в 2,5 л дистиллированной воды поместили в бачок, из которого он поступал в ультрафильтрационный модуль по наружной стенке пучка полых волокон. Через ультрапоры внутрь полых волокон проходил растворитель, содержащий сульфат аммония, сливаясь через штуцер выхода фильтрата. Препарат в бачке разбавлялся подаваемой гидростатическим давлением азота дистиллированной водой из реактора. Диализ О-антигенсодержащей фракции прошел за 22 ч, было израсходовано 62 литра дистиллированной воды. Затем препарат подвергался дальнейшей обработке, стерилизации и лиофильной сушке.
