Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Препараты иммуноглобулинов 9
1.2. Методы фракционирования плазменных белков 13
1.2.1. Разделение белков путем адсорбции 13
1.2.2. Разделение белков путем осаждения 18
1.2.3. Методы получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, М, А 25
Глава II. Материалы и методы исследований 28
II. 1. Материалы 28
II.2. Методы 28
II.2.1. Количественное определение содержания классов иммуноглобулинов 28
II.2.2. Определение молекулярного состава исследуемых препаратов методом колоночной гель-хроматографии 29
II.2.3. Определение электрофоретической однородности белков методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы 30
II.2.4. Определение общих липидов 30
II.2.5. Определение белкового состава исследуемых препаратов методом иммуноэлектрофореза 31
II.2.6. Определение содержания белка, показателей цветности, прозрачности 31
II.2.7. Определение активности плазминогена 32
II.2.8. Определение уровня антител 33
II.2.9. Определение пирогенности, токсичности 34
II.2.10.Методы статистической обработки 34
Глава III. Результаты и их обсуждение 35
III. 1. Разработка комплексной технологической схемы выделения иммуноглобулинов с целью максимального использования иммунологического потенциала плазмы крови .35
III. 1.1. Распределение иммуноглобулинов по фракциям в процессе спиртового метода фракционирования плазмы крови человека 35
III. 1.2. Усовершенствование технологии спиртового фракционирования плазмы крови в процессе получения высокоочищенных препаратов иммуноглобулинов
для внутримышечного введения 46
III. 1.3. Технологические аспекты дополнительного извлечения иммуноглобулина G из осадка Б 62
III. 1.4. Разработка метода получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, IgM и IgA 69
III.2. Характеристика полученных препаратов иммуноглобулинов 77
III.2.1. Физико-химические и биологические свойства иммуноглобулина для внутримышечного введения 77
III.2.2. Характеристика иммуноглобулина G, выделенного из осадка Б 82
III.2.3. Показатели качества комплексного иммуноглобулинового препарата, содержащего IgG, IgA, IgM 87
Заключение 92
Выводы 101
Список литературы 103
- Разделение белков путем адсорбции
- Методы получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, М, А
- Распределение иммуноглобулинов по фракциям в процессе спиртового метода фракционирования плазмы крови человека
- Технологические аспекты дополнительного извлечения иммуноглобулина G из осадка
Введение к работе
Необходимость разработки комплексных методов выделения иммуноглобулинов из плазмы крови человека диктуется медицинской и экономической целесообразностью. Это обусловлено тем, что клиническая практика требует расширения спектра препаратов антибактериальной и антивирусной направленности, активными компонентами, которых являются иммуноглобулины. Известно, что антивирусные и антитоксические антитела содержатся в IgG и IgA, в то время как антибактериальные антитела, в основном, в иммуноглобулинах класса М (32, 120, 122, 162). Выделение комплекса белковых препаратов увеличивает возможность повышения выходов производимых продуктов из такого дорогостоящего и уникального сырья, каким является плазма крови человека.
Для получения иммуноглобулинов для внутримышечного введения класса G используют, в основном, метод фракционирования с помощью этанола при низких температурах. Несмотря на многолетний опыт производства этих препаратов, остается не решенным целый ряд проблем, связанных с технологией производства и качеством препаратов. Технология основного фракционирования позволяет выделять не более 60% этого белка, содержащегося в исходном сырье. Ранее этот показатель был выше, проводилось дополнительное извлечение IgG. Однако, клиническое применение таких препаратов было запрещено, так как они не удовлетворяли требованиям по степени очистки от денатурированных белков и протеолитических ферментов; в процессе хранения препаратов изменялись физические свойства, резко увеличивалось содержание фрагментированных молекул IgG, в части серий был обнаружен HBsAg (20, 29). Наличие примесей различных белков, включая иммуноглобулины других классов, даже в препаратах полученных в процессе основного фракционирования не желательно, так как установлено, что только IgG способен проникать через интерстициальное пространство. Примеси, по мень-
шей мере, являются балластом и депонируются в мышечной ткани до разрушения их протеолитическими ферментами (138), а в ряде случаев они вызывают побочные реакции (10, 40, 41, 45, 48, 57, 67, 70, 71, 113, 139). Поэтому существует необходимость дополнительной очистки препаратов иммуноглобулинов (103). Стандартные препараты содержат преимущественно иммуноглобулины класса G. В большинстве производств иммуноглобулины классов А и М теряются в процессе фракционирования, а там где их выделяют, метод получения обособлен от основной схемы спиртового фракционирования. Становится очевидной необходимость разработки комплексной технологии фракционирования, позволяющей в едином технологическом процессе выделять дополнительно IgG и иммуноглобулины других классов.
Поэтому, создание условий максимального выделения высокоочищенных иммуноглобулинов разных классов является актуальной задачей.
Цель исследования - создание комплексной технологической схемы выделения высокоочищенных иммуноглобулинов из плазмы крови человека.
Задачи исследования:
Изучить распределение иммуноглобулинов по стадиям спиртового фракционирования.
Разработать специальные методы очистки препаратов IgG от белковых примесей.
Разработать технологию дополнительного извлечения вирусинактиви-рованного IgG.
На основе сравнительной оценки различных способов разработать метод получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgM для пе-рорального применения.
Изучить физико-химические и биологические свойства полученных препаратов иммуноглобулинов.
Научная новизна
На основании изучения распределения классов иммуноглобулинов по фракциям плазмы крови человека, взаимодействия различных белков в процессе спиртового метода фракционирования и оценки состава препаратов разработана комплексная технология получения высокоочищенных иммуноглобулинов, позволяющая дополнительно выделять IgG, IgA и IgM из плазмы, включающая:
а) Изменение условий основного процесса фракционирования на стадии
отделения IgG от Р-глобулинов. Показано, что проведение процесса в усло
виях, близких к изоэлектрической точке белковых примесей при рН 5,35-5,4,
вместо 5,1-5,2, концентрации этанола 17% вместо 13% приводит к дополни
тельной очистке IgG от протеолитических ферментов, липидов и денатури
рованных белков. Новые элементы технологии вошли в патент на изобрете
ние «Способ получения иммуноглобулинового препарата» № 2183971 при
оритет от 07.09.00 г. и «Способ получения иммуноглобулинового препарата»
№ 2192279 приоритет от 07.09.00 г.
б) Метод дополнительного извлечения IgG из неиспользуемых осадков Б.
Он включает получение IgG спиртовым методом и дополнительное пере
осаждение иммуноглобулина со стадией отделения примесей в условиях их
изоэлектрической точки. На способ получения иммуноглобулинового препа
рата получен патент № 2192280 приоритет от 10.11.02 г.
в) Метод выделения комплекса иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgM,
включающий очистку иммуноглобулинов из фракции III от примесей, в том
числе и от липидов, выделение и концентрирование этанолом, стабилизацию
полученного препарата в растворе глицина при рН 4,0-5,0. На способ полу
чения и состав препарата получен патент №2158137 приоритет от 27.10.00 г.
и решение о выдаче патента по заявке №2001120387/(021553) от 20.07.2001 г.
Практическая значимость
Полученные в работе экспериментальные данные внедрены в производство иммуноглобулинов Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов. Они включены в:
Регламент производства иммуноглобулина человека нормального для внутримышечного введения №1049-00, утв. 9.11.2000 г.
Изменения №1 к РП №1049-00 (для производства иммуноглобулина человека антистафилококкового жидкого), 10.11.2000 г.
Изменения №2 (для производства иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита), 10.11.2000 г.
Изменения №3 (для производства иммуноглобулина человека противоаллергического жидкого для внутримышечного введения), 5.02.01 г.
Проект изменений к РП для дополнительного извлечения IgG.
Проект регламента производства на Комплексный иммуноглобулино-вый препарат - ИммуноМАГ.
Изменения, касающиеся содержания белковых примесей, протеолити-ческих ферментов и агрегированных форм белков, внесены в фармакопейные статьи предприятия (ФСП) на:
Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения ФСП 42-0100-1789-01.
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита ФСП42-0100-1317-01.
Проект ФСП на иммуноглобулин человека антистафилококковый жидкий.
Положения, выносимые на защиту
Новые методы очистки препаратов IgG для внутримышечного введения от белковых и липидных примесей.
Технология дополнительного извлечения IgG.
3. Метод получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgM.
Разделение белков путем адсорбции
Селективное разделение белков хроматографическими агентами широко используется в течение многих лет (144). Они включают ионообменные группы на различных типах твердо-фазных матриксов таких как полистерин (148), целлюлоза (37, 111), декстрановые гели (83) и поперечно-сшитая ага-роза (58). Также, стали уделять большое внимание аффинной хроматографии (56), включающей различные типы гидрофильных и некоторые гидрофобные лиганды (85), и гель-проникающей хроматографии на основе молекулярного размера для выделения различных белков, удаления солей или этанола (74).
При использовании адсорбционных методов выделения иммуноглобулинов, в основном, в качестве исходного сырья используют фракцию П+Ш или иммуноглобулины, получаемые спиртовым методом. Методы ионообменной хроматографии основаны на способности ионо-обменников адсорбировать белки сыворотки с определенным зарядом молекулы в зависимости от рН среды. ДЭАЭ-ионообменные матриксы были найдены пригодными для выделения IgG, который отличается от других плазменных белков и не связывается ДЭАЭ-группой при нейтральном рН и низкой ионной силе. Описано несколько методов, которые использовали только ионообменные материалы или в комбинации с осаждением этанолом или солью для выделения очищенного IgG (157). Хроматографические методы выделения IgG имеют следующие положительные стороны. Во-первых, это более высокий выход, который представляет особый интерес при получении гипериммунных препаратов иммуноглобулина; во-вторых, готовый препарат IgG содержит меньше агрегированных молекул (димеров, полимеров), которые могут вызывать нежелательные побочные реакции; в-третьих, более высокая стабильность IgG из-за более низких уровней протеолитических ферментов в конечном препарате.
Норре Н. et al. (88, 89) для выделения анти-D иммуноглобулина использовали ДЭАЭ-сефадекс А-50 методом колоночной хроматографии с последующим осаждением IgG этанолом или концентрированием ультрафильтрацией. Метод Falksveden L. (69) предусматривает использование двух ионо-обменников - ДЭАЭ- и СМ-сефадекса в комбинации с осаждением ПЭГ. Метод с использованием QAE-сефадекса был описан Joustra М. и Lundgren Н. (97), Condie R. (54).
Хроматографический процесс с использованием ДЭАЭ-сефарозы FF, аргинин-сефаррозы 4В, СМ-сефарозы FF, гель-фильтрацией на Сефакриле S-300 для выделения IgG описан Tanaka К. et al. (159). Получение анти-D иммуноглобулина катионообменной колоночной хроматографией с последующей обработкой анионообменной хроматографией и гелем гидроксида алюминия предложено Stucki М. et al. (155).
Lebing W. et al. (101) описывает разработанный метод производства IgG методом хроматографии в промышленном масштабе в корпорации Bayer. Исходный материал - фракция П+Ш. При добавлении к суспензии IgG ка-прилата натрия удаляются липопротеины и инактивируются оболочечные вирусы. Низкая ионная сила IgG-содержащего раствора удобна для проведения хроматографии. Необходимым условием при подборе сорбентов была их совместимость с обработкой каприлатами. Процесс хроматографии включал последовательно выполняемые анионный и катионный обмен. Первая колонна содержала сильный анионообменник Sepharose Fast Flow, связывающий весь альбумин, большую часть IgA, некоторое количество IgM и большинство солей каприловой кислоты. Вторая колонна содержала слабый анионообменник Sepharose Fast Flow, который связывает оставшийся IgM и остальные примеси.
Очистка иммуноглобулинов хроматографией проводится в CSL Bioplasma (Австралия) (38). После выделения из плазмы супернатанта I выполняется делипидирование с использованием аэросила. Установление значения рН 5,2 приводит к изоэлектрическому осаждению некоторых белков. Затем следует хроматографическая очистка с помощью двух анионообменных сорбентов. Первая стадия хроматографии с использованием ДЭАЭ-Sepharose Fast Flow проводится при рН 5,2. При этом альбумин связывается с сорбентом. Иммуноглобулины проходят через сорбент, в результате чего получается неочищенный (приблизительно 85%) иммуноглобулин. В ходе этого процесса из иммуноглобулинов удаляется основная примесь - трансферрин. Затем остаточные примеси удаляются прохождением через колонну MacroPrep HQ при рН 6,5. На этой стадии выделяется высокоочищенный иммуноглобулин и удаляется весь трансферрин и IgA. Одновременно отмечается некоторое обеднение IgG4.
Процесс производства иммуноглобулина в BioProducts Laboratory (117) включает batch-адсорбцию ДЭАЭ-сефадексом фракции II для удаления примесей IgA, IgM, активатора прекалликреина. После этой стадии чистота полученного препарата составляет 100%. Затем следует стадия инактивации вирусов обработкой детергентом и растворителем, после чего IgG связывается с катионообменником - CM Sepharose Fast Flow для удаления остатков детергента и растворителя. Под аффинной хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор обратимо связывающихся с этим лигандом белков (25).
Аффинная хроматография может использоваться в комбинации с осаждением полиэтиленгликолем, сульфатом аммония, риванолом, ионообменной хроматографией, гель-фильтрацией, ультрафильтрацией.
Иммобилизация лиганда осуществляется обычно через пространственные молекулы к инертному, нерастворимому гидрофильному поддерживателю, затем этот материал (адсорбент) используется для выделения требуемого белка. В принципе, только белки с ощутимой аффинностью для иммобилизованного лиганда будут удерживаться адсорбентом; другие могут отмываться подходящим элюентом. Специфически адсорбированные белки элюируются изменяющимся составом элюента для поддержания диссоциации протеин-лиганд (80). В противоположность ионообменной хроматографии, десорбция может достигаться различными способами: изменением ионной силы (105), изменением рН (56), замещением лиганда (131), температурной элюцией (81), электрофорезом (62) и другими способами.
Методы получения комплекса иммуноглобулинов - IgG, М, А
Концентраты иммуноглобулинов G, М, А выделяются из фракции III различными методами, такими как риванольно-солевым (145), каприлатно-спиртовым (33, 149), осаждением полиэтиленгликолем (47, 130, 170), диализом против 0,001М фосфатного буфера при рН 6,5 (165), обработкой р-пропиолактоном концентрированного раствора IgM для внутривенного введения (150, 152). Также применяются методы хроматографии: хроматография на QAE-сефадексе (140), на ДЭАЭ-целлюлозе (44), на Q Sepharose Fast Flow (49), анионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе CL-6B (150), аффинная хроматография на протамин-сефарозе (168), гель-фильтрация на U1rogel АсА34, Biogel A-5m (96). Описан способ выделения IgA осаждением сульфатом аммония, гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сефацел (104).
В работе Борисовой И.В. (8) описано получение иммуноглобулинового препарата следующим образом. Осадок Б (фракция III) экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида при рН 5,2-5,8 в течение 18 часов. Осадок отделяют центрифугированием. К солевому экстракту осадка Б добавляют хлороформ до конечной концентрации 10%, затем 5% раствор декстрансульфата до концентрации 0,1%. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Для осаждения фракции иммуноглобулинов к полученному экстракту добавляют 50% полиэтиленгликоль до конечной концентрации 5-6%). После выстаивания осадок иммуноглобулинов отделяют путем декантации и центрифугирования. Осадок промывают дистиллированной водой при рН 4,8-5,2, затем растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида и центрифугируют для удаления нерастворившихся частиц. Для удаления следов нестабильных примесей и пирогенных субстанций к раствору иммуноглобулинов добавляют фосфорнокислый кальций. Осадок отделяют центрифугированием. Полученный препарат содержал 50-60% IgG, 25-30% IgM, 15-20% IgA. Способ получения иммуноглобулина, обогащенного IgM для перорально-го применения (16) включает следующие стадии: экстракция эуглобулинов водой из осадка Б, рН 6,0; очистка иммуноглобулинов от сопутствующих белков и липопротеидов каприлатом натрия, рН 4,8; концентрирование иммуноглобулинов спиртом, рН 5,0.
Tsay G. et al. (163, 164) также описывает получение иммуноглобулиново-го препарата из фракции III, которая суспендируется в 12,5 объемах 0,05 М ацетатного буфера при рН 3,5-4,0 и перемешивается при комнатной температуре в течение 2-3 часов. К смеси добавляется 2% каприловая кислота при рН 4,8 для удаления липопротеинов и активатора прекалликреина с последующей диа- и ультрафильтрацией через РМ-30 при рН 4,8. Затем проводится стадия инактивации вирусов с 0,3% TNBR / 1% Tween-80. После этого ка-прилатный супернатант осаждается с Tris-буферной системой (1М Tris, рН 7,8) или имидазольным буфером (1М имидазол, рН 7,8). Затем следует диа- и ультрафильтрация при рН 4,0-4,8 против воды. В качестве стабилизатора используется 0,25 М глицин. Конечный препарат содержит 50-60% IgM, 30-40% IgG, 3-5% IgA.
Описан способ получения IgA-иммуноглобулинового препарата (1). Осадок Б (фракция III) экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида. Осадок отделяют центрифугированием. К полученному экстракту добавляют 50% раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 10-15%. Осадок, содержащий липопротеины и иммуноглобулины, отделяют центрифугированием и растворяют в 5-кратном объеме дистиллированной воды. Через 18 часов осадок эуглобулинов отделяют центрифугированием и удаляют. Надосадочная жидкость - готовый препарат, в который добавляют глюкозу до концентрации 2%. Полученный препарат содержал IgG -55-65%, IgA - 30-40%, IgM - 5%.
Получение химически немодифицированного препарата описано в патенте Moller W. et al. (115). В первом варианте фракция III растворяется в 0,1М ацетатном буфере в соотношении 1:5 при рН 5,0, затем обрабатывается 3% каприловой кислотой. Осадок отделяется центрифугированием. Центрифугат подвергается диализу против 20 тМ пиперазина и 20 тМ натрия хлорида при рН 6,0. Затем раствор проходит через колонку с TMAE-Fractogel, уравновешенную тем же буфером. Не связавшийся IgG собирается и концентрируется ультрафильтрацией. Фракция, обогащенная IgA, элюируется 20 тМ пиперазином и 100 тМ NaCl при рН 6,0; фракция IgM - 20 тМ пиперазином и 150 тМ NaCl при рН 6,0. Смешиванием полученных фракций получают препарат с содержанием IgG - 80%, IgA - 10%, IgM - 10%. Второй вариант предусматривает обработку фракции III как указано выше, которая затем помещается на колонку и элюируется с 20 тМ пиперазином и 160 тМ NaCl при рН 6,0. Полученный препарат содержит 50% IgG, 23% IgA, 27% IgM. В третьем варианте обработанная фракция III проходит через колонку с QMA-Accel; затем элюируется с 20 тМ пиперазином и 20 тМ NaCl при рН 4,7. Полученный препарат содержит 38% IgG, 27% IgA, 35% IgM.
Для выделения Пентаглобина (препарат иммуноглобулинов G, М, А для внутривенного введения) используют обработку фракции III октановой кислотой, трикальційфосфатом, (3-пропиолактоном.
Завершая раздел, посвященный методам выделения белков плазмы крови человека, необходимо отметить, что несмотря на большое разнообразие технологий фракционирования, остается нерешенным ряд проблем. Необходимо изучить возможность глубокой очистки препаратов иммуноглобулинов при спиртовом методе фракционирования. Принципиальным является вопрос о недостаточном использовании иммунологического потенциала плазмы крови человека. В связи с этим становится очевидна необходимость разработки комплексной технологии выделения высоко-очищенных иммуноглобулинов из плазмы крови (выделение IgG по основной схеме фракционирования, дополнительное извлечение IgG, получение комплекса иммуноглобулинов — IgG, IgA, IgM).
Распределение иммуноглобулинов по фракциям в процессе спиртового метода фракционирования плазмы крови человека
Недостатком данного способа являлась невозможность полного устранения протеолитических ферментов. Для устранения этого недостатка было целесообразно получать высокоочищенные препараты на стадии фракционирования. Процесс очистки IgG от других белков, включая протеолитические ферменты, практически завершался на стадии Б. Именно эта стадия была изучена на возможность более полного разделения белков. В литературе имеются данные о том, что максимальное удаление комплексообразующих белков, IgA, IgM, примесей протеолитических ферментов в процессе спиртового фракционирования зависит от условий проведения стадии отделения IgG от а- и Р-глобулинов (128, 138). При этом мы исходили из того, что улучшить разделение возможно за счет коррекции рН, ближе к зоне изоэлек-трической точке плазмина и увеличения концентрации осадителя, усиливая перевод этого белка в нерастворимую форму. Существовавшая технология предусматривала отделение IgG от а- и Р-глобулинов при рН 5,0-5,1 ионной силе 0,018-0,020, концентрации этанола 13%, температуре - 4С. Первоначально в лабораторных условиях было исследовано влияние рН на выход целевого продукта. Фракционирование осадков А] проводили в интервале рН от 5,2 до 5,6, при концентрации этанола 17%. Определение содержания белка в водно-спиртовых растворах очищенного IgG показало, что изменение рН в интервале от 5,2 до 5,4 не влияло на содержание белка, при увеличении рН до 5,6 его количество уменьшалось в среднем на 11%. Поэтому оптимальными условиями разделения были определены рН 5,4, концентрация этанола 17%, ионная сила 0,01. Температура в конце осаждения была снижена до -6С (допустимый предел, при котором происходит замерзание водно-спиртовой смеси). Образующийся осадок Б в дальнейшем служил сырьем для дополнительного извлечения IgG и получения комплексного иммуноглобулинового препарата, содержащего IgG, IgM, IgA. Затем центрифугат Б подвергали осветляющей фильтрации. Концентрирование IgG проводили осаждением этанолом до конечной концентрации его в растворе 26%. В дальнейшем процесс был масштабирован в производственных условиях (рис. 10).
Следует отметить, что до введения изменений на стадии отделения осадка Б проводилось двойное центрифугирование с последующей осветляющей фильтрацией для получения фильтрата IgG, соответствующего требованиям цветности и прозрачности. Введение изменений устранило необходимость в повторном центрифугировании.
Изменение параметров фракционирования на стадии отделения IgG от а-и Р-глобулинов привело к снижению нежелательных белковых примесей с (2,6+0,1)% до (1,2±0,1)%, низкомолекулярных белков - с (2,26±0,15)% до (1,9±0,3)%. В результате внесенных изменений значительно сократилось содержание иммуноглобулинов других классов: IgA - с (2,3±0,1) мг/мл до (0,82±0,05) мг/мл, т.е. в 2,8 раза; IgM - с (0,72±0,07) мг/мл до (0,34±0,03) мг/мл, в 2,1 раза. При более низких значениях рН на стадии Б обнаруживались следовые количества других белков, при более высоких значениях рН снижался выход IgG.
Следует отметить, что при применении данного метода очистки, проводимого на стадии Б в процессе спиртового фракционирования, не наблюдалось образования осадка нестабильных белков после растворения пасты ИГ в водном растворе. Данное обстоятельство, по-видимому, свидетельствует о том, что в процессе отделения IgG от Р-глобулинов при изменении условий фракционирования действительно происходит максимальное удаление нестабильных белков, которые до использования данного метода очистки выпадали в осадок в процессе растворения пасты ИГ в водных растворах с низкой ионной силой.
В препаратах иммуноглобулинов обнаруживаются следы протеиназ типа плазмина (95, 158), влияющие на стабильность препарата при хранении. В результате фрагментации IgG происходит потеря титров антител; кроме того, фрагментированные молекулы более быстро высвобождаются из организма (35). Как уже отмечалось, освобождение препаратов иммуноглобулинов от примесей протеолитических ферментов зависит от проведения стадии Б спиртового фракционирования. Анализ определения активности плазминоге-на показал отсутствие протеолитической активности в полученном препарате ИГВМ. Кроме того, нами было проведено сравнительное изучение содержания фрагментированных молекул в препаратах ИГВМ, полученных с изменением и без изменения условий фракционирования, в процессе хранения (сразу после получения и через 1 год 3 мес.) (табл. 7).
Технологические аспекты дополнительного извлечения иммуноглобулина G из осадка
Хорошая очистка достигалась при использовании 2%-ной каприловой кислоты с последующей стадией этанольно-хлороформенного осаждения и концентрирования иммуноглобулинов этанолом. Установлено, что обработка фракций плазмы каприловой кислотой является методом инактивации, специфичной для вирусов с липидной оболочкой (61, 101). Данный метод позволял получать препарат с повышенным содержанием IgM и содержанием примесей сопутствующих белков не более 1%. Количество иммуноглобулинов составило: IgG - (50-55)% , IgM - (35-40)%, IgA - (9-10)%. Содержание титров антител к Shigella flexneri составило - 1:640-1:1280, к Salmonella -1:320 - 1:640. Однако, препарат, полученный данным способом, содержал значительное количество денатурированного белка, что практически делало невозможным проведение стадий осветляющей и стерилизующей фильтрации.
Приемлемой оказалась двухступенчатая очистка: вначале обработка цен-трифугата Б] 10%-ным хлороформом, а затем осаждение примесей 4%-ным этанолом. Очищенный иммуноглобулин концентрировали 26% этанолом при рН 7,1-7,3. Полученную в результате обработки пасту растворяли в 0,06М растворе NaCl, содержащем 2% глюкозы и 3% глицина; устанавливали рН 4,0-5,0. Растворы подвергали стерилизующей фильтрации. Известно, что использование кислого значения рН является эффективным сособом инактивации вирусов с липидной оболочкой и безоболочечных вирусов (77, 117, 171). Поэтому, для повышения вирусной безопасности препараты выдерживали при кислом значении рН при комнатной температуре в течение месяца. Затем разливали во флаконы и лиофилизировали. Полученный препарат, не соответствовал требованиям Фармакопейной статьи по показателям цветности, прозрачности, растворимости. Показатели цветности превышали значение 0,1 ед. оптической плотности, прозрачности - 0,05; время растворения большинства серий лиофилизированного препарата составляло 5-15 мин.
Как указывалось выше, использование натрия хлорида в составе препаратов иммуноглобулинов может приводить к мутности раствора, агрегации, термонестабильности, потере титров антител (124). Наличие глюкозы может вызывать карамелизацию препарата при лиофильной сушке, и, следовательно, плохую растворимость. Поэтому из состава препарата был исключен натрия хлорид и глюкоза. Стабилизацию проводили с использованием только 0,ЗМ глицина, рН 4,0-5,0. В результате внесенных изменений в стабилизации готового препарата показатели цветности, прозрачности, растворимости не превышали требуемых значений по ФС.
Отработка условий выделения и стабилизации препарата позволила разработать технологическую схему получения концентрата иммуноглобулинов G, А, М для перорального применения с повышенным содержанием антибактериальных и противовирусных антител. Технология выделения заключалась в десятикратном растворении осадка Б] в 0,05 М ацетатном буферном растворе при рН 4,0-4,2, с последующим добавлением 0,05М натрия хлорида и хлороформа до 10%. Далее смесь перемешивали, хлороформ с комплексом растворенных в нем примесей липопротеидов удаляли декантацией. Затем проводили осаждение агрегированных белков 4%-ным этанолом при рН 4,9-5,0 с последующим центрифугированием и осветляющей фильтрацией раствора иммуноглобулинов. Иммуноглобулины концентрировали 26%-ным этанолом при нейтральном рН и отделяли центрифугированием.
При сохранении высокой степени очистки и оптимального соотношения классов иммуноглобулинов, для повышения стабильности изменены параметры рН препарата. Вместо предусмотренного ранее нейтрального рН (6,5-7,5), в полном соответствии с Европейской фармакопеей, кислотность препарата была установлена на уровне 4,0-5,0. Как известно, такая кислотность среды препятствует агрегации молекул. Одновременно, такой подход позво 74
лил ввести в технологический процесс дополнительную стадию вирусной инактивации (выдерживание раствора при комнатной температуре в течение 1 месяца при рН 4,0-5,0). Кроме того, кислый рН способствует лучшей адаптации иммуноглобулинов при прохождении через кислую среду желудка.
Из состава препарата был полностью исключен хлорид натрия и заменен на хорошо зарекомендовавший себя в качестве стабилизатора иммуноглобулинов - глицин. Эта замена позволила устранить повреждающее действие соли в процессе лиофильной сушки, а при растворении лиофилизированного препарата ускорить гидратацию белков.
Полученный препарат содержал (60,9±2,1)% IgG, (20,8±1,2)% IgM, (18,3±1,1)% IgA. Содержание примесей в препарате составило 1-3%. Титры антител к Shigella flexneri были в пределах - 1:640, к Salmonella -1:320-1:640, к вирусам гриппа - 1:160-1:320. Антибактериальные антитела превышали уровни в иммуноглобулине человека нормальном в 16 раз, против вирусов гриппа - в 2-4 раза.
Технология выделения комплекса иммуноглобулинов этим способом позволяет выделять 1,4 г белка сіл используемой плазмы. Учитывая процентное соотношение классов иммуноглобулинов в готовом препарате, на долю IgG приходится 0,85 г/л, что составляет 10,0% от его общего количества в плазме, содержание IgA - 0,26 г/л (16,3 %), IgM - 0,29 г/л (34,9%).
На рис. 18 показана схема получения препарата иммуноглобулина G, обогащенного IgM и IgA, различными способами. Сравнительный анализ методов получения концентрата иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA позволил выявить недостатки, как технологии, так и самого препарата и внести изменения в технологию производства, улучшающие качество препарата.
